CC BY
15УДК: 796.01:612
новый подход
к донозологической диагностике сердечно-сосудистых заболеваний у высококвалифицированных спортсменов Республики Адыгея
Аспирант Д.В. Муженя
Доктор биологических наук, профессор А.Р. Тугуз Кандидат педагогических наук, доцент А.С. Дорошенко Аспиранты К.А. Руденко, Е.Н. Анохина
Адыгейский государственный университет, Майкоп
/4 NEW APPROACH TO IN PRENOSOLOGICAL DIAGNOSTICS OF CARDIOVASCULAR DISEASES IN ELITE ATHLETES OF REPUBLIC OF ADYGEYA
D.V. Muzhenya, postgraduate A.R. Tuguz, professor, Dr.Biol. A.S. Doroshenko, associate professor, Ph.D.
K.A. Rudenko, postgraduate
E.N. Anokhina, postgraduate Adygeya state university, Maikop
Key words: gene, polymorphism, alleles, athletes, atherogenesis, apolipo-protein, SNP, cardiovascular system.
The purpose of the study was to examine the frequency distribution and Leu28/28Pro associations of the APOE gene polymorphism at the risk of atherogenesis in elite athletes of the Republic of Adygeya.
The distribution of the APOE gene Leu28Pro polymorphisms was studied using the SNP - method with electro-phoretic detection of results and the dual priming system (Lytech Co. Ltd.). Blood cholesterol was measured on the semi-automatic biochemistry analyzer (BS3000P, China), with the reagent kit Cholesterol DiaS (JCV Diakon-DS, Russia) for reference values 3,0-5,2 mmol/l. The test data were analyzed using valid statistical methods. 94 male subjects were involved in the study, including 39 athletes, 25 healthy male adolescents not engaged in sports and 30 subjects with cardiovascular diseases (CVD). The detection in the group of athletes of significantly higher frequencies of the 28Pro polymorphism (0,136) associated with lipidoses and high chance of atherosclerotic vascular disease is a predictor of CVD risk in the athletes (OR = 3,85; CI (0,94-88,5)). The data obtained along with additional instrumental methods of examination of the functional state of cardiovascular system can be very useful in sport medicine in view of prenosological diagnostics of CVD.
Ключевые слова: спортсмены, ген, полиморфизм, аллели, атерогенез, аполипопротеин, SNP, сердечно-сосудистая система.
Введение. В мировой практике современныхнаучныхисследований отмечена высокая степень наследуемости морфо-функциональных особенностей человека, востребованных в спорте высоких достижений и обусловленных единичными нуклеотидными заменами (SNP -single nucleotide polymorphism) - полиморфизмами генов, вовлеченных в регуляцию сердечно-сосудистой системы (ССС), повышающих вариативные возможности адаптационных механизмов к интенсивным физическим нагрузкам [6, 7, 1, 14, 17].
SNP, выявляемые молекулярно-генетическими методами, обладают высокой информативностью при оценке потенциала развития физических качеств, факторов, лимитирующих работоспособность человека, для ранней донозологиче-ской диагностики наследственной предрасположенности к развитию профессиональных заболеваний [1, 14, 17, 19].
Генетические маркеры, определяющие способность ССС к физиологической адаптации в условиях интенсивных физических нагрузок востребованы в современном спорте для подготовки спортсменов мирового уровня и коррекции тренировочного процесса [17, 19, 2, 3, 5].
Одним из таких маркеров может быть ген аполи-попротеина Е (АРОЕ), регулирующий метаболизм ли-пидов и работу ССС [13].
Аполипопротеин Е синтезируется в печени и головном мозге, входит в состав хиломикронов и липо-протеинов низкой плотности (ЛПНП), обладающих более выраженным атерогенным эффектом (приводящим к атеросклерозу). АРОЕ инициирует захват и удаление ЛПНП посредством взаимодействия со специ-
фическим рецептором на поверхности гепатоцитов; участвует в процессах иммунорегуляции, нервной регенерации и активации липолитических ферментов (липазы печени, липазы липопротеинов и лецитин-холестерин ацилтрансферазы) [12, 9, 11, 10].
Мутации гена АРОЕ изменяют структуру молекулы аполипопротеина, нарушая механизм липидного обмена. Генетический полиморфизм АРОЕ - важная предпосылка возникновения гиперлипопротеинемии, снижающей функциональные возможности ССС, риск развития коронарного и периферического атеросклероза и болезней сердечного континуума. Ген АРОЕ человека локализован в 19-й хромосоме 19-q13.32 (см. рисунок) [16].
Из известных полиморфных вариантов гена АРОЕ наиболее значимы шесть основных фенотипов: три гомозиготных (Апо Е4/4, Апо Е3/3, Апо Е2/2) и три гетерозиготных (Апо Е4/3, Апо Е4/2, Апо ЕЗ/2) [18]. Leu28 Pro полиморфизм гена АРОЕ (ApoE4Freibur) впервые описан Orth M. et al. [15] и по данным HuGeNET, является одним из наименее изученных среди мутаций аполипопротеина Е, но перспективным в предиктивной медицине.
Распределение Leu28 Pro полиморфизма гена АРОЕ в мировых популяциях, по данным dbSNP (date base Single Nucleotide Polymorphism), отражено в табл. 1 [8].
В немногочисленных исследованиях проанализирована ассоциация Leu28 Pro полиморфизма гена АРОЕ с нарушением липидного обмена и как следствие с развитием сердечно-сосудистых заболеваний. У больных отмечена более высокая частота «мутантно-го» 28 Pro аллеля, чем в случайных выборках населения. При наличии 28 Pro риск развития ишемической болезни сердца (ИБС) повышается в 5,3 раза, а при совместном наследовании 28 Pro аллеля гена АРОЕ и его изоформы ApoE*4 - более чем в 20 раз [18, 4].
Ассоциация Leu28 Pro полиморфизмов гена АРОЕ с атерогенезом практически не исследована, однако это могло бы представлять не только научный, но и практический интерес в плане донозологической диагностики сердечно-сосудистых заболеваний среди разных контингентов населения, и особенно у высококвалифицированных спортсменов.
Цель работы - исследование распределения частот и ассоциации Lеu28/28 Рго полиморфизмов гена АРОЕ с риском развития атерогенеза у высококвалифицированных спортсменов РА.
Характеристика обследованных контингентов. К исследованию были привлечены 94 представителя мужского пола в возрасте 18-60 лет, в том числе 39 спортсменов, 25 здоровых юношей, не занимающихся спортом, и 30 больных с сердечнососудистыми заболеваниями (ССЗ). Группа высококвалифицированных спортсменов (16 кандидатов в мастера спорта, 6 мастеров спорта, 18 перворазрядников) представлена футболистами клуба «Дружба», баскетболистами команды «Динамо» г. Майкопа (п=28) и членами сборной Республики Адыгея (РА) по легкой атлетике (бег на средние дистанции, п=11) 18-25 лет (средний возраст - 22,7±3,85) с различной физической нагрузкой на ССС в условиях тренировочной и соревновательной деятельности. Контингент спортсменов подобран в соответствии с предложенной В. С. Фарфелем (1975) классификацией видов спорта, относящихся к скоростно-силовым с максимальной и субмаксимальной мощностью работы (стаж тренировок - не менее 8 лет).
Контрольная группа представлена случайной выборкой здоровых лиц мужского пола (п=25) в возрасте от 18 до 24 лет (средний возраст - 21±3,15), не занимающихся спортом и без наследственной отягощенности по ССЗ. Больные с ССЗ (п=30) - пациенты кардиологического отделения АРКБ (г. Майкоп, РА) в возрасте 47-60 лет (55,4 ± 7,7) с ССЗ, развившимися на фоне коронарного (п=19) и периферического (п=11) атеросклероза. У больных с коронарным атеросклерозом диагностированы различные варианты ИБС, инфаркта миокарда (ИМ), хронической сердечной недостаточности (ХСН) и др.; при периферическом атеросклерозе - осложнения в виде тромбозов, окклюзии аорты и артерий верхних и нижних конечностей, гипертонической болезни и др. Диагнозы кардиологических больных выставлены по стандартным биохимическим показателям крови; инструментальным исследованиям ЭКГ, холтеровского мониторирования ЭКГ, эхокар-диографии (ЭХО-КС).
Цитогенетическое строение 19-й хромосомы (по данным HuGENavigator)
Таблица 1. Анализ распространения полиморфизма АРОЕ Leu28 Pro (по данным dbSNP)
Популяции Год Выборка Аллель
Leu Pro
Северная Америка 2000, 2000 84/48 1.000/0.980 0,000 /0,020
Европа 2000, 2001 184/456 1.000 0,000
Северная Америка 2003 4520 0.999 0,001
Центральная и Южная Америка 2003 48 1.000 0,000
Восточная Азия 2004 84 1.000 0,000
Материалы и методы исследования. Распределение Leu28 Pro полиморфизмов гена АРОЕ (табл. 2) исследовано SNP-методом с электрофо-ретической детекцией результатов и использованием двухпраймерной системы (НПФ «Литех»).
Качество геномной ДНК, выделенной из периферической крови, протестировано на спектрофотометре «NanoDrop 2000 с» (Termo Scientific, USA). Результаты исследований обработаны при УФ-облучении (длина волны 310 нм) в трансиллюминаторе «Gel Doc» (Био-Рад) с помощью программы «Quantity One» (Био-Рад).
Содержание холестерина в крови исследовано на полуавтоматическом анализаторе «BS3000 Р» (Китай), с набором реагентов «Холестерин ФС» ЗАО Диакон ДС (Россия) для референтных значений 3,0-5,2 ммоль/л.
Статистический анализ экспериментальных данных. Значимые различия (р<0,05) вычислены с использованием непараметрического метода Фишера, % 2 (кси-квадрата) для таблиц сопряженности 2 x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность и расчетом отношения шансов (OR - odds-ration), 95 % доверительного интервала (95 % CI).
Результаты исследования. Для определения прогностической значимости Leu28/28 Pro полиморфизмов гена АРОЕ в нарушении процесса регуляции липидного обмена и атерогенеза проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей в контрольной группе, у спортсменов и больных с ССЗ (табл. 3, 4).
Во всех обследованных контингентах преобладает «нормальный» гомозиготный Leu28 полиморфизм и Leu28 Leu генотип. «Мутантный» 28 Рго аллель гена АРОЕ выявлен только в гетерозиготном состоянии у спортсменов и в группе больных с ССЗ (табл. 3). Статистически значимое превышение частот Leu28 Pro генотипа установлено у лиц с осложнениями коронарного и периферическо-
го атеросклероза: ИБС, ИМ, инсультом, ишемией, тромбозами нижних конечностей и др. (см. табл. 3).
По Leu28/28 Pro аллелям в группе больных с ССЗ в отличие от спортсменов и контрольной группы выявлены достоверно более высокие частоты мутант-ного 28 Р аллеля аполипопротеина Е (см. табл. 3). При биохимическом анализе крови больных с гетерозиготным генотипом АРОЕ по сравнению с нормой отмечено повышение содержания холестерина (>7,5 ммоль/л), что подтверждает его ассоциированность с нарушением липидного обмена при ате-росклеротических поражениях сосудов разных бассейнов. В группе высококвалифицированных спортсменов проведен анализ частотного распределения генотипов и Leu28 Pro аллелей АРОЕ с целью оценки риска нарушения липидного обмена и развития атерогенеза (табл. 4).
У футболистов и баскетболистов отсутствуют 28 Pro аллель и Leu28 Pro генотип гена АРОЕ. В группе легкоатлетов прогностически неблагоприятный гетерозиготный Leu28 Pro генотип, ассоциированный с повышенным риском развития ССЗ (OR=3,85; CI (0,94-88,5)), отмечен в 27,3 % случаев, что сопоставимо с больными с ССЗ (см. табл. 3). В условиях интенсивных физических нагрузок наследственная предрасположенность к ССЗ у этих спортсменов в сочетании с другими факторами риска может проявиться в нарушении физиологической адаптации организма и развитии патологических состояний. Статистически значимых различий в распределении 28 Pro полиморфизма гена АРОЕ в зависимости от этнической принадлежности (адыги и русские) обследованных высококвалифицированных спортсменов, доноров, больных не выявлено (данные не представлены).
Обсуждение. 28 Pro аллель гена АРОЕ, ассоциированный по данным [4] с повышенным (более чем в 5 раз) риском развития ИБС, не выявлен у здоровых жителей РА, что сопоставимо с результатами, полученными для мировых популяций (см. табл. 1).
Таблица 2. Анализ распространения полиморфизма АРОЕ Leu28 Pro (по данным dbSNP)
Ген Аллели Символ аллеля Праймер
APOE Leu C 5'-atgccgatgacctgcagaag Cgcctggcagt gtaccaggcc-3'
Pro T 5'-atgccgatgacctgcagaag Tgcctggcagt gtaccaggcc-3'
Таблица 3. Частоты генотипов и 128/28 Р аллелей гена АРОЕ у спортсменов в контрольной группе и группе больных с ССЗ
Аллели/генотипы Частоты генотипов и аллелей, %
Генотипы Спортсмены, n=39 Больные с ССЗ, n=30 Контрольная группа, n=25
L28L 92,3 73,3 100
L28P 7,7 26,7 0
P28P 0 0 0
р, OR CI (95%) р * = 0,03; 4,36 (0,94-88,5) р **= 0,005 ; 19,27 (0,92 - 115)
Аллели
L28 0,962 0,866 1,000
28P 0,038 0,134 0
P, OR (CI 95%) р* = 0,04 3,85 (0,94-88,5) р** = 0,007 16,35(0,92 - 115)
Примечание. р - достоверность различий в частотах генотипов и аллелей: * - спортсменов и группы сравнения; ** - контрольной группы и группы сравнения.
Таблица 4. Частоты генотипов и Leu28/28 Pro аллелей гена APOE в группах спортсменов
Аллели / генотипы Частоты генотипов и аллелей, %
Генотипы Все, n=39 футболисты, n=19 баскетболисты, n=9 легкоатлеты, n=11 *
L28L 92,3 100 100 72,7 р < 0,05
L28P 7,7 0 0 27,3
P28P 0 0 0 0
Аллели **
L28 0,962 1,000 1,000 0,864 р<0,05
28P 0,038 0 0 0,136
Примечание. р - достоверность различий: * - в частотах генотипов; ** - в частотах аллелей.
Выявление в группе легкоатлетов достоверно более высоких частот 28 Pro (0,136) полиморфизма, ассоциированного с нарушением липидного обмена и повышающего вероятность атеросклеротического поражения сосудов, служит прогностически неблагоприятным фактором риска развития ССЗ у этих спортсменов (OR = 3,85; CI = 0,94-88,5).
Полученные данные в сочетании с дополнительными инструментальными исследованиями функционального состояния ССС могут иметь большое значение в спортивной медицине для донозологической диагностики ССЗ. Выводы
• У больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями выявлены достоверно более высокие частоты Leu28 Pro (гетерозиготного) генотипа и мутантно-го 28 Р аллеля АРОЕ.
• Носительство Leu28 Pro генотипа и 28 Рго полиморфизма гена АРОЕ - прогностически неблагоприятный фактор нарушения липидного обмена, атерогенеза и как следствие - повышения риска развития ССЗ.
• 28 Рго полиморфизм гена АРОЕ может быть использован как специфический маркер наследственной предрасположенности к функциональным отклонениям ССС, что должно учитываться при организации тренировочного процесса и отборе детей в спортивные школы.
Литература
1. Ахметов И.И. Молекулярная генетика спорта: монография / И.И. Ахметов. - М.: Советский спорт, 2009. - 268 с.
2. Гоечишкина С.С. Особенности функционального состояния кардиореспираторной системы и нейрофизиологического статуса у спортсменов-легкоатлетов / С.С. Гречишкина, Т.Г. Петрова, А.А. Намитокова // Вестник Томского государственного педагогического университета. - Томск, 2011. - Вып. 5(107). - С. 49-55.
3. Кузьмин АА. Характеристика функционально-адаптивного состояния организма юных футболистов и баскетболистов 10-15 лет в динамике тренировочного процесса / А.А. Кузьмин [и др.] // Валеология. - 2009. - № 1. - С. 29-36.
4. Нгуен Тхи Чанг. Особенности развития окислительного стресса и генетические маркеры предрасположенности к ишемической болезни сердца у лиц пожилого и старческого возраста Ростовской области: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Нгуен Тхи Чанг. - Ростов-на-Дону, 2012. - С. 22.
5. Петрова Т.Г. Состояние сердечно-сосудистой системы и нейрофизиологического статуса студентов, занимавшихся футболом в спортивных секциях / Т.Г. Петрова [и др.] // Вестник Адыгейского государственного университета. Сер. «Естественно-математические и технические науки». - 2011. -№ 3(86). - С. 55-65.
6. Рогозкин В.А. Генетические маркеры физической работоспособности человека / В.А. Рогозкин [и др.] // Теория и практика физ. культуры. 2000. - №. - 12. - С. 34-36.
7. РогозкинВА. Гены-маркеры предрасположенности к скоростно-
силовым видам спота / В.А. Рогозкин [и др.] // Теория и практика физ. культуры. - 2005. - № 1. - С. 2-4.
References
1. Akhmetov, I.I. Molecular genetics of sport: monograph / I.I. Akhmetov. Moscow: Sovetsky sport, 2009. 268 P. (In Russian)
2. Grechishkina, S.S. The peculiarities of the functional state of cardiorespiratory system and neurophysiological state of athletes / S.S. Grechishkina, T.G. Petrova, A.A. Namitokova // Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo pedagogicheskogo universiteta, Tomsk. - 2011.
- Iss. 5(107). - P. 49-55. (In Russian)
3. Kuz'min, AA. Characteristics of the functional state of young football and basketball players at the age of 10-15 years old in the dynamics of training process / A.A. Kuz'min [et al.] // Valeologiya. - 2009. - № 1. - P. 29-36. (In Russian)
4. Nguen Tkhi Chang The peculiarities of development of oxidative stress and genetic markers of disposition to ischemic heart disease of the aged of the Rostov region: abstract of Ph.D. thesis / Nguen Tkhi Chang. RI NC SFU, Rostov-on-Don: 2012. P. 22. (In Russian)
5. Petrova, T.G. The state of cardiovascular system and neurophysiological state of students engaged in football in sports sections / T.G. Petrova [et al.] // Vestnik Adygeyskogo gosudarstvennogo universiteta. Series "Natural-mathematical and technical sciences". - № 3(86).
- 2011. - P. 55-65. (In Russian)
6. Rogozkin, V.A. Genetic markers of human physical working capacity / V.A. Rogozkin (et al.) // Teoriya i praktika fizicheskoy kultury. 2000. -№.12. - P. 34-36. (In Russian)
7. Rogozkin, V.A. Genetic markers of predisposition to speed and strength sports / V.A. Rogozkin [et al.] // Teoriya i praktika fizicheskoy kultury. - 2005.-№ 1. - P. 2-4. (In Russian)
8. http://www.hugenavigator.net/HuGENavigator/
9. Brown, M. S. Regulation of plasma cholesterol by lipoprotein recep-tors./ M.S. Brown [et al.] // Science - 1981.-.№ 212. - Р628-635.
10. Eto M. A. racial difference in apolipoprotein E allele frequencies between the Japanese and Caucasian populations./ M. Eto [et al.] // Clin. Genet.- 1986.- №30.- Р. 422-427
11. Gregg R. E. Apolipoprotein E alleles in severe hypertriglyceridaemia./ R.E. Gregg [et al.] // Lancet .-1983. -Note: Originally Volume I.- Р. 321: 353
12. Heng O.K. Lack of association of apolipoprotein E polymorphism with plasma Lp(a) levels in the Chinese/ O.K. Heng [et al.] // Clin. Genetics.- 1995.- № 48.- Р.120-153
13. de Knijff P. Genetic heterogeneity of apolipoprotein E and its influence on plasma lipid and lipoprotein levels./ P.de Knijff [et al.] // Hum. Mutat.- 1994.- № 4.-Р. 178-194.
14. Montgomery H.E. Human gene for physical performance / H.E. Montgomery [et al.] // Nature 1998.-No.- 393. - Р. 221-222.
15. OrthM. Effects of a Frequent Apolipoprotein E Isoform, ApoE4Freiburg (Leu28^-Pro), on Lipoproteins and the Prevalence of Coronary Artery Disease in Whites. / M. Orth [et al.] // Arterioscler Thromb Vasc Biol.-1999.-№19.- Р.1306-1315.
16. Perical-Vance M.A. Linkage studies in familial Alzheimer's disease: evidence for chromosome 19 linkage / M.A. Perical-Vance [et al.] // Am.J.Hum.Genet.-1991. -№48. - P.1034-1050.
17. Rankinen T. The Human Gene Map for Performance and Health-Related Fitness Phenotypes: The 2005 Update. / T. Rankinen [et al.] // Med Sci Sports Exerc. - 2006.-№ 38(11).-Р. 1863 -1888.
18. Utermann G. Genetic control of human apolipoprotein E polymorphism: comparison of one- and two-dimensional techniques of isoprotein analysis / G. Utennan [et al.] // Arteriosclerosis. -1995.-№183.- P. 173.
19. Wolfarth B. The human gene map for performance and health-related fitness phenotypes: The 2004 update. / B.Wolfarth [et al.]// Med Sci Sports Exerc.-2005.-№37(6). - Р. 881-903
Информация для связи с автором:
lab_genetic@mail.ru
Поступила в редакцию 12.03.2013 г.
