НОВЫЙ КЛЕТОЧНЫЙ ТРОМБОЦИТАРНЫЙ РЕГЕНЕРАТИВНЫЙ МЕТОД ТЕРАПИИ АЛОПЕЦИЙ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Новый клеточный тромбоцитарный регенеративный метод терапии алопеций

Клюкин Максим Германович,

врач-дерматовенеролог, косметолог, онколог, трихолог, Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городской кожно-венерологический диспансер» E-mail: maximed@list.ru

Обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) используется в три-хологии с 2000-х годов. Однако, отсутствует четкое понимание о содержании тромбоцитов в плазме. Истинной обогащенной тромбоцитами плазмой (PRP) может считаться та плазма, содержание тромбоцитов в которой более 1000 в мл. Известны методики обогащения плазмы тромбоцитами с различными коагулянтами. Наиболее значимыми коагулянтами в пробирках являются ACD-A, EDTA. Однако, при центрифугировании они показывают недостаточную концентрацию тромбоцитов при центрифугировании. В наших исследованиях мы сравнили уровень тромбоцитов после центрифугирования нативной крови в пробирках с ACD-A, EDTA и по предложенной нами методике и провели статистический анализ полученных результатов. По нашим наблюдениям наилучшим коагулянтом для получения максимальной концентрации тромбоцитов является EDTA. Кроме того, предложенная нами методика обогащения позволяет добиться максимальной концентрации тромбоцитов более 1.000.000 в мкл без использования плазмы крови.

Ключевые слова: тромбоцитарная терапия, PRP, плазмоте-рапия, выпадение волос, алопеция, лечение выпадения волос.

Мы всегда стараемся найти наилучшие способы терапии волос, оптимизировать подходы к терапии, и определить методы, которые превосходят существующие методики. В 2018 году наши коллеги из отделения лаборатории Экспериментального тромбоза и отделения экспериментальной патологии института Национальной Академии, Департамента биотехнологий Школы фармакологии и биохимии провели масштабное исследование, в котором показали и открыли, что Плазма вмешивается в проангиогенную роль тромбоцитов, т.е. подавляет их функции. Плазма подавляет ангиогенез (рост новых сосудов), опосредованный тромбоцитами. Для этого они сравнили образование новых сосудов при воздействии чистыми Тромбоцитами, выделенными из крови и тромбоцитами в плазме в сходной концентрации. И оказалось с высоким уровнем доказательности (Р<0,01, т.е. «различия обнаружены на высоком уровне статистической значимости»), что образование сосудов в группе при воздействии чистыми тромбоцитами было значительно выше, чем в группе, получавших плазму с тромбоцитами. Кроме того, когда в группу получавших тромбоциты добавляли плазму, образование сосудистых клеток уменьшалось пропорционально количеству плазмы.[1]

Кроме того, нашими коллегами из Токио было показано, что пробирки с EDTA дают наибольшую концентрацию тромбоцитов.[2]

Известны методики получения плазмы с различной концентрацией тромбоцитов. Богатой тромбоцитами плазма считается, когда количество тромбоцитов после центрифугирования превышает концентрацию тромбоцитов в нативной крови. [4,5]. В случае когда количество тромбоцитов меньше, чем в нативной крови методика называется Плазмой, обедненной тромбоцитами (PPP - Platelet Pure Plasma). Методика в которой концентрация тромбоцитов приближается к нулевой называется Обедненной тромбоцитами плазмой. [6,7] Истинная PRP по Marx R.E. содержит концентрацию тромбоцитов более 1000 в мл или более 1000000в мкл[4,5]

Нам потребовалось немного времени, чтобы оптимизировать способ получения чистых тромбоцитов из крови пациентов, с максимальной концентрацией более 1000 в мл, а в некоторых случаях мы получали концентрацию более 1500 тромбоцитов в мл. И с 2018 года в клинической практике Мы с успехом используем Регенеративную Клеточную Тромбоцитарную Терапию в трихологии, результативность которой подтверждена статистически.

сз о

о Л о

о сз о в

в и

см со

Для исследования мы взяли кровь у 10 пациентов и определили количество тромбоцитов в цельной крови, после центрифугирования в пробирке с EDTA, после центрифугирования в пробирке ACD-A, и после центрифугирования в предложенной автором методике. Пробирки были разделены на группы, первая группа - нативное содержание тромбоцитов в крови у пациентов, вторая группа -содержание тромбоцитов после центрифугирования в пробирке с EDTA, третья группа - содержание тромбоцитов в пробирке с ACD-A, четвертая группа - содержание тромбоцитов в пробирке по предложенной автором методике. Исследование уровня тромбоцитов в крови проводилось при комнатной температуре на гематологическом анализаторе Sysmex. Далее мы провели статистический анализ концентрации тромбоцитов в пробирках и по нашей методике.

Результаты собственных исследований

Содержание тромбоцитов в цельной крови у пациентов в первой группе составило:

Полученные показатели содержания тромбоцитов в нативной крови приведены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание тромбоцитов в цельной крови у пациентов

Пациенты Количество тромбоцитов в мл

Пациент 1 226

Пациент 2 217

Пациент 3 274

Пациент 4 239

Пациент 5 176

Пациент 6 210

Пациент 7 178

Пациент 8 201

Пациент 9 204

Пациент 10 184

Результаты были статистически обработаны по критерию Колмогорова-Смирнова. Результаты показали, что значение статистического теста К^ Р) составляет 0,1903. Значение р = 0,99534. Данные существенно не отличаются от тех, которые обычно распространяются.

При статистическом анализе по Шапиро-Вилк ^арко^Ик) определяется, что данные распределены нормально. (рис 1).

Среднее арифметическое (а=211), Дисперсия 882.88889, Среднеквадратическое отклонение 29.71345, Коэффициент вариации 14.08%.

Число единиц наблюдения (п): 10. Средняя арифметическая (М): 211.20Медиана (Ме): 207Стандартное квадратичное отклонение (а): 29.91Коэффициент вариации (С^: 14.16%Сред-няя ошибка средней арифметической (т): 9.97

При центрифугировании крови в пробирки с ACD-A мы получили следующие показатели.

Рис 1. Нормальное распределение тромбоцитов в крови пациентов в нативной плазме

Полученные показатели содержания тромбоцитов в пробирке с ACD-A приведены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание тромбоцитов в крови пациентов после центрифугирования крови в пробирках с ACD-A.

Пациенты Количество тромбоцитов в мл

Пациент 1 393

Пациент 2 536

Пациент 3 471

Пациент 4 302

Пациент 5 391

Пациент 6 461

Пациент 7 390

Пациент 8 392

Пациент 9 307

Пациент 10 330

Результат: значение статистического теста К^ Р) составляет 0,22409.

При статистическом анализе значение р=0,62042. Данные существенно не отличаются от тех, которые распространяются.

Поскольку р> а по статистическим показателям по Шапиро-Вилк ^арко^Нк) определяется, что данные распределены нормально. (рис 2)

Рис 2. Нормальное распределение показателей тромбоцитов после центрифугирования в пробирке с ДСО-Д

Среднее арифметическое 393,3 Дисперсия 5625.78889 Среднеквадратическое отклонение 75.00526 Коэффициент вариации 18.88%

Число единиц наблюдения (п): 10Средняя арифметическая (М): 397.30Медиана (Ме): 391.5Стан-

дартное квадратичное отклонение (а): 75.01Коэф-фициент вариации (Cv): 18.88%Средняя ошибка средней арифметической (m): 25.00

При центрифугировании крови в пробирки с EDTA мы получили следующее содержание тромбоцитов:

Полученные показатели содержания тромбоцитов в пробирке c EDTA приведены в таблице 3.

Таблица 3. Содержание тромбоцитов в крови пациентов после центрифугирования крови в пробирках с EDTA.

Таблица 4. Содержание тромбоцитов по предложенному нами способу

Пациенты Количество тромбоцитов в мл

Пациент 1 626

Пациент 2 782

Пациент 3 750

Пациент 4 664

Пациент 5 642

Пациент 6 714

Пациент 7 601

Пациент 8 599

Пациент 9 691

Пациент 10 705

Значение статистического теста К^ Р) составляет 0,12648.

Значение р= 0,99064. данные существенно не отличаются в выборке.

Поскольку р>а по статистическим показателям по Шапиро-Вилк ^арко^Нк) определяется, что данные распределены нормально (Рис 3)

Рис 3. Нормальное распределение данных тромбоцитов у пациентов в крови после центрифугирования в пробирке с EDTA

Среднее арифметическое составило 677,4 Дисперсия 3839.6, Среднеквадратическое отклонение 61.96451

Число единиц наблюдения (n): 10Средняя арифметическая (М): 677.40Медиана (Ме): 677.5Стан-дартное квадратичное отклонение (а): 61.96Ко-эффициент вариации (Cv): 9.15%Средняя ошибка средней арифметической (m): 20.65

При центрифугировании по предложенному нами способу мы получили концентрацию тромбоцитов представленной в таблице 4.

Пациенты Количество тромбоцитов в мл

Пациент 1 1682

Пациент 2 1420

Пациент 3 1814

Пациент 4 1573

Пациент 5 1332

Пациент 6 1570

Пациент 7 1346

Пациент 8 1507

Пациент 9 1528

Пациент 10 1609

Значение статистики теста К^ Р) составляет 0,1364.

Значение р=0,99741. Данные существенно не отличаются от тех, которые обычно распространяются.

Поскольку р>а по статистическим показателям по Шапиро-Вилк ^арко^Нк) определяется, что данные распределены нормально (рис 4)

Рис. 4. Нормальное распределение тромбоцитов по предложенной нами методике.

Среднее арифметическое 1538,1, дисперсия 22054,1, среднеквадратичное отклонение 148,50623 Коэффициент вариации 9,66%

Число единиц наблюдения (n): 10Средняя арифметическая (М): 1538.10Медиана (Ме): 1549Стан-дартное квадратичное отклонение (а): 148.51Ко-эффициент вариации (Cv): 9.66%Средняя ошибка средней арифметической (m): 49.50

При статистическом сравнении по Шапиро-Вилк распределения тромбоцитов в пробирках с EDTA, ACD-A и по нашей методике мы получили p-значение <а, Предполагается, что данные не распределяются нормально. (рис 5).

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в нативной плазме и в пробирках с ACD-A

U-критерий Манна-Уитни равен 0. Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 230 < 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05).Значение t-критерия Стьюдента: 6.91, Различия статистически значимы (p=0.000003). Число степеней свободы f = 18, Критическое зна-

сэ о

о Л о

о сз о в

чение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости а = 0,05.

QQ - Plot

4

-4

-2-1012 Da Га

• Standard No'n'al -Standard Normal = 0.921 ■ Data-6.0Э7Е-1 .

Рис. 5. Ненормальное распределение тромбоцитов в пробирках с ACD-A, EDTA и по нашей методике после центрифугирования

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в нативной плазме и в пробирках с EDTA

U-критерий Манна-Уитни равен 10Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 2310

< 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05). Значение t-критерия Стьюдента: 20.33, Различия статистически значимы (p=0.000000). Число степеней свободы f = 18, Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости а = 0,05

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в нативной плазме и в пробирках по нашей методике

U-критерий Манна-Уитни равен 0. Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 230

< 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05).Значение t-критерия Стьюдента: 26.28. Различия статистически значимы (p=0.000000). Число степеней свободы f = 18.Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости а = 0,05

При статистическом сравнении групп по распределению тромбоцитов в пробирке с ACD-A и в пробирках с EDTAНачало формы

U-критерий Манна-Уитни равен 0.Критическое значение U-критерия Манна-Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 230

< 23, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05).Значение t-критерия Стьюдента: 8.64.Раз-личия статистически значимы (р=0.000000).Число степеней свободы f = 18.Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2.101, при уровне значимости а = 0,05

При статистическом сравнении групп по расе пределению тромбоцитов в пробирке с ACD-A, М пробирках с EDTA и по нашей методике

U-критерий Манна-Уитни равен 0. Критическое еЗ значение U-критерия Манна-Уитни при задан-^ ной численности сравниваемых групп составляет

550 < 55, следовательно различия уровня признака в сравниваемых группах статистически значимы (р<0,05)

В пробирках с ACD и EDTA Число единиц наблюдения (п): 20Средняя арифметическая (М): 537.35Медиана (Ме): 567.5Стандартное квадратичное отклонение (а): 158.52Коэффициент вариации (С^: 29.50%.Средняя ошибка средней арифметической (т): 36.37.3начение Ькритерия Стьюдента: 16.29.Различия статистически значимы (р=0.000000).Число степеней свободы f = 28.Кри-тическое значение критерия Стьюдента = 2.048, при уровне значимости а = 0,05 Выводы:

На основании полученных результатов, мы можем утверждать, что:

1. Пробирки с EDTA дают наибольшую концентрацию тромбоцитов в сравнении с пробирками с ACD-A по отношению к нативной крови. Но концентрация тромбоцитов недостаточная, чтобы считать данную методику PRP-терапией.

2. По нашей методике концентрация тромбоцитов превосходит концентрацию тромбоцитов в пробирках с EDTA и в пробирках с ACD-A, превышает концентрацию тромбоцитов более 1000 в мл и считается PRP-терапией. Результаты клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии по методу доктора Клюки-на М.Г. представлены на рис 6-8.

1

Рис. 6. До и после клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии

Рис. 7. До и после клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии

В наших исследованиях мы сравнили уровень тромбоцитов после центрифугирования нативной крови в пробирках с ACD-A, EDTA и по предложенной нами методике и провели статистический анализ полученных результатов. По нашим наблюдениям наилучшим коагулянтом для получения максимальной концентрации тромбоцитов является EDTA.

Нами разработана уникальная методика обогащения концентрата тромбоцитами, причем полученная взвесь тромбоцитов содержит минимальное количество лейкоцитов и эритроцитов, а содержание тромбоцитов варьируется от 1500 до 2000 в мл, позволяющая добиться оптимального результата для стимуляции роста волос. Кроме того, предложенная нами методика обогащения позволяет добиться максимальной концентрации тромбоцитов более 1.000.000 в мкл без использования плазмы крови.

Литература

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Рис. 8. До и после клеточной тромбоцитарной регенеративной терапии

Etulain, J., Mena, H.A., Meiss, R.P. et al. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Sci Rep 8, 1513 (2018) Jun Araki, M.D., Masahiro Jona, M.T., [...], and Kotaro Yoshimura, M.D. Optimized Preparation Method of Platelet-Concentrated Plasma and Non-coagulating Platelet-Derived Factor Concentrates: Maximization of Platelet Concentration and Removal of Fibrinogen Tissue Eng Part C Methods. 2012 Mar; 18(3): 176-185. J. Stevens, BS and S. Khetarpal, MD Platelet-rich plasma for androgenetic alopecia: A review of the literature and proposed treatment protocol Int J Womens Dermatol. 2019 Feb; 5(1): 46-51. Marx R.E. Platelet-rich plasma (PRP): What is PRP and what is not PRP. Implant Dent. 2001;10(4):225-228

Rachul C, Rasko JEJ, Caulfield T. Implicit hype. Representations of platelet rich plasma in the news media. PLoS ONE. 2017;12: e0182496. Рагимов Г.А., Олисова О.Ю., Егорова К.Г. Не-активированнаятромбоцитарно-лейкоцитарная аутоплазма в лечении нерубцовых алопеций. Российский журнал кожных и венерических болезней 2016; 19(6): 369-377. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/1560-9588-2016-19-6-369-377 Ахмеров Р.Р., Зарудий Р.Ф., Бочкова О.И. (Ко-роткова), Рычкова И.Н. Аутостимуляция дермы при повышенном выпадении волос и алопеции // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. - 2011. - № 4. - С. 3640

Marco Cattaneo, Anna Lecchi, Maddalena Loredana Zighetti, Federico Lussana. "Platelet aggregation studies: autologous platelet-poor plasma inhibits platelet aggregation when added to platelet-rich plasma to normalize platelet count". Haematologica, 2007, 92(05)

C3

о

о Л о

о

сз

о в

A NEW CELLULAR PLATELET REGENERATIVE METHOD FOR THE TREATMENT OF ALOPECIA

Klyukin M.G.

St. Petersburg State Budgetary Institution of Health Care "CITY Venereologic Dispensary"

Platelet-rich plasma (PRP) has been used in trichology since the 2000s. However, there is no clear understanding of the plasma platelet count. True platelet-rich plasma (PRP) can be considered to be that plasma, the content of platelets in which is more than 1000 per ml. Known techniques for enriching plasma with platelets with various coagulants. The most significant coagulants in test tubes are ACD-A, EDTA. However, when centrifuged, they show an insufficient concentration of platelets when centrifuged. In our studies, we compared the level of platelets after centrifugation of native blood in tubes with ACD-A, EDTA and according to our proposed method and performed a statistical analysis of the results. According to our observations, EDTA is the best coagulant for obtaining the maximum concentration of platelets. In addition, the enrichment technique we have proposed allows us to achieve a maximum platelet concentration of more than 1,000,000 per |jL without using blood plasma.

Keywords: platelet therapy, PRP, plasma therapy, hair loss, alopecia, hair loss treatment.

References

1. Etulain, J., Mena, H. A., Meiss, R. P. et al. An optimized protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Sci Rep 8, 1513 (2018)

2. Jun Araki, M.D., Masahiro Jona, M.T., [...], and Kotaro Yoshimu-ra, M.D. Optimized Preparation Method of Platelet-Concentrated Plasma and Noncoagulating Platelet-Derived Factor Concentrates: Maximization of Platelet Concentration and Removal of Fibrinogen Tissue Eng Part C Methods. 2012 Mar; 18 (3): 176185.

3. J. Stevens, BS and S. Khetarpal, MD Platelet-rich plasma for androgenetic alopecia: A review of the literature and proposed treatment protocol Int J Womens Dermatol. 2019 Feb; 5 (1): 4651.

4. Marx R. E. Platelet-rich plasma (PRP): What is PRP and what is not PRP. Implant Dent. 2001; 10 (4): 225-228

5. Rachul C, Rasko JEJ, Caulfield T. Implicit hype. Representations of platelet rich plasma in the news media. PLoS ONE. 2017; 12: e0182496.

6. Ragimov G.A., Olisova O. Yu., Egorova K.G. Non-activated platelet-leukocyte autoplasma in the treatment of non-scarring alopecia. Russian Journal of Skin and Venereal Diseases 2016; 19 (6): 369-377. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9588-2016-19-6-369-377

7. Akhmerov R.R., Zarudiy R.F., Bochkova O.I. (Korotkova), Rych-kova I.N. Autostimulation of the dermis with increased hair loss and alopecia // Experimental and Clinical Dermatocosmetolo-gy. - 2011. - No. 4. - P. 36-40

8. Marco Cattaneo, Anna Lecchi, Maddalena Loredana Zighetti, Federico Lussana. "Platelet aggregation studies: autologous platelet-poor plasma inhibits platelet aggregation when added to platelet-rich plasma to normalize platelet count". Haematolog-ica, 2007, 92 (05)

e

u

CM CO