CC BY
23
УДК 616.33-018.25-078
с.Э. быков1, а.с. быков2, н.в. Барышникова3, о.ю. орлов4
1ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики», 199034, г. Санкт-Петербург, 18-я линия, д. 3, а/я № 9 2Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 190013, г. Санкт-Петербург, Московский проспект, д. 26
3Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова,
197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8
4Елизаветинская больница, 195257, г. Санкт-Петербург, ул. Вавиловых, д. 14
Новый метод инвазивной экспресс-диагностики наличия уреалитической микрофлоры в желудке
Быков сергей Эдуардович — ведущий специалист, тел. +7-921-400-22-78, e-mail: Bse_mail@mail.ru1 Быков Андрей сергеевич — аспирант кафедры молекулярной биотехнологии, тел. +7-911-976-27-80, e-mail: bas1976@mail.ru2 Барышникова Иаталия Владимировна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры внутренних болезней стоматологического факультета, тел. +7-921-301-33-77, e-mail: baryshnikova_nv@mail.ru3
Орлов Олег Юрьевич — заведующий отделением эндоскопии, тел. +7-921-991-04-77, e-mail: endodoc@inbox.ru4
Предлагается метод определения наличия уреазапродуцирующей микрофлоры в желудке, не требующий исследования биопсийного материала, но по своей априорной чувствительности и специфичности приближающейся к 100%. Диагностический результат представляется в течение 15-20 минут. Метод основан на прямом ополаскивании стенок желудка раствором карбамида во время проведения гастродуоденоскопии. Основанием для диагностического заключения служит достоверное различие эмпирических распределений концентрации NH3 в воздухе ротовой полости, полученных непосредственно до и после проведения эндоскопии.
Ключевые слова: уреазная микрофлора, диагностика, новый метод, Helicobacter Pylori.
s.E. BYKoV1, A.s. BYKoV2, N.V. baryshnikova3, o.Yu. oRLoV4
1LLC «Association of Medicine and Analytics», 3 18th line, P.O. box № 9, St. Petersburg, Russian Federation, 199034 2St. Petersburg State Technological Institute (technical university), 26 Moskovskiy Avenue, St. Petersburg, Russian Federation, 190013
3First St. Petersburg State Medical University named after I.P. Pavlov, 6-8 Lev Tolstoy St., St. Petersburg, Russian Federation, 197022
4Elizavetinskaya hospital, 14 Vavilovykh St., St. Petersburg, Russian Federation, 195257
A new method of invasive instant diagnosis of the presence of urealitic microflora in the stomach
bykov s.E. — leading specialist, tel. +7-921-400-22-78, e-mail: Bse_mail@mail.ru1
bykov A.S. — postgraduate student of the Department of molecular biotechnology, tel. +7-911-976-27-80, e-mail: bas1976@mail.ru2 baryshnikova N.V. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of internal diseases of the Dental Faculty, tel. +7-921-301-33-77, e-mail: baryshnikova_nv@mail.ru3
Qrlov o.Yu. — Head of Endoscopy Department, tel. +7-921-991-04-77, e-mail: endodoc@inbox.ru4
In this article there is a method determining the presence of urease-producing microflora in the stomach, which does not require the study of biopsic material, but being approximate to100% with its priori sensitivity and specificity. Diagnostic result is presented in 15-20 minutes. The method is based on the direct rinsing of stomach walls with urea solution during gastroduodenoscopy. Diagnostic conclusion is based on the significant difference between the empirical distributions of NH3 concentration in the oral cavity air obtained immediately before and after endoscopy.
Key words: urease microflora, diagnosis, new method, Helicobacter Pylori.
Введение
Обычными в практике инвазивного определения присутствия уреалитической микрофлоры в желудке (чаще всего речь идет о Helicobacter Pylori) являются методы, использующие образцы биопсии, полученные во время проведения гастродуодено-скопии. К таким методам относятся гистопатологи-ческое обследование, экспресс-тест уреазы (RUT), изоляция возбудителя культурой.
Отрицательные результаты таких исследований всегда оставляют сомнения в отношении точности выполненной прицельной биопсии и, следовательно, в адекватности диагностического заключения. Кроме этого, работа с биопсийным материалом может потребовать (как в случае гистологического или культурально-го исследований) продолжительного времени из-за процедурных регламентных ограничений микробиологического исследования, что задерживает начало специфического лечения.
Нами предлагается метод определения наличия уреазапродуцирующей микрофлоры в желудке, по своей ожидаемой чувствительности и специфичности приближающейся к 100%, не требующий исследования биопсийного материала и позволяющий получить окончательное заключение в течение однократного приема пациента.
В основе предлагаемого метода лежит хорошо известная способность фермента уреазы к положительному катализу гидролиза мочевины с образованием CO2 и NH3. Поскольку субстрат мочевина гидролизуется только в присутствии фермента уре-азы, а уреаза в гастродуоденальной области имеет исключительно бактериальное происхождение, то обнаружение присутствия уреалитических бактерий можно осуществить с помощью прямого воздействия раствором мочевины на всю внутреннюю поверхность желудка, совместив его с контролем уровня выделяемого аммиака до и после проведения ополаскивания. Понятно, что концентрация субстрата и его объем должны быть достаточными, чтобы обеспечить статистически значимый уровень прироста аммиака над фоновым значением при наличии в гастродуоденальной зоне бактериальной уреазы. При этом, говоря о приросте концентрации NH3, мы имеем в виду определение ее в воздухе ротовой полости, где она должна измениться в результате постоянно существующего орально-гастрального газового обмена. Вопросы механизма перемещения индуцированного в гастральнодуоденальной зоне аммиака подробно рассматривались в [1].
Материалы и методы
Для изучения работоспособности предлагаемого метода, нами случайным отбором была образована группа из 14 пациентов (8 — женщин, 6 — мужчин) гастроэнтерологического отделения стационара в возрасте от 20 до 76 лет. Каждому из пациентов была проведена гастродуоденоскопия с изъятием двух биоптатов по одному из антрального отдела и тела желудка. На заключительном этапе эндоскопического исследования, каждому из пациентов было проведено ополаскивание стенок желудка 1% водным раствором карбамида в объеме 50 мл. До проведения эндоскопии и непосредственно после
ее окончания, у каждого из пациентов непрерывно в течение 9 минут измерялся уровень аммиака в воздухе ротовой полости при назальном дыхании. Измерения проводились с помощью газоанализатора со встроенным вакуумным насосом, обеспечивающим принудительный отбор аналитической пробы воздуха (рис. 1).
Рисунок 1.
Ополаскивание стенок желудка раствором карбамида при эндоскопическом исследовании гастродуоденальной зоны с предварительным и последующем контролем уровня концентрации NH3 в воздухе ротовой полости
Регистрация значений концентрации NH3 осуществлялась 1 раз в секунду в течение всего периода измерения. Таким образом, для каждого пациента были получены две выборки наблюдений базаль-ного и нагрузочного уровня концентрации аммиака, каждая по 540 значений.
Статистически значимое различие полученных таким образом двух эмпирических распределений интерпретировалось как подтверждение инспирирования процесса продукции аммиака в гастродуо-денальной зоне в результате гидролиза карбамида в присутствии бактериальной уреазы. Изъятый би-опсийный материал подвергался гистологическому анализу на присутствие инфекционного агента Helicobacter Pylori.
Результаты
По результатам гистологического исследования биоптатов установлено, что 9 из 14 пациентов (64.3%) оказались инфицированными бактерией Helicobacter Pylori при разной степени обсеменен-ности. По результатам исследования изменений в воздухе ротовой полости установлено, что статистически достоверный (p<0.001) прирост концентрации аммиака наблюдался у 12 из 14 пациентов (85.7%). Результаты диагностических исследований приведены в таблице 1.
Из таблицы 1 следует, что прирост концентрации NH3 в воздухе ротовой полости отмечался как в групп3е с положительным, так и в группе с отрицательным HP статусом, установленным по данным гистологического исследования биоптатов. И в том и другом случае этот прирост достоверно (p<0.05) отличается от нуля, при этом величина прироста в группе HP+ пациентов в 2.6 раза выше, чем в группе HP- пациентов (рис. 2).
Наличие достоверного прироста концентрации NH3 в группе с HP+ статусом не вызывает удивления, в то время как статистически значимый прирост в группе с HP- статусом означает, что в эту группу вошли пациенты, инфицированные гастральной уреалитической микрофлорой.
Измерение концентрации аммиака в воздухе ротовой полости для одного из таких пациентов приведено на рисунке 3. По данным гистологического анализа биоптатов пациент отнесен к группе HP-,
1ИНФЕЩИ0ННЫ Е Б 0ЛЕ ЗНИ. АНТИМИКРОБНАЯ ТЕРАПИ Я
Таблица 1.
Результаты диагностических исследований по двум критериям
Критерий: Гистологический анализ биоптатов (Helicobacter Pylori) Всего
(+) (-)
Критерий: Достоверное изменение концентрации Ш3 в воздухе ротовой полости ^<0.001) (+) Кол. случаев 8 4 12
Баз. уровень 37,8 39,5 38,3
Прирост 10,1 5,5 8,8
(-) Кол. случаев 1 1 2
Баз. уровень 31,7 32,9 32,5
Прирост -0,6 0,5 0,1
Всего Кол. случаев 9 5 14
Баз. уровень 37,2 36,9 37,6
Прирост 8,8 3,4 6,4
Рисунок 2.
Изменение концентрации NH3 в воздухе ротовой полости для пациентов с различным НР статусом
однако ополаскивание желудка раствором карбамида привело к достоверному повышению уровня концентрации аммиака в воздухе ротовой полости, что свидетельствует об инспирировании процесса гидролиза карбамида гастральной уреазой. Характер гидролитической реакции, отмеченный малым временем наступления, продолжительностью протекания и объемом выделенного аммиака, указывает на продуцента уреазы — бактерию Helicobacter Pylori. Повышение уровня аммиака в рассматриваемом случае оказалось статистически достоверным с доверительной вероятностью не менее 99.9%.
Анализ результатов
Первое, что обращает на себя внимание, это стабильный выход свободного аммиака из желудка в ротовую полость. Несмотря на то, что пищевод является «закрытым» органом, представляющим при газовом обмене значительное пневматическое сопротивление, а аммиак обладает высокими абсорб-
ционными свойствами, возникающие потери не являются фатальными. При использовании базаль-ных и нагрузочных определений концентрации NH3, удается показать ее достоверный прирост даже при очень высоком уровне доверия (p<0.001). Этот факт должен рассеять скептицизм некоторых исследователей относительно аммиака в воздухе ротовой полости как маркера наличия гастральной уреалитической микрофлоры.
Второе обстоятельство, на которое следует обратить особое внимание, это то, что, в случае проведения ополаскивания стенок желудка раствором карбамида, частота «положительных» результатов (0.86), свидетельствующих о протекании процесса гидролиза карбамида в гастродуоденальной области, превосходит частоту обнаружения инфекционного агента при гистопатологическом исследовании (0.64). Это ожидаемый результат. Ополаскивание внутренней поверхности стенок желудка обеспечивает полный и непосредственный контакт субстрата и фермента по всей поверхности возможного распределения бактериальной уреазы. В этой связи показательным является исследование, результаты которого приведены на рисунке 3. Гистологический анализ био-птатов не выявил присутствия бактерии Helicobacter pylori, в то время как метод прямого ополаскивания стенок желудка инспирировал процесс гидролиза карбамида гастральной уреазой. Этот факт установлен по достоверному (p<0.001) приросту аммиака в воздухе ротовой полости.
Далее, для доказательства протекания реакции гидролиза мочевины, нами использовался строгий статистический критерий различия двух эмпирических распределений, а именно метод наложения доверительных границ для среднего значения. Следует заметить, что в этом случае можно использовать любые другие односторонние статистические
инфЕкционныЕ болезни. антимикробная терапи
Рисунок 3.
Динамика концентрации NH3 в воздухе ротовой полости до и после ополаскивания стенок желудка раствором карбамида для пациента с HP" статусом (по результатам гистологического анализа биоптатов)
критерии различия средних значений как ранговые, так и параметрические. Использование строгого статистического критерия в алгоритме принятия диагностического заключения является весьма привлекательной стороной предлагаемого метода. Это гарантирует его универсальность и точное понимание степени надежности принимаемого заключения.
Важным обстоятельством является также использование для ополаскивания концентрированного раствора карбамида (1%) в объеме 50 мл. Это обеспечивает высокий и длительный по времени выход конечного продукта (1^Н3) ферментативной реакции гидролиза карбамида при наличии в гастродуоде-нальной зоне фермента уреазы.
Выводы
1. Предложен новый метод инвазивной экспресс-диагностики наличия уреалитической микрофлоры в гастродеуденальной зоне у пациентов, обследуемых гастродуоденоскопическим методом. Проведение биопсии при этом не требуется.
2. Предлагаемый метод имеет априорно более высокую чувствительность по отношению к гистологическому методу, поскольку предполагает масси-
рованное воздействие раствором карбамида на всю бактериальную уреазу гастродуоденальной зоны желудочно-кишечного тракта.
3. Использование предлагаемого метода позволяет быстро (в течении 15-30 минут) сделать заключение о наличии уреалитической микрофлоры в гастродуоденальной зоне.
4. Диагностическое заключение делается на основе использования точного статистического критерия, что гарантирует его объективность и универсальность. Применение статистического критерия позволяет установить также доверительную вероятность принятого решения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Быков А.С., Быков С.Э., Барышникова Н.В., Гинак А.И. Модель транспорта аммиака из желудка в ротовую полость при гидролизе карбамида в присутствии гастральной уреазы // Практическая медицина. - 2014. - № 1 (77). - С.133-137.
REFERENCES
1. Bykov A.S., Bykov S.E., Baryshnikova N.V., Ginak A.I. Model transport of ammonia from the stomach into the mouth by the hydrolysis of urea in the presence of gastric urease. Prakticheskaya meditsina, 2014, no. 1 (77), pp.133-137 (in Russ)
ИНФЕКЦИОННЫЫ E Б ОЛЕ ЗНИ. АНТИМИКРОБНАЯ ТЕРАПИ
я
