CC BY
12
Раздел 02.00.10
Биоорганическая химия
УДК 546.22: 54.057: 577.112.34 DOI: 10.17122/bcj-2021-1-26-32
П. А. Полубояринов (к. с.-х. н., доц.), И. Я. Моисеева (д.м.н., проф.), Н. И. Микуляк (д.м.н., доц.)*
НОВЫЙ СИНТЕЗ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ АМИНОКИСЛОТ -Я-ЦИСТИНА И 3,3-ДИМЕТИЛ-Я-ЦИСТИНА
Пензенский государственный университет, кафедра «Общая и клиническая фармакология», *кафедра «Физиология человека» 440026, г. Пенза, ул. Красная, 40; тел. (950) 2304876, e-mail: poluboyarinovpavel@yandex.ru
P. A. Poluboyarinov, I. Ya. Moiseeva, N. I. Mikulyak
NEW SYNTHESIS OF SULPHUR CONTAINING AMINOACIDS - Я-CYSTINE AND 3,3-DIMETHYL-D-CYSTINE
Penza State University
40, Krasnaya Str., 440026, Penza, Russia; ph. (950) 2304876, e-mail: poluboyarinovpavel@yandex.ru
В ходе проведенных исследований разработан новый синтез изомеров серосодержащих аминокислот — Д-цистина и 3,3'-диметил-Д-цистина из Д-серина и Д-треонина, через галогенсодер-жащие аминокислоты — ^-хлор-Д-аланин и а-амино-уб-хлор-Д-масляную кислоту. Он может быть использован как удобный лабораторный синтез аминокислоты Д-цистина, 3,3'-диметил-¿-цистина или 3,3-диметил-Д-цистина, достоинством которого является простота, доступные реактивы, отсутствие необходимости использования защитных групп. Выход /З-хлор-Д-алани-на, (аК, Д5)-а-амино-в-хлормасляной кислоты составляет не менее 50%, Д-цистина 79 %, а 3,3-диметил-Д-цистина не менее 55%.
Ключевые слова: аминокислоты; а-амино-Д-хлор-Д-масляная кислота; 3,3'-диметил-Д-цис-тин, в-хлор-Д-аланин; Д-серин; синтез; Д-трео-нин; Д-цистин.
Аминокислоты ¿-цистеин и ¿-цистин являются эссенциальными а-аминокислотами разнообразных живых организмов 1-3. ¿-Цис-теин/Х-цистин поддерживают целостность клеточных систем путем регулирования их окислительно-восстановительных процессов и детоксикации вредных соединений, включая свободные радикалы и активный кислород 1'2. ¿-Цистин ((К,К)-3,3'-дитиобис-2-аминопропи-оновая кислота) входит в состав белков и пептидов и образуется при окислении содержащихся остатков цистеина ((К)-2-амино-3-мер-каптопропионовая кислота).
Производные цистеина, например, К-аце-тил-Ь-цистеин, широко используются для ле-
Дата поступления 23.11.20
A new method of sulphur containing amino acids isomers — D-cystine and 3,3'-dimethyl-D-cystine from D-serine and D-threonine via halogen containing amino acids — ¿8-chloro-D-alanine and a-amino-^-chloro-D-butyric acid — is developed. The method may be utilized as a convenient laboratory process for D-cystine, 3,3'-dimethyl-D-cystine or 3,3-dimethyl-cystine production, the benefits of which include simplicity, reagents availability and no need of protective groups supplementation. Yield of ¿8-chloro-D-alanine (aR, ¿6S)-a-amino-j8-chlorobutyric acid exceeds 50%, that of D-cystine - 79%, and of 3,3-dimethyl-D-cystine — not less than 55%.
Key words: D-alanine; a-amino-^-chloro-D-butyric acid; amino acids; ¿8-chloro-D-serine; D-cystine; 3,3'-dimethyl-D-cystine; synthesis; D-threonine.
чения хронических заболеваний, связанных с обструкцией дыхательных путей и хронических бронхитов 3'4. К,К-Дизамещенные гидра-зиды цистеина обладают цитостатической активностью и могут быть использованы в качестве противоопухолевых препаратов 5.
Высокая биологическая активность метилированных производных цистеина также известна. Так, метиллантионин (2R-S-[(2S,3S)-3-мети-лаланин-3ил]цистеин) — нестандартная серосодержащая аминокислота, является компонентом пептидных антибиотиков субтилина 6'7 и низина 8, а также присутствует в дрожжах (Saccharomyces cerevisiae) 9. Эта же аминокислота обнаружена в составе пептидного ингибитора ангиотензинп-ревращающего фермента — анковенина.
Фрагментом метиллантионина является остаток трео-3-метил-О-цистеина ((25,3Б)-2-амино-3-меркаптобутановая кислота), окисленной формой которого 3,3'-диметил-О-цистин 10.
Таким образом, важной задачей органического синтеза является поиск новых способов получения энантиомеров цистеина и его производных.
В первом синтезе ¿-цистина Фишером в качестве исходного вещества был использован ¿-серин 11.
Дю Виньо разработал метод синтеза 0,Ь-цистина на основе натрийфталимидомалоного эфира (1) и бензилтиометилхлорида (2) 12 (схема 1).
Необходимый для этого синтеза бензил-тиометилхлорид получают из бензилмеркапта-на. Гидролизом Б-бензилтиометилфталимидо-малоновый эфира (3) был получен Б-бензил-О^-цистеин (4), а бензильная группа отщеплялась металлическим натрием в жидком аммиаке с образованием О,¿-цистеина. Окислением 0,Ь-цистеина кислородом воздуха был получен О^-цистин (5).
В другом синтезе 13 О^-цистин синтезирован из метилового эфира О^-серина гидрохлорида (6) с РС15 в хлороформе с получением интермедиата — /в-хлор-О^-аланина гидрохлорида (7) и бензилмеркаптана (8) полученного с помощью реакции бензилхлорида магния с элементной серой (схема 2).
При гидролизе продукта реакции был получен О^-бензилцистин (4). Бензильная группа отщеплялась металлическим натрием в жидком аммиаке. Окислением О,¿-цистеина кислородом воздуха был получен О^-цистин (5).
Синтез метиллированного производного О-цистина — 3,3'-диметил-О-цистина и трео-3-метил-О-цистеина ( ( 2 Б, 3 Б)-2-амино-3-меркапто-бутановая кислота) из треонина описан в 10-14.
В синтезе из О-треонина (9) 14 использовали тиобензойную кислоту для синтеза 3,3'-диметил-О-цистина. Из метилового эфира М-тритил-О-треонина (10) было получено производное азиридина — метиловый эфир (2Я ,3Я )-1-тритил-3-метил-2-азиридинкарбоно-вой кислоты (11), затем метиловый эфир (2Я ,3Я )-1-бензилоксикарбонил-3-метил-2-ази-ридинкарбоновой кислоты (12), а продуктом его реакции с тиобензойной кислотой в присутствии БР3 был Б-бензоил-М-бензилокси-карбонил-трео-3-метил-О-цистеина метиловый эфир (13) и сопутствующее М-бензилокси-карбонил-О-тиобензоил-О-треонина (14) как побочный продукт. Образование Б-ацил и О-ацил производных объясняется существованием возможного равновесия в тиобензойной кислоте: С6Н5С05НоС6Н5С50И, хотя более высо-
О 5
Схема 1. Синтез 0,Ь-цистина на основе натрийфталимидомалового эфира
OCH
>
HO
H2N
Cl
OH
H,N
H2N
1) PC5
2) HCl
HO
NH,
Cl
HS
Cl
NaOH
H 2n
Cl
O
4
1) Na + NHM zTO 1
O OH
OH
H2N
О H
»NH2
НО^ ^O
CxeMa 2. Синтез О^-Цистим нa основе ß-xлop-D,L-aлaнннa и бeнзнлмepкaнтaнa
кая реакционность последней приводила к преимущественно к генерации S-ацилов — целевого продукта. Бензильная группа была удалена с помощью метиламина в метаноле и NjN'-бисбен-зоилоксикарбонил-3,3'-диметил-0-цистина метиловый эфир (15) был окислен и гидролизован с образованием дисульфида аминокислоты — 3,3'-диметил-0-цистина (16) (схема 3).
Данный синтез может быть использован для синтеза аминокислот D-цистеина и D-цис-тина, которые являются коммерчески дорогими препаратами.
В целом, известные синтезы требуют на последних стадиях использования жидкого аммиака, металлического натрия и низкой температуры (—78 oC), или наличия защитных групп, что также усложняет синтез.
Материалы и методы исследования
Хроматографические тесты проводили на пластинах «Sorbfil» (ООО «ИМИД») методом восходящей ТСХ. После элюирования в системе растворителей изопропиловый спирт — 25% аммиак (7 : 3) и высушивания пластины пятна D-цистина и 3,3/-диметил-D-цистина обнаруживали опрыскиванием 0.5% раствором нин-гидрина в изопропиловом спирте.
Анализ чистоты D-цистина и 3,3'-диме-тил^-цистина проводили методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель
105М» фирмы «Люмекс» (Россия) без дерива-тизации в боратном буфере по собственному поглощению аминогрупп (детектирование при длине волны 190 нм) 15.
Спектры ЯМР 1Н записаны на спектрометре Varian 400, с рабочими частотами 400 МГц.
Элементный анализ выполняли на приборе «vario El cube» (Elementar Analysensysteme, Германия).
Углы вращения измеряли на поляриметре СМ-3 (Россия).
Результаты и их обсуждение
Наиболее простым и перспективным способом получения изомеров и метилированых производных цистеина/цистина является синтез из D и L-изомеров серина и треонина и элементной серы — доступных исходных веществ. Наибольший интерес представляет синтез D-изомеров аминокислот, так как L-изоме-ры цистина доступны из природного сырья.
Необходимым этапом синтеза, является получение хлорпроизводных D-серина (17) и D-треонина (9): ^-хлор^-аланина и (aR, ¡3S)-а-амино-^-хлормасляной кислоты, по результатам которого был получен патенты 16'17. Его достоинством является отсутствие защитных групп у аминокислот, использование недорогого и доступного реактива — тионилхлорида, а в качестве растворителя — диоксана (схема 4).
O
O
б
7
S
+
8
S
5
O
оеиз сн
ыг о 13
1) сн3ын2/сн3он
2) 12
о осн3 ^^ Н3з
.мн2
н2ы
н3с О хо 15
о осн3
»ын2
6М нс1
»ын2
н3сО
н2ыт
15
н о о
Trt = (с6н5)3с, г=с6н5сн2осо
Схема 3. Синтез 3,3'-диметил-О-цистина из О-треонина
он
5 он
+нс1
н2ы*
о 17
ОН
5 он
н3Ы
с1
+ эос
с1 н2с+
+ ^он
н3 N
с!
н3М^
о
17а
с!
он
оо
с! +
- во
э он
н3о он
н2ы»
н3^ с! ч +
+ нс!
он
о 18
н3р. он
с!
о
с!
рН.. .5,5
LiCH / ацетон
он
н2ы
Н3^
£ он
о 9а
о 18а
с!-
+ эос2
н3с о
+
н3Ы¥
- во.
он
о
нс+
£ .он
н3ы*
с!
н3с с!
Н3Ы
.§ он
о 19
с!
н 3с с!
рН 5.5
LiOH / ацетон
н2ыТ°
в он
19а
Схема 4. Синтез в-хлор-О-аланина и (аЯ, Д^-а-амино-в-хлормасляной кислоты из О-серина и О-треонина
3
в
н2ыч
+
н3 N
в
о
о
о
19а
—I----------!----------1"--------------------1----------Ь"
----------
9 -]-
■■ ] !—~——1—
\Jil1
Рис. 1. Электрофореграмма (аЯ, Д5)-а-амино-^-хлормасляной кислоты 18
При действии тионилхлорида на О-се-рин/О-треонин реакция идет по механизму, и в-хлор-О-аланин (6) / (аЯ, в5)-а-амино-в-хлормасляная кислота (18) получаются в индивидуальном состоянии, в виде гидрохлорида, поскольку другие продукты реакции газообразны.
Образовывающийся осадок гидрохлорида в-хлор-О-аланин и (аЯ, вБ)-а-амино-в-хлор-масляной кислоты 10с затем переосаждали путем добавления насыщенного раствора гидро-ксида лития до рН 5.5 и осаждением ацетоном с получением индивидуальных веществ — в-хлор-О-аланина и (аИ, в$)-а-амино-в-хлормасляной кислоты 10а. Выход в-хлор-О-аланина, (аЯ, вБ)-а-амино-в-хлормасляной кислоты составляет не менее 50%. Анализ методом капиллярного электрофореза (КЭФ) показал чистоту не менее 95 %. Угол вращения плоскости поляризации (аИ, в$)-а-амино-в-хлормасляной кислоты составляет: [а]20О = —19±3о, с = 1.
Для получения водного раствора дисульфида натрия (Ка2Б2) элементную серу восстанавливали борогидридом натрия при комнатной температуре. Лучшим растворителем, который не приводит к быстрому разложению боргидирида натрия и больше подходит для синтезов органических соединений с элементной серой, является этиловый спирт.
В нашем синтезе был использован спирт-ректификат и НОН для связывания избытка выделяющегося сероводорода. Для соблюдения стехиометрии реакции на первом этапе был получен гидросульфид натрия (КаНБ), после прекращения газообразования добавлением эквивалентного количества элементной серы получили дисульфид натрия (Ка2Б2) (схема 5).
4МаВИ4 + 28+7Н20 -»^аН8 + Ма2а407+14Н2
N826407+ 2ЫаНБ+ 28 + 5Н20 -2Ыа2Б2+ 4Н3ВО3
-С!
ОН
^^ 8'
2Н^
ОН
N а282/ 1^82 - 2NaCl
^0
0
18а
20
НзС
НзС^ -С! 0^ 0Н
^ ^ ^^ 8
Na282/ 1_282 - 2NaCl
0
19 а
^0
_____8
н2^ ^г Н 0' ^0
21
Н 3С
Схема 5. Синтез О-цистина и 3,3'-диметил-О-цисти-на из в-хлор-О-аланина и а-амино-в-хлор-О-масля-ной кислоты.
Для получения О-цистина/3,3'-диметил-О-цистина раствор в-хлор-О-аланина (19)/а-амино-в-хлор-Э-масляной кислоты (20) доводили до рН 9.0 насыщенным раствором ЫОН, а затем добавляли в раствор дисульфида натрия и перемешивали в течение 12—14 ч. Раствор подкисляли до рН 2.0, фильтровали для удаления остатков элементной серы, затем подщелачивали до рН 8.0 и барботировали воздухом в течение нескольких часов для окисления цистеина до цистина и удаления остатков сероводорода. Снова подкисляли до рН 2.0 и доводили до рН 5.03 — изоэлектрической точки О-цистина. Выпавшие белые кристаллы цистина отфильтровывали и промывали охлажденной дистиллированной водой. Выход О-цистина составляет не менее 79%, с чистотой не менее 98% (ТСХ). В отличие от О-цистина,
к
NH
2
к
осаждение которого из реакционной среды достигалось изменением рН, 3,3'-диметил-О-цис-тин оказался гораздо лучше растворим в воде. Для его выделения и очистки рН раствора доводили до рН 2.0 соляной кислотой, полученный раствор пропускали через хроматографи-ческую колонку с катионитом КУ-2-8 в H+-форме и конечный продукт элюировали раствором аммиака. Раствор концертировали в вакууме и доводили до рН 6.2 раствором НС1. Осаждение аминокислоты из охлажденного раствора проводили избытком метанола (1:7) с добавлением 1—2 % диэтилового эфира для снижения растворимости аминокислоты. Осадок промывали охлажденной смесью метанола и диэтилового эфира и высушивали в эксикаторе над молекулярными ситами 4А. Выход
Литература
1. Бартон Д., Оллис У. Д. Общая органическая химия.- М.: Химия, 1986.- Т.10.- 704 с.
2. Северин Е.С. Биохимия.- М.: ГЭОТАР-Ме-диа, 2006.- 784 с.
3. Mereto G.C., Balestra L., Henriquet F. Alveolar surfactant in lungs of operated patients after acetylcysteine treatment // Eur. J. Respir. Dis.-1980.- V.61.- Pp.160-161.
4. Boman G., Backer U., Larsson S., Melander B., Wahlander L. Oral acetylcysteine reduces exacerbation rate in chronic bronchitis: report of a trial organized by the Swedish Society for Pulmonary Diseases // Eur. J. Respir Dis.-1983.- V.64.- №6.- Pp.405-415.
5. А.с. №983125 СССР. Ы,Ы-дизамещенные гид-разиды цистина, обладающие противоопухолевой активностью / Алексиев Б.В., Стоев С.Б., Спасов А.В., Манева Л.С., Емануилов Е.А., Го-ловински Е.В // Б.И.- 1982.- №47.
6. Alderton G.A. New Sulfur-containing Amino Acid from Subtilin // J. Am. ^em. Soc.-1953.- V.75.- Pp.2391-2392.
7. Gross E., Kiltz H.H., Nebelin E. Die Struktur des Subtilins // Hoppe Seylers Z Physiol Chem.- 1973.- V.354.- Pp.810-812.
8. Gross E. Morell J.L. Structure of nisin // J. Am.Chem. Soc.- 1971.- V.93.- Pp.4634-4635.
9. Downey P.F., Black S. A new naturally occurring isomer of ¿8-methyllanthionine // J. Biol. Chem.- 1957.- V.228.- Pp.171-179.
10. Kido Y., Hamakado T., Yoshida T., Anno M., Motoki Y., Wakamiya T., Shiba T. Isolation and characterization of ancovenin, a new inhibitor of angiotensin I converting enzyme, produced by actinomycetes // J. Antibiot.- 1983.- V.36.-Pp.1295-1299.
11. Fischer E., Раске К. Verwandlung des /-serin in rf-alanin // Chеm. Bеr.- 1907.- V.40.-Pp.3717-3724.
12. Loring H.S., Vigneaud V.D. The isolation of two isomeric inactive cysteines // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1931.- V.29.- Pp.41-42.
3,3-диметил-О-цистина составляет не менее 55%, чистотой не менее 95% (ТСХ).
Спектр !Н-ЯМР (5, м. д.) СН31.31. (3Н, д., J 8 Гц, СН), 3.58-3.64 (1Н м, CH (СН-NH3+)), 4.06. (1Н, д, J 7.25 Гц). Элементный анализ: найдено, %: С 35.32; Н 6.18; N 10.10; S 23.70 % C8H16N2O4S2; вычислено, %: C 35.8%; H 6.0%; N 10.4%; S 23.9%. Угол вращения плоскости поляризации (aR, Д5)-а-амино-^-хлормасляной кислоты составляет [a]20D = - 414±3о.
Новый способ получения энантиомеров цистеина и его производных может быть использован удобный лабораторный синтез как аминокислоты D-цистина, доступной коммерчески, так и 3,3'-диметил-Ь-цистина и 3,3-ди-метил-О-цистина.
References
1. Barton D., Ollis U.D. Obschaya organicheskaya khimiya [General organic chemistry]. Moscow, Khimiya Publ., 1986, vol.10, 704 p.
2. Severin E.S. Biokhimiya [Biochemistry]. Moscow, GEOTAR-Media Publ., 2006, 784 p.
3. Mereto G.C., Balestra L., Henriquet F. [Alveolar surfactant in lungs of operated patients after acetylcysteine treatment]. Eur. J. Respir. Dis., 1980, vol.61. pp.160-161.
4. Boman G., Backer U., Larsson S., Melander B., Wahlander L. [Oral acetylcysteine reduces exacerbation rate in chronic bronchitis: report of a trial organized by the Swedish society for pulmonary diseases]. Eur. J. Respir. Dis., 1983, vol.64, no.6, pp.405-415.
5. Aleksiev B.V., Stoev S.B., Spasov A.V., Maneva L.S., Emanuilov E.A., Golovinski E.V. N,N-dizameshchennye gidrazidy tsistina, ob/adayu-shchie protivoopukho/evoy aktivnost'yu [N,N-disubstituted cystine hydrazides with antitumor activity]. Certificate of authorship USSR no.983125, 1982.
6. Alderton G.A. [New Sulfur-containing Amino Acid from Subtilin]. J. Am. Chem. Soc., 1953, vol.75, pp.2391-2392.
7. Gross E., Kiltz H.H., Nebelin E. [Die struktur des subtilins]. Hoppe Sey/ers Z Physio/ Chem., 1973, vol.354, pp.810-812.
8. Gross E. Morell J.L. [Structure of nisin]. J. Am.Chem. Soc., 1971, vol.93, pp.4634-4635.
9. Downey P.F., Black S. [A new naturally occurring isomer of ¿8-methyllanthionine]. J. Bio/. Chem., 1957. vol.228, pp.171-179.
10. Kido Y., Hamakado T., Yoshida T., Anno M., Motoki Y., Wakamiya T., Shiba T. [Isolation and characterization of ancovenin, a new inhibitor of angiotensin I converting enzyme, produced by actinomycetes]. J. Antibiot., 1983, vol.36, pp.1295-1299.
11. Fischer E., Раске К. [Verwandlung des /-serin in rf-alanin]. Chem. Ber., 1907, vol.40, pp.37173724.
13. Wood J.L., Middlesworth V.L. Preparation of 12. cystine from radioactive sulfur // J. Biol Chem.- 1949.- V.179, №2.- Pp.529-533.
14. Wakamiya T., Shimbo K., Shiba T., Nakajima 13. K., Neya M., Okawa K. Synthesis of threo-3-methylcysteine from threonine // Chem. Soc. Jap.- 1982.- V.55, №12.- Pp.3878-3881. 14.
15. M-04-38-2009. Методика определение протеино-генных аминокислот в кормах и сырье.- СПб.: ООО «Люмэкс-маркетинг», 2014.- 49 с.
16. Пат. № 2633542 РФ. Способ получения биоло- 15. гически активного вещества в-хлор^-аланина / Полубояринов П.А. // Б.И.- 2017.- №29.
17. Пат. № 2669771 РФ. 3,3-диселено-бис-2-амино-масляная кислота и способ ее получения / По-лубояринов П.А. // Б.И.- 2018.- №29. 16.
17.
Loring H.S., Vigneaud V.D. [The isolation of two isomeric inactive cysteines]. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1931, vol.29, pp.41-42. Wood J.L., Middlesworth V.L. [Preparation of cystine from radioactive sulfur]. J. Biol Chem. , 1949, vol.179, no.2, pp.529-533.
Wakamiya T., Shimbo K., Shiba T., Nakajima K., Neya M., Okawa K. [Synthesis of threo-3-methylcysteine from threonine]. Chem. Soc. Jap., 1982. vol.55, no.12, pp.3878-3881.
Metodika opredeleniya proteinogennykh aminokislot v kormakh i syr'e [Method for determination of proteinogenic amino acids in feed and raw materials]. St. Petersburg, Lumex Marketing Publ., 2014, 49 p.
Poluboyarinov P.A. Sposob polucheniya biologicheski aktivnogo veshchestva /3--khlor-L-alanina [Method of obtaining biologically active substance ¿6--chloro-L-alanine]. Patent RF no.2633542, 2017.
Poluboyarinov P. A. 3,3-diseleno-bis-2-amino-maslyanaya kislota i sposob ee polucheniya [3,3-diseleno-bis-2-aminobutyric acid and method for its preparation]. Patent RF no.2669771, 2018.
