CC BY
3
УДК 579.6; 543.95 001:10.24412/2071-6176-2024-3-64-78
НОВЫЙ ПОДХОД К ИНКАПСУЛЯЦИИ ДРОЖЖЕЙ: БИОГИБРИДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕВОГО ГИДРОГЕЛЯ И МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ
Е.С. Филиппова
Впервые дрожжевые микроорганизмы инкапсулированы в гидрогель на основе полиэтиленгликолята титана (ПЭГ-Ti) с применением золь-гель технологий. С использованием КР-спектроскопии и термогравиметрического анализа показано преобладание органических компонентов над неорганическими в гидрогелях на основе ПЭГ-Т1, что обеспечивает комфортное окружение микроорганизмам. Морфология биогибридного материала соответствует целевой структуре «клетка в оболочке пленочного типа», однако выживаемость дрожжей составила 50 %. Синтезированные матрицы из полиэтиленгликолята титана могут быть перспективны для иммобилизации ферментов и ферментных систем.
Ключевые слова: инкапсуляция целых клеток, метилотрофные дрожжи, биосовместимые полиолаты, полиэтиленгликолят титана, золь-гель технологии.
Инкапсулированные микроорганизмы и ферменты занимают ключевую позицию в области биотехнологий. Инкапсуляция представляет собой метод иммобилизации, при котором создается биогибридныей материал типа «клетка в оболочке» [1]. Формирование матрицы вокруг целевого биообъекта (клеток, ферментов, биомолекул) способствует его защите и стабилизации, что позволяет обеспечить устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды [2].
В биотехнологии инкапкапсулированные микроорганизмы используют для улучшения результативности брожения, ферментации и синтеза биологически активных соединений [3]. В экологических исследованиях их используют для очистки сточных вод от поллютантов [4]. Инкапсуляция позволяет сохранить ценный биоматериал, способствует многократному использованию биокатализатора и упрощает отделение ферментационных продуктоы от культуральной жидкости.
Важным аспектом инкапсуляции является выбор матрицы для комфортного окружения живых клеток. Для этих целей традиционно используют органические матрицы на основе альгината кальция, полисахаридов (например, карагиннан, хитозан, пектин, агар-агар и агароза), желатина и полиэиленгликоля [5]. Ключевыми достоинствами подобных капсул являются их биосовместимость и инертность по отношению к биоматериалу. В природе микроорганизмы, как правило находятся на поверхности неорганических материалов. Некоторые из них, такие как диатомовые водоросли, эволюционно развили способность образовывать экзоскелет из кремнезема на своей поверхности. Этот защитный слой
обладает высокой механической прочностью, химической инертностью и стойкостью к термическим изменениям, а также не препятствует эффективному обмену питательных веществ и удалению продуктов метаболизма [6].
В последние десять лет наблюдается активное развитие концепции, основанной на имитации природных идей, известной как биомиметика. Изделия, созданные с применением таких методов, обладают выраженной ориентацией, высокой степенью структурного упорядочивания и выдающейся механической прочностью [7]. Органо-неорганические матрицы позволяют приблизится к природной задумке за счет формирования жеского неорганического каркаса. Органическая составляющая снижает давление на клетки, тем самым предотвращая их гибель.
Перспективными матрицами для инкапсуляции микроорганизмов являются органо-неорганические гидрогели на основе оксидов кремния или ОРМОСИЛы [8]. Инкапсулирование с использованием кремнеземной матрицы улучшает термическую стабильность, позволяет использовать биоматериал повторно, контролировать размер и пористость [9]. Соединения кремния в таких составах можно заменить на соединения титана. Материалы, основанные на диоксиде титана, демонстрируют устойчивость к колебаниям pH [10], высокую термическую стабильность и лучшую механическую прочность [11] по сравнению с кремнеземом. Эти материалы могут быть получены при мягких условиях синтеза из различных прекурсоров титана, включая методы, соответствующие принципам экологически безопасного синтеза [12].
Наиболее часто такие матрицы получают с использованием золь-гель технологий. Они основаны на гидролизе алкоксильных соединений (прекурсоров) до неорганической нанофазы, которая может образовывать мембрану самостоятельно или в композиции с другими органическими полимерами [13]. Материалы, полученные таким способом, относят к мезопористым. Они имеют большой биотехнологический потенциал благодаря своей биосовместимости и универсальности. За счет развитой площади поверхности и взаимосвязи пор между собой в такие системы можно иммобилизовать молекулы и контролировать их доставку. Модификации мезопористого материала с добавлением различных химических веществ делают его особенно подходящим для производства биоактивных покрытий. Функционализированные тонкие пленки мезопористого диоксида кремния и диоксида титана можно использовать в качестве каркасов с такими разнообразными свойствами, как стимулирование роста клеток, ингибирование образования биопленок или разработка сенсоров на основе иммобилизованных ферментов [14].
В исследованиях [15, 16] описана инкапсуляция метилотрофных дрожжей Ogataea ро!утогрка ВКМ Y-2559 в органосиликатные матрицы созданные на основе коммерчески доступных алкоксисиликатных
прекурсоров, таких как тетраэтоксисилан (ТЭОС) и метилтриэтоксисилан (МТЭС), а также полимеров, включая полиэтиленгликоль и поливиниловый спирт. С использованием метода сканирующей электронной микроскопии установлено, что структура, сформировавшаяся вокруг дрожжевой клетки, состоит из частиц золя размером 1-5 мкм с размером пор 10 нм [15]. Данная оболочка обеспечивает возможность поступления питательных веществ к клетке и удаления продуктов разложения в внешнюю среду. Она также защищает клетки от ультрафиолетового излучения и от токсичного воздействия ионов тяжелых металлов [17]. Однако выделение этанола в реакциях гидролиза и поликонденсации прекурсоров существенно ограничивает круг используемых живых объектов.
В отличие от алкоксильных прекурсоров, в результате гидролиза и поликонденсации полиолатных предшественников (производные многоатомных спиртов) не выделяются токсичные низкомолекулярные спирты, ингибирующие активность биомакромолекул и живых клеток. Использование таких соединений потенциально позволит инкапсулировать в матрицу различные виды живых объектов. Помимо этого, в среду в процессе гидролиза прекурсора выделяется полиэтиленгликоль, снижающий жесткость матрицы и сокращающий количество клеток, подвергнувшихся лизису. Ранее полиолатные предшественники были использованы для получения гидрогелей медицинского назначения [18-20], но для инкапсуляции их потенциал практически не изучен. Лаврова с колл. [8] в процессе одностадийного синтеза золь-геля при pH 7,6 разработали биогибридные материалы, которые представляют собой «клетку в органосиликатной оболочке». Эти материалы основаны на инкапсулированных дрожжах Ogataea ро!утогрИа ВКМ Y-2559 в матрице из полиэтиленгликолята кремния. Согласно исследованиям, подобные материалы могут оказаться многообещающими для применения в качестве биочувствительных поверхностей, предназначенных для мониторинга и очистки сточных вод.
Диоксид титана привлекает большое внимание как основа инкапсуляции благодаря своей устойчивости к химическим воздействиям, высокой биологической инертности, низкой токсичности и разумной цене. ТЮ2 является перспективным материалом для экологического фотокатализа, а также для преобразования солнечной энергии в электрическую в солнечных панелях [21]. Кроме того, он находит применение в оптических и защитных покрытиях, электрохимических устройствах и в роли анионо-и катионообменника, функционирующего при различных уровнях pH, включая как щелочные, так и кислые среды [22]. Дополнительное преимущество использования диоксида титана как среды для захвата белковых молекул является его способность избирательно адсорбировать фосфороганические соединения, такие как нукеотиды [23], фосфолипиды [24]. Диоксид титана стал наиболее успешным материалом в медицине и
биомедицинской инженерии за счет остеоинтеграции [25-28]. На основе полиэтиленгликолята титана создан биоактивный гель «Тизол» для лечения заболеваний кожи, мягких тканей и слизистых оболочек [29]. Исследования с использованием гидрогеля полиэтиленгликолята титана в качестве инкапсулирующего агента для биообъектов не проводились.
Целью работы является получение и характеристика биогибридного материала на основе полиэтиленгликолята титана и метилотрофных дрожжей Ogataeapolymorpha ВКМ Y-2559.
Материалы и методы исследования
Культивирование микроорганизмов. Дрожжи Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 выращивали в шейкер-инкубаторах на дрожжевой питательной среде при 28 °С и аэрации скоростью 190 об/мин. Полученную биомассу индуцировали метанолом в бесфосфатной питательной среде, затем центрифугировали, промывали фосфатным буферным раствором с рН 7,6. Хранили в микропробирках при температуре +4 °С. Подробная методика культивирования и индукции дрожжей, а также отделение биомассы от культуральной жидкости описаны в статье [30].
Получение биогибридного материала на основе полиэтиленгликолята титана и дрожжей O. polymorpha. Полиэтилен-гликолят титана, используемый в этой работе, был синтезирован согласно методике, описаной ранее [18]. Для получения биогибридного материала смешивали 0,125 см3 суспензии дрожжевых клеток (1,3±0,1-109 КОЕ/мл), 0,25 см3 полиэтиленгликолята титана в 10-мольном избытке ПЭГ-400 (ПЭГ-Ti, ИОС УрО РАН, Екатеринбург), перемешивали 5 минут (Ika Vortex 2, Германия). Затем вносили 0,012 см3 катализатора NaF (0,02 моль/дм3) и перемешивали 15 минут. Для формирования гидрогеля полученную смесь оставляли на сутки при температуре +4 °С в отсутствии света.
Сканирующая электронная микроскопия. На алюминиевый столик для сканирующей микроскопии помещали полоску углеродного скотча, на которую наклеивали кусочки алюминиевой фольги. На фольгу наносили образцы гидрогеля с и фиксировали их с использованием специальных агентов: глутарового альдегида и тетраоксида осмия. Затем образцы обезвоживали в парах пропиленоксида и доосушивали в аппарате лиофильной сушки в течение 12 часов. Подробно методика пробоподго-товки описана в работе [31]. Обезвоженные образцы покрывали золотом (Fine Coat Ion Sputter JFC-1100, Япония). Исследование образцов осуществляли с применением сканирующего электронного микроскопа JSM-6510 LV(«JEOL», Япония). Анализ проводили в условиях низкого вакуума (30 Па) с регистрацией обратно отраженных электронов (BSE).
Флуоресцентная микроскопия. Живые и мертвые клетки выявляли с помощью набора для определения жизнеспособности LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Probes). 1 мкл соответствующего красителя из набора добавляли к 0,5 мл микробной суспензии. Кубики гелей объемом примерно 50 мкл аккуратно вносили в 0,5 мл HEPES и добавляли по 1 мкл красителей. После образцы подвергали инкубации в течение 15 мин при 28 °С, а затем исследовали методом флуоресцентной микроскопии на приборе AXIO Imager A1 (Zeiss, Германия) с набором фильтров 56HE (Zeiss) при длине волны 490 нм (возбуждение) и 512 нм +630 нм (эмиссия). Для получения изображений использовалась камера Axiocam 506 (Zeiss).
Спектральные методы анализа. Инфракрасные спектры регистрировали с использованием ИК-Фурье-спектрометра ИнфраЛЮМ ФТ-08 («Люмэкс», Россия) в диапазоне волновых чисел 400-4000 см-1, с разрешением 4 см-1. Рамановские спектры регистрировали на приборе «Рамановский микроскоп М532» («ИнСпектр», Россия) при увеличении 100х с лазером 532 нм в диапазоне длин волн 300-4000 см-1. Время накопления 10 секунд, число спектров усреденения 2000.
Термогравиметрический анализ. Перед проведением анализа гидрогель высушивали при 40 °С до постоянной массы. Затем помещали его на термовесы TG 209 F1 (NETZSCH, Германия). Программа обработки состояла из 4 этапов. На первом этапе образец термостатировали при 60 °С в течение 20 минут. Второй этап включал нагрев образца с темпом 10 °С/мин до 320 °С, с последующим удерживанием этой температуры на протяжении 10 минут. Третий этап заключался в повышении температуры со скоростью 10 °С/мин до 390 °С и поддержании этого значения также в течение 10 минут. На завершающем, четвертом этапе, образец нагревали до 600 °С.
Формирование рабочего биорецепторного элемента. На
поверхность кислородного электрода Кларка наносили 0,05 см3 биогибридного материала на основе полиэтиленгликолята титана и дрожжей, и закрывали диализной мембраной.
Определение дыхательной активности инкапсулированных в матрицу из полиэтиленгликолята титана дрожжей с применением биосенсорных технологий. Анализатор растворенного кислорода «Эксперт-009» функционирует в режиме «термооксиметр», выполняя роль передающего устройства для постоянного мониторинга сигналов. Управление этим прибором происходит через интегрированное приложение «Экотест-ВА». Основной измеряемый параметр - пик скорости изменения концентрации растворенного кислорода после внесения субстрата (метанола). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения SigmaPlot.
Результаты и их обсуждение
Процесс гидролиза и последующей гидролитической конденсации полиоловых эфиров титана может быть осложнен образованием нестабильных гидрогелей, подверженных синерезису (синерезис — это явление уменьшения объема геля, во время которого выделяется жидкость), или осаждением диоксида титана. Было установлено [18], что полиэтиленгликолят титана с избытком 10 моль ПЭГ-400 приводит к гистерезисно-стабильному гидрогелю, который и был использован в данной работе. Схема золь-гель синтеза полиэтиленгликолятов титана представлена на рис. 1.
R\
о }
о—Ti-
R
/
/
R
о
о
R
H2O
R\
о }
о—Ti-
R
/
NaF
гидролиз
/ R
о
о
R
R
поликонденсация
RR / \ оо
\ ^OV /
Ti Ti
о
\ / оо / \ RR
о
R
Возможные продукты реакции поликонденсации
он но
HO-/i V°H / ^ \
но
он
но.
но
он / ^о'
R
он но
но-
но
F
-TL
/ ^о1
R /
но
о
Ч /он
он
Л
он
R
R
\
о
R \
но о Л / но Ti
H / ^
Ti—O
I
он
он
он
но
но
\ />
/Ti
х ч /
O—R
о
I /
ч/
Ti /
R—о
-Ti-1
он
о
R= -[СН2СН2о]8СН2СН2-
Рис. 1. Стадии золь-гель процесса для полиэтиленгликолята титана
и возможные продукты реакции
При растворении полиэтиленгликолята титана в воде происходит стремительный обратимый процесс его гидролиза, в ходе которого появляются группы Ti-OH и Ti-OROH. Возрастание содержания полиэтиленгликоля в смеси сдвигает равновесие этого процесса в сторону образования исходного вещества. После чего, в ходе процесса поликонденсации возникают связи Ti-O-Ti. Это приводит к увеличению вязкости раствора и к образованию полимерной структуры геля [18]. Процессы гидролиза и поликонденсации могут приводить к образованию
неорганического геля или осадка. Полиэтиленгликоль выполняет роль стабилизатора, предотвращая это. Для таких систем установлено [32], что лимитирующая стадия - поликонденсация. Образующиеся гели считаются полимерными [33], так как их формирование не проходит через стадию образования классического золя и его последующую коагуляцию. Происходит неполный гидролиз прекурсора, что сопровождается сохранением полиэтиленгликолиевых остатков у атома титана.
Спектральные методы исследования гидрогеля на основе полиэтиленгликолята титана. Использование колебательной спектроскопии (рис. 2) позволяет идентифицировать появление новых полос поглощения в системе после золь-гель синтеза, что косвенно доказывает механизм формирования гидрогеля.
# ИК-спектр ТЮ2 ИК-спсктр ПЭГ-Т? ИК-спектр гидрогеля ПЭГ-П # КР-снектр гидрогеля ПЭГ-П
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Рис. 2. Колебательные спектры исходного ПЭГ-Т1, гидрогеля на его
основе и диоксида титана
ИК-спектр исходного соединения ПЭГ-Т1 характеризуется следующими полосами, у/см-1: 3338 (ОН); 2870 (С-Н); 1110 (С-О-С); 951, 1110 (^Ю-С). ИК-спектр полученного гидрогеля представлен полосами поглощения, у/см-1: 3466 (ОН); 2875 (С-Щ 1643 (H-O-H); 1103 (^-Р; 949, 1103 (Ti-O-C); 512 (^-О-Т^. Появление полосы поглощения связи Ть О-Т характеризует образование аморфного диоксида титана в системе, а наличие полосы поглощения связи НЮ-Н около 1650 см-1 соответсвует деформационным колебаниям молекул адсорбированной воды. Дополнительно регистрировали ИК-спектр диоксида титана, на котором наблюдается единственная полоса поглощения связи ТьО-Т^ реализуемой при 513 см-1. Наличие полиэтиленгликоксильных групп, ковалентно связанных
с атомами титана (2875 см-1 С-Н в -СН2- и 1103 см-1 ТьО в ТьО-С) подтверждают поликонденсационный механизм гелеобразования и позволяют считать этот гидрогель полимерным.
При регистрации КР-спектра титан-полиэтиленгликолятного гидрогеля наблюдалось 9 характеристических пиков. Автоматический поиск соответствий с использованием программного обеспечения ИнСпектр показал высокую корреляцию (Я=0,997) со спектром соединения 3,6,9-триоксо-а-1-ундеканола, характеризующегося колебаниями первичной спиртовой группы, карбоксильной группы в кетонах и Бр2-гибридного атома углерода в -СН2-группе. Полоса поглощения при 529 см-1 имеет низкую интенсивность, что связано с низким содержанием неорганической части в системе, и соответствует деформационным колебаниям титан-кислородного мостика, что также подтверждено методом ИК-спектроскопии. Остальные полосы поглощения характеризуют органический полимерный материал (представлен полиэтиленгли-колем). Полосы поглощения при 845 и 1141 см-1 указывают на валентные колебания связи -С-О-С-. Поглощение при 1289 см-1 связано с дефомационными колебаниями первичной спртовой группы, полоса поглощения при 1479 см-1 характризует валентные ассиметричные, в то время как при 2891 см-1 представлены валентные симметричные колебания группы -СН2-, низкоинтенсивная полоса поглощения при 3463 см-1 отражает колебания гидроксильной группы. На основе полученных результатов установлено, что в системе преобладает содержание органической части над неорганической и в условиях основного золь-гель синтеза происходит формирование титан-кислородного мостика (Т1-О-Т1).
Термогравиметрический анализ гидрогеля. Для изучения устойчивости и химических превращений гидрогеля в диапазоне температур 0-600 °С получили кривые ТГ и ДТГ (рис. 3). Пик 1 (при 317,75 °С с уменьшением массы образцы на 17,24 % от первоначальной) характеризует удаление абсорбированной воды, остаточных органических соединений и полиэтиленгликоля, не связанного гидрогелем. Процесс дегидратации оксигидрата титана с образованием диоксида титана в анатазной модификации и сгорание связанного гидрогелем полиэтиленгли-коля реализуется при 385,79 °С с уменьшением массы образца на 95,19 % от первоначальной (пик 2). Остаточная масса при температуре 598,01 °С составила 4,47 %.
Те мпература ГС
Рис. 3. Термогравиметрический анализ гидрогеля на основе ПЭГ-Н (кривые термогравиметрии (ТГ) и дифферендицальной термогравиметрии (ДТГ))
Остаточная масса ~ 5 % состоит из компонентов, которые поддаются термическому разрушению под действием более высоких температур. На основе этого можно сделать вывод, что большую часть гидрогеля на основе полиэтиленгликолята титана составляет органическая часть, что так же было подтверждено методом спектроскопии комбинационного рассеяния.
Изучение морфологии поверхности полученного биогибрида и степени выживаемости дрожжей О. ро1утогрка. Оценка жизнеспособности микроорганизмов — важный параметр, если такой тип систем планируют применять в отраслях биотехнологической промышленности.
Рис. 4. Оценка структурных особенностей биогибридного матриала и жизнеспособности инкапсулированных в гидрогели из ПЭГ-Ti дрожжей Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559. А - СЭМ-фотография инкапсулированных дрожжей (бар-метка 5 мкм); Флуоресцентная микроскопия: Б - суспензия свободных дрожжей O. polymorpha, цитохимическая окраска с помощью флуоресцентного красителя LIVE/DEAD™ BacLight™ (бар-метка 10 мкм), В - инкапсулированные дрожжи O. Polymorpha (бар-метка 10 мкм)
Жизнеспособность иммобилизованных дрожжей оценивали методом флуоресцентной микроскопии с использованием системы идентификации живых и мертвых клеток (Live/Dead Yeast Viability Kit) (рис. 4Б, В). Оценку морфологии поверхности сформированного биогибрида проводили с использованием метода сканирующей электронной микроскопии (рис. 4 А).
Дрожжевые клетки покрыты полимерным гелем (рис. 4А) на основе полиэтиленгликолята титана, при этом клетки в оболочке формируют единую архитектуру биогибридного материала. Сравнительный анализ жизнеспособности свободных и инкапсулированных микроорганизмов Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 показал, что наблюдается частичная гибель микроорганизмов после их инкапсулировании, что требует дальнейших исследований.
Дыхательная активность инкапсулированных дрожжевых клеток. Основа жизнедеятельности микроорганизмов — биохимические реакции. Они включают аэробные процессы разложения микробных субстратов. Изменение метаболической активности в условиях наличия субстрата может быть использовано в качестве индикатора биокаталитической активности иммобилизованных микроорганизмов. В процессе работы биогибридные материалы охарактеризовали в качестве биокатализаторов. Для этого использовали биосенсорную систему. Скорость изменения содержания кислорода (мг (02)хл-1хмин-1) после добавления метанола рассматривали как отклик биосенсора.
Использование кислорода микроорганизмами в условиях наличия метанола можно рассматривать как серию биохимических превращений -реакций, катализируемых ферментами. Для биорецептора была получена гиперболическая функция, описывающая взаимосвязь отклика сенсора с концентрацией метанола в кювете — это калибровочная зависимость (рис. 5А). Для аппроксимации применяли гиперболическое уравнение, аналогичное уравнению Михаэлиса-Ментен. На основе полученных данных проводили количественную оценку его чувствительности.
r [5]
Г _ max l -I
~KU + [ 5 ]
Tmax - максимальная скорость реакции;
Км - эффективная константа Михаэлиса.
Для оценки ключевого параметра биосенсора - коэффициента чувствительности - был использован линейный фрагмент гиперболы, лимитированный константой Михаэлиса (рис. 5 Б, таблица).
Концентрация метанола, ммоль/дм3
Рис. 5. Градуировочная зависимость (А) и линейная область зависимости (Б) ответа сенсора от концентрации метанола для дрожжей О. ро1утогрка ВКМ-2559
Результаты определения метрологических характеристик представлены в таблице.
Аналитические и метрологические характеристики сформированного
биорецептора
Характеристика ПЭГ-Т / О. ро!утогрИа ПЭГ-Б1 / О. ро!утогрИа [8]
Диапазон определяемых содержаний, ммоль/дм3 0,47-6,3 0,06-0,67
Коэффициент чувствительности, Бх103, мг О2хммоль-1хмин-1 180±10 850±70
Предел обнаружения, ммоль/дм3 0,2 0,02
Операционная стабильность, % 10 10
Долговременная стабильность, сутки 9 10
При сравнительном анализе с аналогом на основе инкапсулированных дрожжевых клеток в матрицу из полиэтиленгликолята кремния можно выделить значительное снижение характеристик чувствительности сенсора (диапазон определяемых концентраций и коэффициент чувствительности), это может быть связано с разными механизмами формирования матриц. При использовании кремниевых прекурсоров
вокруг дрожжей формируется оболочка типа ОРМОСИЛ [17, 28], а при использование титановых предшественников происходит образование полимерной матрицы вокруг клеток, что может вызывать замедление процессов диффузии субстрата к дрожжевой культуре и продуктов жизнедеятельности в окружающую среду и что может указывать на ингибирующее действие соединений титана на микроорганизмы. По параметрам стабильности биокатализаторы показывают одинаковые результаты: дыхательная активность инкапсулированных микроорганизмов составила около 10 дней.
Заключение
Полиэтиленгликолят титана имеет существенное преимущество перед типичными алкоксидами, поскольку в реакциях гидролиза и конденсации не образуются низкомолекулярные спирты, что позволяет избежать гибели живых клеток при инкапсулировании. Впервые полиэтиленгликолят титана использован для иммобилизации дрожжевых клеток. Продемонстрировано образование на поверхности метилотрофных дрожжей оболочки из ПЭГ-Ti пленочного полимерного типа. Однако наблюдается частичная гибель микроорганизмов, что требует дальнейших исследований. Синтезированные матрицы из полиэтиленгликолята титана могут быть перспективны для иммобилизации ферментов и ферментных систем, что также требует дальнейших исследований.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта ректора ТулГУ для обучающихся по образовательным программам высшего образования - программам магистратуры, № БТ/23/02/ГРР_М.
Список литературы
1. Tripathi V.S., Kandimalla V.B., Ju H. Preparation of ormosil and its applications in the immobilizing biomolecules // Sensors and Actuators B: Chemical. 2006. Т. 114. № 2. С. 1071-1082.
2. Encapsulation of microorganisms for bioremediation: Techniques and carriers. Rev / S. Valdivia-Rivera, T. Ayora-Talavera, M. Lizardi-Jiménez [et al.] // Environ Sci Biotechnol. 2021. V. 20. № 3. P. 815-838.
3. Recent developments on encapsulation of lactic acid bacteria as potential starter culture in fermented foods - A review / D. Kavitake, S. Kandasamy, P. Bruntha Devi [et al.] // Food Bioscience. 2018. V. 21. P. 34-44.
4. Bouabidi Z.B., El-Naas M.H., Zhang Z. Immobilization of microbial cells for the biotreatment of wastewater: A review // Environ Chem Lett. 2019. V. 17. № 1. P. 241-257.
5. Polymers as Encapsulating Agents and Delivery Vehicles of Enzymes / A.S. Pereira, C.P. Souza, L. Moraes [et al.] // Polymers. 2021. V. 13. № 23. P. 4061.
6. On the Mathematical Description of Diatom Algae: From Siliceous Exoskeleton Structure and Properties to Colony Growth Kinetics, and Prospective Nanoengineering Applications / A.I. Salimon, J. Cvjetinovic, Y. Kan [et al.] // The Mathematical Biology of Diatoms, 2023. P. 63-102.
7. Li K., Liu X., Zhang Y. Synthesis and application of biomimetic material inspired by diatomite // Biogeotechnics. 2023. V. 1. № 3. P. 100037.
8. Biocompatible Silica-Polyethylene Glycol-Based Composites for Immobilization of Microbial Cells by Sol-Gel Synthesis / D.G. Lavrova, A.N. Zvonarev, V.A. Alferov [et al.] // Polymers. 2023. V. 15. № 2. P. 458.
9. Rex A., Dos Santos J.H.Z. The use of sol-gel processes in the development of supported catalysts // J Sol-Gel Sci Technol. 2023. V. 105. № 1. P. 30-49.
10. Jiang Z.-T., Zuo Y.-M. Synthesis of Porous Titania Microspheres for HPLC Packings by Polymerization-Induced Colloid Aggregation (PICA) // Anal. Chem. 2001. V. 73. № 3. P. 686-688.
11. Highly Blood Compatible Titania Gel / S. Takemoto, K. Tsuru, S. Hayakawa [et al.] // Journal of Sol-Gel Science and Technology. 2001. V. 21. № 1/2. P. 97-104.
12. TiO2 nanoparticles derived from egg shell waste: Eco synthesis, characterization, biological and photocatalytic applications / S. Ramya, S. Vijayakumar, E. Vidhya [et al.] // Environmental Research. 2022. V. 214. P. 113829.
13. Liu X., Wang Y., Bai T. Preparation of High Hardness Transparent Coating with Controllable Refractive Index by Sol-Gel Technology // Coatings. 2020. V. 10. № 7. P. 690.
14. Sartori B., Amenitsch H., Marmiroli B. Functionalized Mesoporous Thin Films for Biotechnology // Micromachines. 2021. V. 12. № 7. P. 740.
15. Synthesis of organosilicon sol-gel matrices and preparation of heterogeneous biocatalysts based on them / O.A. Kamanina, D.G. Fedoseeva, T.V. Rogova [et al.] // Russ J Appl Chem. 2014. V. 87. № 6. P. 761-766.
16. Effect of polyethylene glycol additives on structure, stability, and biocatalytic activity of ormosil sol-gel encapsulated yeast cells / D.G. Lavrova,
0.A. Kamanina, A.V. Machulin [et al.] // J Sol-Gel Sci Technol. 2018. V. 88. №
1. P. 1-5.
17. Yeast Debaryomyces hansenii within ORMOSIL Shells as a Heterogeneous Biocatalyst / O.N. Ponamoreva, E. L. Afonina, O. A. Kamanina [et al.] // Appl Biochem Microbiol. 2018. V. 54. № 7. P. 736-742.
18. Titanium polyethylene glycolates and hydrogels on the basis of the glycolates / T.G. Khonina, A.P. Safronov, M.V. Ivanenko [et al.] // Russ Chem Bull. 2014. V. 63. № 7. P. 1639-1642.
19. Synthesis of pharmacologically active hydrogels based on combined silicon and titanium polyolates / M.V. Ivanenko, T.G. Khonina, O.N. Chupakhin [et al.] // Russ Chem Bull. 2012. V. 61. № 11. P. 2163-2171.
20. Structural features and antimicrobial activity of hydrogels obtained by the sol-gel method from silicon, zinc, and boron glycerolates / T.G. Khonina, N.V. Kungurov, N.V. Zilberberg [et al.] // J Sol-Gel Sci Technol. 2020. V. 95. № 3. P. 682-692.
21. Sol-gel Synthesis, Photo- and Electrocatalytic Properties of Mesoporous TiO2 Modified with Transition Metal Ions / N. Smirnova, I. Petrik, V. Vorobets [et al.] // Nanoscale Res Lett. 2017. V. 12. № 1. P. 239.
22. Tani K., Suzuki Y. Influence of titania matrix on retention behaviour in reversed-phase liquid chromatography // Journal of Chromatography A. 1996. V. 722. № 1-2. P. 129-134.
23. Matsuda H., Nakamura H., Nakajima T. New Ceramic Titania: Selective Adsorbent for Organic Phosphates // ANAL. SCI. 1990. V. 6. № 6. P. 911-912.
24. Ikeguchi Y., Nakamura H. Selective Enrichment of Phospholipids by Titania // ANAL. SCI. 2000. V. 16. № 5. P. 541-543.
25. Mesoporous titanium dioxide coating for metallic implants / W.Xia, K. Grandfield, A. Hoess [et al.] // J Biomed Mater Res. 2012. V. 100B. № 1. P. 82-93.
26. Orthopaedic osseointegration: Implantology and future directions / A.L. Overmann, C. Aparicio, J.T. Richards [et al.] // Journal Orthopaedic Research. 2020. V. 38. № 7. P. 1445-1454.
27. Marin E., Lanzutti A. Biomedical Applications of Titanium Alloys: A Comprehensive Review // Materials. 2023. V. 17. № 1. P. 114.
28. Chen H. et al. Progress in Surface Modification of Titanium Implants by Hydrogel Coatings // Gels. 2023. V. 9. № 5. P. 423.
29. Titanium glycolate-derived TiO2 nanomaterials: Synthesis and applications / Y. Wei, J. Zhu, Y. Gan [et al.] // Advanced Powder Technology. 2018. V. 29. № 10. P. 2289-2311.
30. Silica sol-gel encapsulated methylotrophic yeast as filling of biofilters for the removal of methanol from industrial wastewater / O.A. Kamanina, D.G. Lavrova, V.A. Arlyapov [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2016. V. 92. P. 94-98
31. Алферов С.В., Федина В.В. Электроактивные полимер-основанные композиты для иммобилизации биоматериала в биотопливных элементах // Актуальная биотехнология. 2023. № 2. С. 56-60.
32. Mechanism of structural networking in hydrogels based on silicon and titanium glycerolates / T.G. Khonina, A.P. Safronov, E.V. Shadrina [et al.] // Journal of Colloid and Interface Science. 2012. V. 365. № 1. P. 81-89.
33. Molecular Characterization of Polymer Networks / S.P.O. Danielsen, H.K. Beech, S. Wang [et al.] // Chem. Rev. 2021. V. 121. № 8. P. 5042-5092.
Филиппова Екатерина Сергеевна, мл. науч. сотр. лаборатории «Экологическая и медицинская биотехнология», [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
A NEW APPROACH TO YEAST ENCAPSULATION: BIOHYBRID MATERIALS BASED ON POLYETHYLENE GLYCOL HYDROGEL AND METHYLOTROPHIC YEAST
E.S. Filippova
For the first time, yeast microorganisms have been encapsulated in a polyethylene glycolate-titanium (PEG-Ti)-based hydrogel using sol-gel technology. CR spectroscopy and thermogravimetric analysis were used to demonstrate the predominance of organic over inorganic components in PEG-Ti-based hydrogels, providing a favourable environment for microorganisms. The morphology of the biohybrid material corresponds to the target structure «cell in a film-like shell», but the yeast survival rate was 50%. Synthesised polyethylene glycolate-titanium matrices may be promising for the immobilisation of enzymes and enzyme systems.
Key words: cell encapsulation, methylotrophic yeast, biocompatible polyolates, titanium polyethylene glycolates, sol-gel technology.
Filippova Ekaterina Sergeevna, junior research scientist laboratory of "Environmental and Medical Biotechnology", [email protected], Russia, Tula, Tula State University
