CC BY
157
Инфекция и иммунитет 2013, Т. 3, № 1, с. 89-92
Краткие сообщения
НОВЫЙ ПОДХОД
К АЛЛЕРГОДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА
Д.Г. Пономаренко1, О.В. Логвиненко1, Н.С. Саркисян1, Е.Л. Ракитина1, О.Г. Голубь2, А.Н. Куличенко1
1ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ставрополь 2МБУЗ Городская клиническая больница № 2, г. Ставрополь
Резюме. Предложен новый цитометрический метод лабораторной диагностики бруцеллеза в условиях in vitro, основанный на определении повышенной чувствительности организма к бруцеллам. Тест позволяет дифференцировать вакцинный и инфекционный процессы при хроническом бруцеллезе, производить количественный учет степени сенсибилизации к бруцеллам и, соответственно, может быть использован для оценки напряженности поствакцинального иммунитета перед повторной иммунизацией против бруцеллеза. Использование метода проточной цитометрии при постановке теста исключает добавочное антигенное воздействие на организм и позволяет проводить постановку и учет реакции в течение 1 часа.
Ключевые слова: бруцеллез, аллергодиагностика, проточная цитометрия.
A NEW APPROACH TO BRUCELLOSIS ALLERGODIAGNOSTICS
Ponomarenko D.G., Logvinenko O.V., Sarkisian N.S., RakM;^ C.L, Golub O.G., Kulichenko A.N. Abstract. The new cytometric method for laboratory diagnosis of brucellosis in vitro conditions based on detection of hypersensitivity to Brucella has been developed. This test allows to differentiate vaccinal and infectious processes in case of chronic brucellosis, and to measure the level of patient sensibilization to Brucella. Thus, the test might be used to estimate intensity of post-vaccination immunity before re-immunization against brucellosis. Using of flow cytometry in the test excludes additional antigenic influence on human organism and allows to provide testing within 1 hour. (Infekc. immun., 2013, vol. 3, N1, p. 89—92)
Key words: brucellosis, allergic diagnostics, flow cytometry.
В результате взаимодействия организма с аллергенами (антигенами) возникает сенсибилизация — повышенная специфическая чувствительность, которая используется в лабораторной диагностике как маркер, указывающий на имевшийся контакт организма с чужеродными субстанциями [8, 10].
Для выявления сенсибилизации организма разработан комплекс методов, включающий кожные пробы и аллергологические тесты in vitro. С целью определения аллергической перестройки организма наиболее часто применяют накожное аллерготестирование. Однако его использование сопряжено с риском возникновения общих и местных реакций на дополнительную антигенную нагрузку. Не рекомен-
дуется постановка кожных аллергических проб детям до трех лет и беременным [8, 9].
Кожно-аллергическая проба с бруцеллином, так называемая проба Бюрне, была разработана и применяется со второй половины XX века. Согласно методическим указаниям МУ 3.1.7.118903 кожно-аллергические тесты используются для лабораторной диагностики бруцеллеза, а также с целью определения напряженности поствакцинального иммунитета перед повторной иммунизацией [2, 5, 9].
Постановка аллергических тестов с бруцеллином имеет ряд недостатков. У лиц высоко сенсибилизированных к бруцеллезному антигену возможно развитие реакции в виде повышения температуры, озноба, головной боли, лимфан-
поступила в редакцию 25.12.2012 Адрес для переписки:
принята к печати 18.02.2013 Пономаренко Дмитрий Григорьевич, 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15,
к.б.н., зав. лабораторией патоморфологии ФКУЗ Ставропольский противочумный
особо опасных инфекционных институт Роспотребнадзора.
заболеваний ФКУЗ Ставропольский Тел.: (8652) 26-18-19 (служебн).
© Пономаренко Д.Г противочумный институт Тел./факс: (8652) 26-03-12.
и соавт., 2013 Роспотребнадзора E-mail: patomorf@yandex.ru, dich@nm.ru
гита, артралгии и т.д. К недостаткам можно отнести риск возникновения ложноположитель-ного результата при наличии аллергии и других иммунопатологических состояний; учет реакции осуществляется через 24—48 часов [5].
C конца XX века и по настоящее время ведутся исследования, направленные на замену ин-вазивных аллергических тестов на более безопасный и высокоспецифичный метод оценки аллергической перестройки организма in vitro. Предложенные к использованию тесты, такие как радиоаллергосорбентный, метод микроскопической оценки дегрануляции базофилов при окраске щелочными красителями, определение концентрации освобожденного гистами-на (метод Шелли), реакция лейкоцитолиза (тест аллергической альтерации лейкоцитов), выявления специфических иммуноглобулинов Е имеют ряд ограничений, обусловленных или трудоемкостью, или низкой чувствительностью и слабой специфичностью [6, 7, 14, 15].
В 1994 г. Sainte-Laudu et al. впервые предложили определение дегрануляции базофилов методом проточной цитометрии [15]. Сущность теста сводится к тому, что при внесении в пробу известного аллергена, при наличии сенсибилизации, он взаимодействует со специфическими молекулами IgE, которые связаны с поверхностными рецепторами базофилов. Это инициирует каскад ферментных реакций, приводящих к дегрануляции эффекторной клетки с экспрессией маркера клеточной перестройки CD63 (gp53). Благодаря используемой технологии CAST® (Cellular Antigen Stimulation Test, тест антигенной стимуляции клеток), способ обладает высокой специфичностью по сравнению с классическими методиками.
Целью исследований явилось изучение возможности применения теста активации базо-филов для выявления повышенной чувствительности организма к бруцеллам.
Исследовали кровь 92 человек. Из них — 26 человек больных острым и 16 — хроническим бруцеллезом, 12 человек, вакцинированных Brucella abortus 19 BA (на 30—35 сутки после иммунизации). С целью определения специфичности и чувствительности используемого метода исследовали кровь беременных — 7 человек (31—33 неделя беременности), 19 обследованных в возрасте от 2-х до 37 лет с проявлениями аллергии в анамнезе, контрольную группу составили 12 человек, не имевших в анамнезе симптомов аллергии, не переболевших бруцеллезом и не вакцинированных против этой инфекции.
Экспрессию на базофилах CD63 определяли на проточном цитометре FACSCalibur (США), используя набор моноклональных антител Buhlmann laboratories (Швейцария). Для определения фонового значения использовали «буфер для стимуляции» (Flow 2 CAST). При учете
результата значение фоновой пробы вычитали из аналогичного показателя при стимуляции антигеном. Полученные цифровые данные отражают процент активированных базофилов.
В качестве специфического антигена использовали аллерген бруцеллезный жидкий (Бру-целлин) производства ФГУП «НПО Микроген» (Россия).
Обеззараживание исследуемого материала от больных бруцеллезом людей осуществляли в соответствии с СП № 1.3.1285-03 путем добавления к исследуемой пробе мертиолята натрия до конечной концентрации 1:10 000 с последующим прогреванием при 56°С в течение 30 мин [1].
Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2010. С учетом малой выборки (n < 30) для выявления статистической значимости различий результатов использовали t-критерий Стьюдента при уровне надежности P > 0,95 [11].
В контрольной группе и у людей, имеющих в анамнезе аллергию, исследуемый показатель находился в пределах от 0 до 5% при среднем значении 2,17+0,45 и 2,43+0,42% соответственно. В группе беременных среднее количество активированных бруцеллином базофилов составило 2,57+0,49% при вариации от 0 до 4%. При постановке теста активации базофилов с бруцеллином достоверных различий в показателях у беременных, у лиц имеющих в анамнезе аллергопатологию и у лиц контрольной группы не установлено, в связи с этим они были объединены в контрольную группу.
Проведенные исследования показали, что у больных хроническим бруцеллезом количество активированных бруцеллином базофилов находилось в пределах от 32 до 57% и в среднем составляло 38,15+3,96% (P > 0,95). У больных острой формой заболевания выявили от 10 до 17% дегранулированных базофилов, среднее значение — 12,9+2,04% (P > 0,95). В группе иммунизированных против бруцеллеза, количество детектируемых клеток варьировало от 9 до 19% и в среднем составило 14,7+2,83% (P > 0,95) (рис.)
При проведении исследований установлено, что у больных острой формой бруцеллеза количество активированных бруцеллином ба-зофилов более чем в 5 раз превышало значения контрольной группы. В случае хронического течения заболевания и у иммунизированных пациентов выявляли увеличение определяемых клеток в 16 и 9 раз соответственно относительно контрольного уровня. У больных острым бруцеллезом и у вакцинированных исследуемый показатель был в 3,7 и 2 раза ниже, чем у пациентов с хронической формой заболевания.
2013, Т. 3, № 1
Диагностика бруцеллеза
60 50 40 30 20 10
b -1-
+ , + , -I- , ,
Контроль
Аллергия
Беременные
Вакцинированные
Острый бруцеллез
Хронический бруцеллез
Рисунок. Анализ диапазонов значений активации базофилов в группах сравнения
Используемая технология CAST обеспечивает высокую специфичность метода, а полученные результаты указывают на перспективу применения аллергического теста in vitro для диагностики бруцеллеза. Преимуществом метода является возможность количественной оценки степени сенсибилизации организма, получение результатов в течении одного часа от начала исследования. Предложенная методика исключает добавочное антигенное воздействие на организм, что предупреждает возникновение осложнений, связанных с дополнительной ал-лергизацией организма, и может быть использована как полноценная альтернатива классического метода — пробы Бюрне.
Количество активированных бруцеллином базофилов в крови иммунизированных против бруцеллеза и больных хронической формой этой инфекцией имеет статистически значимые различия (Р > 0,05), следовательно, тест активации базофилов позволяет дифференцировать вакцинный и инфекционный процессы при хроническом бруцеллезе.
Широкий диапазон колебания полученных данных в группе иммунизированных и пациентов с острой формой инфекции указывает на то, что дифференциация степени аллергической перестройки организма при остром бруцеллезе и после вакцинации, с помощью теста активации базофилов, возможна только с учетом комплекса клинических и лабораторных исследований.
Иммунитет при ряде инфекций, например при бруцеллезе, не может формироваться без аллергических реакций [3, 4, 10, 13, 14]. Степень сенсибилизации организма может выступать как показатель устойчивости к данной инфекции [3, 15]. Предлагаемый нами метод позволяет производить количественный учет уровня чувствительности к бруцеллам и, соответственно, может быть использован для оценки напряженности поствакцинального иммунитета перед повторной иммунизацией против бруцеллеза.
Таким образом, предложенный метод лабораторной диагностики бруцеллеза, а также способ оценки напряженности поствакцинального иммунитета против бруцеллеза в условиях in vitro, является перспективным и может быть внедрен в практику лабораторных исследований при бруцеллезе как альтернатива пробе Бюрне и для определения показаний к вакцинации.
Список литературы
1. Безопасность работы с микроорганизмами I— II групп патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 / Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. — Вып. 3 (13). — М., 2003. — С. 67-144.
2. Богачева Н.В., Дармов И.В., Елагин Г.Д., Крючков А.В., Тихвинская О.В. Современные лабораторные методы оценки эффективности проведения иммунизации против опасных и особо опасных инфекций // Клиническая лабораторная диагностика. — 2011. — № 6. — С. 39-42.
3. Вершилова П.А., Чернышова М.И., Князева Э.Н. Патогенез и иммунология бруцеллеза. — М., 1974. — 271 с.
4. Галактионов В.Г. Иммунология. — М., 2004. — 528 с.
5. Инструкция по применению аллергена бруцеллезного жидкого (бруцеллина), раствор для вну-трикожного введения: № 01-11/198-06: утверждена Главным государственным санитарный врачом РФ Г.Г. Онищенко 22.11.06. — М., 2006.
6. Куличенко А.Н., Ракитина Е.Л., Пономарен-ко Д.Г., Логвиненко О.В., Рязанова А.Г. Использование теста активации базофилов с антрак-сином для лабораторной (in vitro) диагностики сибирской язвы // Проблемы особо опасных инфекций. — Вып. 3 (113). — С. 86-88.
7. Новиков П.Д., Новикова Н.Д. Диагностика аллергии в реакции выброса миелопероксидазы под влиянием аллергена // Иммунопатология,
аллергология, инфектология. — 2002. — № 1. — С. 63-68.
8. Иммунопатология и аллергология. Алгоритмы диагностики и лечения / под ред. Р.М. Хаито-ва. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. — 112 с.
9. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей: МУ 3.1.7.1189-03: утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003).
10. Ройт A., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: [пер. с англ.]. — М.: Мир, 2000. — 592 с.
11. Урбах В.Ю. Биометрические методы. — М.: Наука, 1964. — 410 с.
12. Almajid F.M. Lymphocyte activation test for diagnosis of seronegative brucellosis in humans // Indian J. Pathol. Microbiol. — 2011. — Vol. 54(4). -P. 775-781.
13. Bercovich Z. The use of skin delayed-type hypersensitivity as an adjunct test to diagnose brucellosis in cattle: a review // Vet Q. — 2000. — Vol. 22(3). — P. 123-130.
14. Boura P., Skendros P., Kountouras J., Zachariou-daki E., Tsapas T. Effect of bacterial extracts on the immunologic profile in chronic relapsing brucellosis patients // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. — 1999. — Vol. 12(2). — P. 103-111.
15. De Weck A.L., Sanz M.L., Gamboa P.M., Jer-mann J.M., Kowalski M., Medrala W., Sainte-Laudy J., Schneider M.S., Weber J.M., Wolanczyk-Medrala A. Nonsteroidal anti-inflammatory drug hypersensitivity syndrome: a multicenter study. II. Basophil activation by nonsteroidal anti-inflammatory drugs and its impact on pathogenesis // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. — 2010. — Vol. 20(1). — P. 39-57.
