CC BY
68
Original articles
Оригинальные статьи
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet Инфекция и иммунитет
2015, vol. 5, no. 3, pp. 265-272 2015, Т. 5, № 3, с. 265-272
НОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ ВИРУСА ГЕПАТИТА B К АНАЛОГАМ НУКЛЕОЗ(Т)ИДОВ M204I/V У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ B
Е.А. Елпаева, А.Б. Комиссаров, М.М. Писарева, М.П. Грудинин, О.И. Киселев
ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Для лечения хронического гепатита В (ХГВ) широко используются аналоги нуклеоз(т)идов (АН), такие как ламивудин (ЛАМ), телбивудин (ТБВ), адефовир (АДФ), энтекавир (ЭНТ). Однако длительное применение этих препаратов часто приводит к развитию лекарственной устойчивости. Наиболее часто встречаются замены метионина на валин в 204 положении обратной транскриптазы (rtM204V), либо метионина на изо-лейцин (rtM204I). Раннее выявление мутаций устойчивости к АН имеет большое значение для определения стратегии лечения пациентов с ХГВ. В настоящее время существует много высокочувствительных технологий обнаружения мутаций устойчивости, таких как секвенирование нового поколения, метод обратной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов (LiPA), масс-спектрометрический метод. Однако эти методы требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, поэтому их использование в клинических лабораториях пока не получило широкого применения. Целью данной работы было разработать простой и точный метод для определения мутации rtM204I/V, основанный на ПЦР в реальном времени. Разработанный метод показал высокую специфичность и чувствительность (1000 копий/мл), он менее трудоемок, не нуждается в дополнительном оборудовании, более быстрый и экономичный в сравнении с другими методами. Мутации устойчивости ВГВ к АН определяли в 5 группах пациентов с ХГВ. Пациенты первой группы получали монотерапию пегилированным интерфероном (n = 12), второй группы — ламивудином (n = 10), третьей группы — телбивудином (n = 7), четвертой группы — энтекавиром (n = 15). В пятую группу вошли пациенты, не получавшие противовирусную терапию (n = 3). Среди обследованных 47 пациентов с ХГВ распространенность мутаций в YMDD-мотиве полимеразы у пациентов, получавших ламивудин, составила 10%, энтекавир — 20%, телбивудин — 28%. У двух пациентов были выявлены последовательности YIDD/YVDD и у одного — YMDD/ YIDD. ПЦР-метод обнаружения мутаций устойчивости ВГВ rtM204I/V к АН с детекцией в режиме реального времени может быть использован для первичного скрининга пациентов с ХГВ, не отвечающих на лечение АН. Применение данного метода ограничит число образцов для углубленного изучения первичных и компенсаторных мутаций устойчивости к АН методом секвенирования. При сравнении разработанного метода с широко используемым секвенированием по Сенжеру, данный метод более быстрый, экономичный и способен выявлять минорные варианты популяции ВГВ.
Ключевые слова: вирус гепатита В, ПЦР, мутации, секвенирование, хронический гепатит В, аналоги нуклеоз(т)идов.
Адрес для переписки:
Елпаева Екатерина Александровна
197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17,
ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ.
Тел.: 8 (921) 584-76-90; 8 (812) 499-15-20.
E-mail: elpaeva@influenza.spb.ru
Библиографическое описание:
Елпаева Е.А., Комиссаров А.Б., Писарева М.М., Грудинин М.П., Киселев О.И. Новый метод определения мутации устойчивости вируса гепатита B к аналогам нуклеоз(т)идов M204I/V у пациентов с хроническим гепатитом B // Инфекция и иммунитет. 2015. Т. 5, № 3. С. 265-272. doi: 10.15789/2220-7619-2015-3-265-272
© Елпаева Е.А. и соавт., 2015
Contacts:
Ekaterina A. Elpaeva
197376, Russian Federation, St. Petersburg, Professor Popov str., 15/17, Research Institute of Influenza. Phone: +7 (921) 584-76-90; +7 (812) 499-15-20. E-mail: elpaeva@influenza.spb.ru
Citation:
Elpaeva E.A., Komlssarov A.B., Plsareva M.M., Grudinin M.P., Kiselev O.I. New method for determining hepatitis B virus resistance mutations M204I/V to nucleos(t)ide analogues in patients with chronic hepatitis B // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2015, vol. 5, no. 3, pp. 265-272. doi: 10.15789/2220-7619-2015-3-265-272
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-2015-3-265-272
NEW METHOD FOR DETERMINING HEPATITIS B VIRUS RESISTANCE MUTATIONS M204I/V TO NUCLEOS(T)IDE ANALOGUES IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS B
Elpaeva E.A., Komissarov A.B., Pisareva M.M., Grudinin M.P., Kiselev O.I.
Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation
Abstract. Analogues of nucleos(t)ides (AN) such as lamivudine (LAM), telbivudine (TBV), adefovir (ADP), entecavir (ENT) are widely used for the treatment of chronic hepatitis B (CHB). However, the prolonged treatment using these drugs often leads to the development of drug resistance. The most common substitutions in the reverse transcriptase are methionine for valine (rtM204V), or methionine for isoleucine (rtM204I) at position 204. Early AN-resistant mutations detection is of great importance to determine the treatment strategy of patients with CHB. Currently there are many highly sensitive methods for detection of drug resistance mutations, such as next-generation sequencing, reverse hybridization-based line probe assay (LiPA), mass spectrometry. However, these methods require expensive equipment and reagents, and they are not widely used in clinical laboratories. The aim of this study was to develop a simple and accurate real-time PCR method for detection of rtM204I/V mutation. This method showed high specificity and sensitivity (1000 copies/ml), it is less laborious and does not require additional equipment, fast and cost effective compared to other methods. HBV mutations of resistance to AN were determined in 5 groups of patients with CHB. Patients of the first group received monotherapy with pegylated interferon (n = 12), the second group — lamivudine (n = 10), the third group — telbivudine (n = 7), the fourth group — entecavir (n = 15). The fifth group consisted of patients who did not receive antiviral therapy (n = 3). The frequency of mutations in HBV polymerase YMDD-motif was determined among 47 patients with CHB: it was 10% for lamivudine treated patients, 20% — for entecavir, 28% — for telbivudine. YIDD/YVDD motifs were identified in two patients and YMDD/YIDD — in one patient. Real-time PCR method for the detection of AN-resistant rtM204I/V mutations in HBV polymerase can be used in routine diagnostics for primary screening of patients not responding to AN treatment. The application of this method can reduce the number of samples for in-depth study of primary and compensatory mutations of resistance to AN by sequencing method. The developed method versus Sanger-sequencing is fast, economical, and provides the detection of minor variants of HBV populations.
Key words: hepatitis B virus, real-time PCR, mutations, sequencing, chronic hepatitis B, аnalogues of nucleos(t)ides.
Введение
Для лечения хронического гепатита В широко используются аналоги нуклеозидов/ну-клеотидов (АН), такие как ламивудин (ЛАМ), телбивудин (ТБВ), адефовир, энтекавир (ЭНТ). Однако длительное применение этих препаратов приводит к развитию лекарственной устойчивости [5, 8, 10].
Мутации устойчивости к АН определяются, прежде всего, заменами в высоко консервативном мотиве тирозин—метионин—аспарагиновая кис-лота—аспарагиновая кислота (УМОВ) С-домена полимеразы ВГВ (Л203-206). Наиболее часто встречаются замены метионина на валин в 204 положении обратной транскриптазы (ЛМ204У), либо метионина на изолейцин (ЛМ2041) [9, 14]. Раннее выявление мутаций устойчивости к АН имеет большое значение для определения стратегии лечения пациентов с ХГВ [2].
В настоящее время существует много высокочувствительных технологий обнаружения мутаций устойчивости, таких как секвенирование нового поколения [7], метод обратной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов (ИРА) [11], масс-спектрометрический метод [12], технология микрочипов [6]. Однако эти методы требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, поэтому их использование в клинических лабораториях пока не получило широкого применения. В 2013 году стала доступна отечественная коммерческая тест-система для
выявления мутаций устойчивости к АН «Ам-плиСенс® HBV-Resist-Seq». Этот метод основан на амплификации фрагмента гена полимеразы с последующим определением нуклеотидной последовательности методом секвенирования по Сенжеру. Однако данный метод имеет ряд недостатков. Во-первых, трудоемкость и использование ДНК-анализатора приводит к высокой конечной стоимости анализа. Во-вторых, невозможность определить минорные варианты популяции вируса, а также присутствие в одном образце различных вариантов ВГВ.
Использование метода ПЦР в реальном времени для выявления мутаций устойчивости в рутинной диагностике оправдано для первичного скрининга пациентов, не отвечающих на лечение АН. Однако для назначения соответствующей терапии у пациентов с заменой ЛМ2041/У необходимы данные о других заменах в области обратной транскриптазы, что может быть исследовано другими методами [1, 2, 10].
Материалы и методы
Обследовано 47 пациентов с ХГВ. Мутации устойчивости ВГВ к АН определяли в 5 группах пациентов с ХГВ. Пациенты первой группы получали монотерапию пегилированным интерфероном (PEG-IFN), средний возраст в этой группе составил 38±17,3 лет, соотношение мужчин и женщин — 10 (83%) к 2 (17%); пациенты второй группы [средний возраст 23,9+16,6 лет,
ТАБЛИЦА 1. СХЕМА ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЦР
'—■——____Аминокислота Праймер ' ——^^^ Метионин (M, Met) Изолейцин (I, Ile) Валин (V, Val)
Pr1 ПЦР(-) ATN ПЦР(-) ATN ПЦР(+) GTN
Pr2 ПЦР(+) ATG ПЦР(-) ATH ПЦР(+) GTG
ПЦР(-) GTH
по половому составу: мужчин — 7 (70%), женщин — 3 (30%)] принимали ламивудин (ЛАМ), пациенты третьей группы [средний возраст 36,7+14,4 лет, мужчин — 5 (86%), женщин — 1 (14%)] — телбивудин (ТБВ); пациенты четвертой группы [средний возраст 33,8+11,3 лет, мужчин — 10 (67%), женщин — 5 (33%)] — энте-кавир (ЭНТ). В пятую группу [средний возраст 43+17 лет, мужчин — 2 (67%), женщин — 1 (33%)] вошли пациенты, не получавшие противовирусную терапию (ПВТ).
ПЦР в реальном времени. Для определения мутаций устойчивости к аналогам нуклеозидов был разработан метод, основанный на ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ). При дизайне оригинальных праймеров был модифицирован метод выявления YMDD-мутан-тов, использующий универсальную матрицу для ПЦР-РВ [4, 13, 15].
Мутации устойчивости к АН определяли при помощи набора реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green (НПК «СИНТОЛ», Россия). ПЦР смесь (смесь-1) содержит реакционный буфер с SYBR Green, 200 мкМ каждого dNTP, 3 мМ MgCl2, 2 ед. Taq-полимеразы, 100 пкМ праймера PrF (5'-ATACAACACCTGTATTCCC ATCCCAT). Образец ДНК вносили параллельно в 3 пробирки, содержащие смесь-1 и прай-меры Pr1 (5 '-CCCCCAATACCACATCATCNAC), Pr2 (5 '-CCCCCAATACCACATCATCC) и PrC (5'-CCCCCAATACCACATCATC) соответственно. Праймеры Pr1 и Pr2 подобраны таким образом, чтобы выявить замену в YMDD-мотиве гена по-лимеразы (табл. 1). Праймер PrC является положительным контролем на наличие ДНК ВГВ и не зависит от наличия или отсутствия мутации.
Амплификацию проводили в термоциклере Rotor-Gene (Corbett Research, Австралия). Термальный профиль реакции: 1) начальная денатурация 95°С — 5 мин; 2) 95°С — 15 с, 62°С — 20 с, 62°С — 20 с (измерение флуоресценции на каждом цикле), уменьшение температуры отжига праймеров (Touch Down) с шагом 1°С, 7 циклов; 3) 95°С — 15 с, 55°С — 20 с, 62°С — 20 с (измерение флуоресценции на каждом цикле), 30 циклов. По окончании реакции была построена кривая плавления в диапазоне от температуры отжига праймеров до температуры полной денатурации — примерно 95°С.
Расчет эффективности ПЦР проводили по формуле E = 10-1/K, где Е — показатель эффективности ПЦР, K — угол наклона прямой зависимости разведения ДНК от значения Ct.
Клонирование последовательностей ДНК, кодирующих YMDD/YIDD/YVDD-мотивы в вектор pUC18. Клонирование последовательностей ДНК, кодирующих M, I и V в 204 положении обратной транс-криптазы, в вектор pUC18 проводили по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII. Рестрикционную смесь очищали при помощи коммерческого набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, США). Для проведения реакции лигирования использовали реагенты фирмы «Fermentas» (Литва). Для трансформации плазмидами pUC18-YMDD, pUC18-YVDD и pUC18-YIDD были использованы бактериальные клетки E. coli штамм DH5a, который выращивали на питательной среде LB (Luria-Bertani) с ампициллином (50 мкг/мл). Плазмидную ДНК выделяли набором QIAGEN Plasmid Kit (Qiagen, США). Полученную плазмидную ДНК секвени-ровали методом Сэнжера при помощи праймеров M13F и M13R.
Секвенирование. Амплификацию фрагмента генома ВГВ для определения мутаций проводили с помощью оригинальных прайме-ров (YMDD-F: 5'-CTCCAATCACTCACCAAC; YMDD-R: 5'-GGGTTTAAATGTATACCCA) методом, разработанным в НИИ гриппа [2]. Анализ и очистку продуктов ПЦР для секвенирования проводили электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с добавлением бромида этидия. ДНК из ага-розного геля выделяли коммерческим набором QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). Секвенирование проводили методом Сэнжера при помощи набора реагентов ABI prism BigDye Terminator v3.1 Kit с использованием оригинальных праймеров на приборе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, США). Анализ последовательностей и построение выравниваний проводили с помощью программы Vector NTI 10 Advance (Invitrogen, США).
Результаты
Специфичность метода
Для оценки специфичности праймеров были сконструированы плазмиды pUC18 со вставкой из последовательностей ДНК, кодирующих M, I и V в 204 положении обратной транскриптазы. Наличие вставки в данных плазмидах было подтверждено секвенированием с использованием праймеров M13F и M13R. Расчет статистически достоверной разницы в среднем значении Ct для pUC-18-YMDD [разница достоверна между Pr1 и Pr2 (P = 0,0079), между Pr1 и PrC (P = 0,0079)
рг2 / ргС / / Р'1
порог. /
5 10 15 20 цикл 25 30
¡Мю0* ю-"
3 Ю-'»
ф
£
5 10" I ю-2» 10""
15 цикл
ргС рг2/ V / /рП
i / /
vn/ / / / ргС / рг2
\ / / / / / /
/ /
et 10
Ct ю
YMDD
iu
pr1 pr2 prC YIDD
Iii
Рисунок 1. Специфичность праймеров для анализа мутаций утойчивости гШ204!^ и расчет статистически достоверной разницы в значении Ф для pUC-18-YMDD, pUC-18-YIDD и pUC-18-YVDD Примечание. Амплификация плазмид pUC-18-YMDD в концентрации 104 копий/мл (а), pUC-18-YIDD в концентрации 103 копий/мл (б), pUC-18-YVDD в концентрации 103 копий/мл (в). Средние значения И для pUC-18-YMDD (г), для pUC-18-YIDD (д), для pUC-18-YVDD (е).
и не достоверна между Рг2 и РгС (Р > 0,9999)], риС-18-УГОВ [разница достоверна между Рг1 и РгС (Р = 0,0079), между Рг2 и РгС (Р = 0,0079) и не достоверна между Рг1 и Рг2 (Р = 0,1429)] и риС-18-УУВВ [разница достоверна между Рг1 и Рг2 (Р = 0,0079), между Рг2 и РгС (Р = 0,0079) и не достоверна между Рг1 и РгС (Р > 0,9999)] позволил определить положительные результа-
ты ПЦР: для риС-18-УЫББ ДСП > 5, Л&2 < 5; для риС-18-УГОБ ДСП > 5, Д&2 > 5; для риС-18-УУББ ДСП < 5, Д02 > 5, где ДСП = С Рг1-С РгС, Д02 = О Рг2—С1 РгС. Результаты представлены на рисунке 1.
Для оценки специфичности праймеров в образцах, содержащих различные варианты ВГВ, плазмиды риС-18-УГОБ и риС-18-УУББ были смешаны с плазмидой риС-18-УМВВ («дикий тип») в конечной концентрации 105 копий/мл (табл. 2). Было показано, что праймеры, выявляющие замену ЛМ204У специфичны, если образец содержит 30 и более процентов плазмиды риС-18-УУВВ. В случаях, если образец содержит 10 и менее процентов плазмиды риС-18-УУВВ замена ЛМ204У не выявляется, а регистрируется только «дикий» тип вируса. Праймеры, выявляющие замену ЛМ2041, показали аналогичные результаты. Было показано, что в образцах, содержащих три плазмиды: 30% риС-18-УГОВ, 30% риС-18-УУББ и 40% риС-18-УМББ, выявлялись три варианта последовательности ВГВ (ЛМ204М/1/У) с преобладанием «мутантных» типов вируса (ЛМ2041 и ЛМ204У). В образцах, содержащих 60% риС-18-УМББ, 30% риС-18-УУББ и 10% риС-18-У1ББ, регистрировались только последовательности с заменой ЛМ204У
ТАБЛИЦА 2. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРАЙМЕРОВ В ОБРАЗЦАХ СО СМЕШАННОЙ ПОПУЛЯЦИЕЙ ВИРУСА
№ Образец Итоговый результат
1 50% pUC-18-YVDD + 50% pUC-18-YMDD M/V
2 30% pUC-18-YVDD + 70% pUC-18-YMDD M/V
3 10% pUC-18-YVDD + 90% pUC-18-YMDD M
4 50% pUC-18-YIDD + 50% pUC-18-YMDD M/I
5 30% pUC-18-YIDD + 70% pUC-18-YMDD M/I
6 10% pUC-18-YIDD + 90% pUC-18-YMDD M
7 30% pUC-18-YIDD + 30% pUC-18-YVDD + 40% pUC-18-YMDD V/I/M
8 10% pUC-18-YIDD + 30% pUC-18-YVDD + 60% pUC-18-YMDD M/V
9 30% pUC-18-YIDD + 10% pUC-18-YVDD + 60% pUC-18-YMDD M/I
и «дикий» тип вируса. Аналогично, в образцах, содержащих 60% риС-18-УМББ, 30% риС-18-У1ББ и 10% риС-18-УУББ, выявлялись только последовательности с заменой ЛМ2041 и «дикий» тип вируса.
Чувствительность метода
Чувствительность метода ПЦР оценивали с помощью серии разведений плазмид риС-18-УМББ, риС-18-У1ББ и риС-18-УУББ до конечных концентраций 1 млн, 100 тыс., 10 тыс., 1 тыс. и 100 копий/мл (пять повторов для каждого разведения). Результаты представлены на рисунках 2—4.
Расчет эффективности ПЦР
Во всех исследуемых образцах для серии разведений был рассчитан показатель эффективности ПЦР(Е). Во всех случаях Е = 2, что подтверждает специфичность данных реакций без образования побочных продуктов или димеров праймеров (рис. 2—4). Отсутствие побочных продуктов также подтверждает анализ кривых плавления для данных реакций (данные не приводятся).
Сравнение результатов ПЦР и секвенирования по Сенжеру
В сыворотке крови от пациентов первой и пятой групп вирусов, содержащих мутации устойчивости Г1М2041/У к АН, выявлено не было (табл. 3). В сыворотке крови от пациентов второй группы у одного человека после 18 месяцев лечения ламивудином были выявлены вирусы с заменой в 204 положении обратной транскрип-тазы. Причем методом секвенирования по Сен-жеру была определена только замена метиони-на на изолейцин, в то время как методом ПЦР в реальном времени выявлена смесь последовательностей, кодирующих как замену метионина на изолецин, так и — на валин. Данный пациент после неэффективной терапии ламивудином получал в течение 14 месяцев телбивудин, что привело к выявлению вирусов только с заменой ЛМ204У обоими методами. Интересно отметить, что через месяц лечения телбивудином у этого пациента методом секвенирования обнаружена субпопуляция ВГВ с заменой ЛМ204У, в то время как методом ПЦР выявляли ВГВ с заменами метионина и на изолейцин, и на валин. У одного пациента после 58 месяцев лечения ТБВ была
Рисунок 2. Чувствительность и анализ эффективности метода ПЦР для плазмиды pUC-18-YMDD в концентрациях 106, 105, 104, 103, 102 копий/мл
Примечание. (а) Амплификация с праймерами PrF и Pr1, стандартные кривые: Y = -3X+20. Slope = -3. R2 = 1. E = 2.
(б) Амплификация с праймерами PrF и Pr2, стандартные кривые: Y = -2,8X+16,6. Slope = -2,8. R2 = 0,99. E = 2.
(в) Амплификация с праймерами PrF и prC, стандартные кривые: Y = -2,8X+16,6. Slope = -2,8. R2 = 0,99. E = 2.
обнаружен вирус с заменой ЛМ2041, причем методом ПЦР кроме «мутантного» был обнаружен и «дикий» тип вируса. Еще через 7 месяцев у данного пациента обоими методами обнаруживался только «мутантный» тип вируса (г1М2041). У трех пациентов четвертой группы были выявлены вирусы, содержащие мутации устойчивости к энтекавиру (ЛМ204У).
Обсуждение
В последние десятилетия в России для лечения ХГВ широко применяются аналоги нуклео-зидов (ламивудин, телбивудин и энтекавир). Однако длительная терапия данными препаратами в ряде случаев не была эффективна из-за возникновения мутации устойчивости Г1М2041/У, которые разрушают УМОВ (тирозин, метионин, аспартат, аспартат) локус в каталитическом центре гена полимеразы и создают стерические препятствия для нужного связывания с АН [3, 10]. Применение аналогов нуклеотидов (адефовир и тенофовир) у пациентов с устойчивостью к ла-мивудину, телбивудину и энтекавиру показало высокую эффективность [2, 9]. В связи с этим,
раннее выявление мутаций устойчивости к АН имеет большое значение для определения стратегии лечения пациентов с ХГВ.
В последние годы все больше исследований связаны с разработкой новых методов для выявления мутаций устойчивости. К наименее трудоемким, быстрым и доступным методам относятся различные варианты проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [4, 13, 15]. Поэтому был разработан метод, основанный на ПЦР-РВ, для определения мутации устойчивости Г1М2041/У.
Разработанный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью (1000 копий/мл) и позволяет определять различные варианты популяции ВГВ. Было показано, что данный метод выявляет «мутантные» варианты вируса, составляющие 30% и более от общей популяции ВГВ.
Общая распространенность мутаций в УМВВ-мотиве полимеразы у пациентов, получавших ламивудин, составила 6%, энтекавир — 3%, телбивудин — 20%. У двух из 83 пациентов были выявлены последовательности УМВЦ/УГОВ и у одного человека — УГОЦ/УУВВ.
Рисунок 3. Чувствительность и анализ эффективности метода ПЦР для плазмиды pUC-18-YIDD в концентрациях 106, 105, 104, 103, 102 копий/мл
Примечание. (а) Амплификация с использованием праймеров PrF и Pr1, стандартные кривые: Y = -2,2X+24,4. Slope = -3,2. R2 = 0,99. E = 2. (б) Амплификация с использованием праймеров PrF и Pr2, стандартные кривые:
Y = -2,6X+21. Slope = -2,6. R2 = 0,93. E = 2. (в) Амплификация с использованием праймеров PrF и prC, стандартные кривые:
Y = -3,3X+20,1. Slope = -3,3. R2 = 0,98. E = 2.
Предложенный метод не позволяет дифференцировать последовательности для прямого определения ГМ2041. В дальнейшем данный метод может быть модифицирован для обнаружения УГОБ путем добавления праймеров в смесь-1. Преимуществом данного метода является простота анализа. Выявление последовательностей ВГВ с заменой ЛМ204У может быть рассчитано по разнице между С значения образца (Рг1) и контроля (РгС) без дополнительных количественных стандартов. Неспецифический отжиг праймеров, как рассчитано выше, исключается при значения АО < 5.
Заключение
Метод обнаружения мутаций устойчивости ВГВ ггМ2041/У к АН при помощи ПЦР в реальном времени — быстрый и точный инструмент для первичного скрининга пациентов с ХГВ, не отвечающих на лечение. При сравнении разработанного метода с широко используемым секвенированием по Сенжеру, данный метод более быстрый, экономичный и способен выявлять минорные варианты популяции ВГВ.
ТАБЛИЦА 3. КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ У БОЛЬНЫХ ХГВ
Замена rtM204I/V методом секвенирования по Сенжеру (n, %) Замена rtM204I/V методом ПЦР в реальном времени (n, %)
Группа I PEG-IFN, n = 12 M (12, 100%) M (12, 100%)
Группа II ЛАМ, n = 10 M (9, 90%) M (9, 90%)
I (1, 10%) V/I (1, 10%)
Группа III ТБВ, n = 7 M (5, 72%) M (5, 72%)
I (1, 14%) I/M (1, 14%)
I I
V (1, 14%) V/I (1, 14%)
V V
Группа IV ЭНТ, n = 15 M (12, 80%) M (12, 80%)
V (3, 20%) V (3, 20%)
Группа V без ПВТ, n = 3 M (3, 100%) M (3, 100%)
Ю00
10-м
3 IC"1'0
s
& 10IA
£
О Ю-*0
10"
10"3'0
Рисунок 4. Чувствительность и анализ эффективности метода ПЦР для плазмиды pUC-18-YVDD в концентрациях 106, 105, 104, 103, 102 , 101, 100, 10-1 копий/мл
Примечание. (а) Амплификация с праймерами PrF и Pr1, стандартные кривые: Y = -2,6X+23,5. Slope = -2,6. R2 = 0,99. E = 2.
(б) Амплификация с праймерами PrF и Pr2, стандартные кривые: Y = -2,7X+32. Slope = -2,7. R2 = 0,97. E = 2.
(в) Амплификация с праймерами PrF и prC, стандартные кривые: Y = -2,6X+22,9. Slope = -2,6. R2 = 0,99. E = 2.
Список литературы/References
1. Елпаева Е.А., Порецкова Е.А., Ковеленов А.Ю., Аликян И.С., Гальбрайх Р.Б., Грудинин М.П., Эсауленко Е.В. Гено-типическая характеристика вируса гепатита В у хронически инфицированных больных // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2009. № 15. С. 56—59. [Elpaeva E.A., Poretskova E.A., Kovelenov A.Yu., Alikyan J.S., Gal-braikh R.B., Grudinin M.P., Esaulenko E.V. Genotypic characterization of the hepatitis B virus in chronically infected patients. Dal'nevostochnyi zhurnal infektsionnoi patologii = Far Eastern Journal of Infection Pathology, 2009, no. 15, pp. 56—59. (In Russ.)]
2. Елпаева Е.А., Писарева М.М., Никитина О.Е., Кижло С.Н., Грудинин М.П., Дуданова О.П. Роль мутантных форм вируса гепатита B в прогрессирующем течении хронического гепатита В // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. Естественные и технические науки. 2014. Т. 143, № 6. С. 41—46. [Elpaeva E.A., Pisareva M.M., Nikitina O.E., Kizhlo S.N., Grudinin M.P., Dudanova O.P. The role of the mutant forms of hepatitis B virus in the progressive course of chronic hepatitis B. Uchenye zapiski Petrozavodskogo gosudarstvennogo universiteta. Estestvennye i tekhnicheskie nauki = Scientific Notes of Petrozavodsk State University. Natural and Engineering Sciences, 2014, vol. 143, no. 6, pp. 41—46. (In Russ.)]
3. Dandri M., Locarnini S. New insight in the pathobiology of hepatitis B virus infection. Gut, 2012, vol. 61, no. 1, pp. 6—17. doi: 101136/gutjnl-2012-302056
4. Feng Z.L., Yu X.Y., Lu Z.M., Geng D.Y., Zhang L., Chen S.J. Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo™ probes. Clin. Chim. Acta., 2011, vol. 412, iss. 11-12, pp. 1018-1021. doi: 10.1016/j.cca.2011.02.012
5. Gao S. Clinical relevance ofhepatitis B virus variants. World J. Hepatol, 2015, vol. 7, no. 8, pp. 1086-1096. doi: 10.4254/wjh.v7.i8.1086
6. Hua W., Zhang G., Guo S., Li W., Sun L., Xiang G. Microarray-based genotyping and detection of drug-resistant HBV mutations from 620 Chinese patients with chronic HBV infection Brazilian. J. Infect. Dis., 2015, vol. 19, no. 3, pp. 291-295. doi: 10.1016/ j. bjid.2015.03.012
7. Ko S.-Y., Oh H.-B., Park C.-W., Lee H.C., Lee J.-E. Analysis of hepatitis B virus drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep pyrosequencing. Clin. Microbiol. Infect., 2012, vol. 18, no. 10, pp. 404-411. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03951.x
8. Lin C.-L., Kao J.-H. Hepatitis B virus genotypes and variants. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2015, vol. 5, no. 5, pp. a021436-a021436. doi: 10.1101/cshperspect.a021436
9. Locarnini S., Yuen L. Molecular genesis of drug-resistant and vaccine-escape HBV mutants. Antivir. Ther., 2010, vol. 15, no. 3, pp. 451-461. doi: 10.3851/IMP1499
10. Locarnini S., Zoulim F. Molecular genetics of HBV infection. Antivir. Ther, 2010, vol. 15, no. 3, pp. 3-14. doi: 10.3851/IMP1619
11. Niesters H.G.M., Zoulim F., Pichoud C., Buti M., Shapiro F., D'Heuvaert N., Celis L., Doutreloigne J., Sablon E. Validation of the INNO-LiPA HBV DR assay (version 2) in monitoring hepatitis B virus-infected patients receiving nucleoside analog treatment. Antimicrob. Agents Chemother, 2010, vol. 54, no. 3, pp. 1283-1289. doi: 10.1128/AAC.00970-09
12. Rybicka M., Stalke P., Dreczewski M., Smiatacz T., Bielawski K.P. High-throughput matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry as an alternative approach to monitoring drug resistance of hepatitis B virus. J. Clin. Microbiol, 2014, vol. 52, no. 1, pp. 9-14. doi: 10.1128/JCM.01891-13
13. Shi M., Yang Z.J., Wang R.S., Zhang H., Zhu Y.F., Xu Y.P., Lin Q.Y., Jin L.J. Rapid quantitation of lamivudine-resistant mutants in lamivudine treated and untreated patients with chronic hepatitis B virus infection. Clin. Chim. Acta., 2006, vol. 373, iss. 1-2, pp. 172-175. doi: 10.1016/j.cca.2006.05.023
14. Stuyver L.J., Locarnini S.A., Lok A., Richman D.D., Carman W.F., Dienstag J.L., Schinazi R.F. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology, 2001, vol. 33, no. 3, pp. 751-757. doi: 10.1053/ jhep.2001.22166
15. Wang R.S., Zhang H., Zhu Y.F., Han B., Yang Z.J. Detection of YMDD mutants using universal template real-time PCR. World J. Gastroenterol, 2006, vol. 12, no. 8, pp. 1308-1311. doi: 10.3748/wjg.v12.i8.1308
Авторы:
Елпаева Е.А., научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
Комиссаров А.Б., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия; Писарева М.М., к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия; Грудинин М.П., к.б.н., зав. лабораторией молекулярной вирусологии и генной инженерии, зам. директора по науке и развитию ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия; Киселев О.И., академик РАН, д.б.н., профессор, директор ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия.
Поступила в редакцию 17.07.2015 Отправлена на доработку 22.07.2015 Принята к печати 13.08.2015
Authors:
Elpaeva E.A., Researcher of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation; Komissarov A.B., Senior Researcher of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation; Pisareva M.M., PhD (Biology), Leading Researcher of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation; Grudinin M.P., PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Deputy Director for Research and Development, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
Kiselev O.I., PhD, MD (Biology), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Director of the Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation.
Received 17.07.2015 Revision received 22.07.2015 Accepted 13.08.2015
