CC BY
109
2001
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра
Том 129
Н.М.Грецкая*, Г.С.Когтева*, Д.В.Куклев, В.Г.Рыбин, Е.М.Маневич**, В.В.Безуглов* (ТИНРО-центр, г. Владивосток; * Институт биоорганическоп химии им. М.М.Шемякина
и Ю.А.Овчинникова РАН, г. Москва; ** Отдел радиационной онкологии медицинского центра Пенсильванского университета, Филадельфия, США)
НОВЫЙ ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ХРОМАТОМАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ВИДЕ ИХ ДАНСИЛГИДРАЗИДОВ
Анализ состава жирных кислот липидов является одним из важных способов определения пищевой ценности как продуктов питания, так и пищевого сырья, в том числе и морского происхождения. Главной отличительной особенностью "морских" липидов от липидов наземных животных и растений является большое разнообразие жирных кислот и содержание полиненасыщенных жирных кислот омега-3 семейства. Именно по последнему критерию главным образом определяется не только пищевая, но и лечебно-профилактическая пригодность "морских" липидов. Поэтому актуальными вопросами всегда были: совершенствование известных методов анализа жирных кислот и разработка новых, более простых, точных и универсальных методов.
В настоящее время наиболее распространенным методом анализа жирных кислот (ЖК) является газожидкостная хроматография (ГЖХ) в виде их метиловых эфиров с использованием пламенно-ионизационного детектора (Christie, 1989; Evershed, 1992). Этот метод обеспечивает высокую эффективность, точность и надежность результатов при анализе индивидуальных жирных кислот и их сложных смесей, характерных для биологических объектов (Fatty acids..., 1992). Очень эффективным для анализа жирнокислотного состава является применение сочетания газового хроматографа с масс-спектрометрическим детектором, которое позволяет точно устанавливать структуры жирных кислот по длине цепи, количеству и положению кратных связей, а также их конфигурации (Harvey, 1992). Однако в этом случае анализируют не метиловые эфи-ры жирных кислот, которые при ионизации электронным ударом претерпевают сложные радикальные перегруппировки, а пирролидиды (Hamilton et al., 1992), пиколиниловые эфиры (Harvey, 1992) либо 4,4-диметилоксазолины (Куклев и др., 2000). Необходимо отметить, что использование ГЖХ в анализе окисленных производных жирных кислот (например, гидроксипроизводных (HETE), лейкотриенов (LT), простаглан-
40
динов (PG)) чрезвычайно затруднено и редко применимо для их количественного анализа в биологических объектах (Christie, 1993).
ВЭЖХ-анализ жирных кислот является хорошей альтернативой ГЖХ в тех случаях, когда есть опасение возможной деградации или изомеризации жирных кислот и их окисленных производных в процессе ГЖХ анализа и пробоподготовки (Christie, 1993). Преимуществом ВЭЖХ является возможность препаративного выделения индивидуальных жирных кислот или их групп. Основной сложностью в использовании ВЭЖХ при анализе жирных кислот и полученных из них эфиров является относительно низкая чувствительность обычно применяемых в жидкостной хроматографии ультрафиолетового (УФ) (низкий коэффициент молярного поглощения) и рефрактометрического (РИ) (малое отличие в показателе преломления жирных кислот и используемых подвижных фаз) детекторов. Дополнительной сложностью в применении ВЭЖХ является неэффективность коммерчески доступных неподвижных фаз (например, силикагеля (SiO2), октадецилсилильной (ODS), аминопропильной (NH2)) при разделении сложных смесей свободных жирных кислот или их эфиров.
Таким образом, основными проблемами ВЭЖХ-анализа жирных кислот и их окисленных производных являются:
1) низкая чувствительность УФ- и РИ-детекторов к этому классу соединений;
2) низкая эффективность распространенных неподвижных фаз при их разделении;
3) невозможность точной идентификации ЖК и их окисленных производных, даже при наличии заведомого стандарта;
4) сложность количественного анализа из-за нелинейного отклика обычно используемых детекторов на ЖК различной структуры.
В настоящее время стало очевидно, что высокая специфичность и наибольшая чувствительность при ВЭЖХ-анализе ЖК возможны при их анализе в виде флюоресцентных производных (Christie, 1992). К сожалению, на сегодняшний день предложено небольшое количество флюоресцентных производных ЖК, каждое из которых не лишено существенных недостатков. Так, например, при синтезе производных 4-бромметил-7-метоксикумарина (BrMMC) (Yoo, McGuffin, 1992), 4-бромметил-7-аце-токсикумарина (BrMAC) (Kelly et al., 1987; Wolf, Korf, 1992) необходимо использование краун-эфиров, и даже в этом случае (как отмечают сами исследователи) выходы нестабильны, более того, использование BrMAC затрудняет необходимость проведения послеколоночного гидролиза BrMAC в 4-метил-7-гидроксикумарине (Wolf, Korf, 1990). Использование 9-антрилдиазометана (Kargas et al., 1990) существенно затруднено тем, что реагенты диазометанового ряда нестабильны, ядовиты и неспецифичны по отношению к различным функциональным группам (Аткин-сон, 1982). После получения производных ЖК с пара-(9-антрилокси)-фенацилбромидом (Hanis et al., 1988) необходимо удаление избытка не-прореагировавшего фенацилбромида из реакционной смеси (Hamilton et al., 1992).
Сравнительно недавно предложенный новый флюоресцентный реагент 4-(№гидразиноформилметил-№метил)-амино-7-^№диметиламино-сульфонил-2,1,3-бензоксадиазол (Santa et al., 1996) обеспечивает быст-
41
рую и воспроизводимую дериватизацию свободных жирных кислот, но, к сожалению, до сих пор является коммерчески недоступным.
Важным требованием к производным для ВЭЖХ является улучшение эффективности разделения полученных соединений по отношению к исходным ЖК. Однако и это требование не всегда выполняется: например, эффективность разделения фенациловых эфиров и антранило-вых эфиров (Sewell, 1992) не отличается от эффективности разделения метиловых или этиловых эфиров, хотя и лучше, чем для соответствующих свободных жирных кислот.
Необходимо подчеркнуть, что к настоящему времени в доступной нам литературе отсутствует информация по приготовлению специальных производных жирных кислот, которые бы одновременно характеризовались интенсивной флюоресценцией, хорошей разделяемостью при ВЭЖХ-анализе и интенсивной ионизацией при ВЭЖХ-МС (в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД) (ВЭЖХ-МС ХИАД)).
Ранее нами был предложен удобный метод анализа простагланди-нов - оксигенированных производных арахидоновой кислоты - с помощью микроколоночной ВЭЖХ их дансилгидразидов (Безуглов и др., 1989).
Целью настоящей работы являлось изучение применимости дан-силгидразина (производного дансилхлорида) - широко распространённого в биохимических исследованиях реагента (Досон и др., 1991) - для модификации ЖК и их последующего анализа методами ВЭЖХ-ФЛ и ВЭЖХ-ФЛ-МС ХИАД.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Высокочистые препараты жирных кислот: 18:3ю3, 18:4ю3, 20:3ю6, 20:5ю3, 20:4ю6, 22:6ю3, 18:3Л5,9,12 - были приготовлены, как описано ранее (Модифицированные жирные кислоты, 1997). С2-элонгирование пиноленовой кислоты проведено по методу, предложенному нами (Кук-лев и др., 1996). Образцы насыщенных жирных кислот были приобретены в фирме "Sigma" (США). Дансилгидразин (5-^№диметиламинонаф-талин-1-сульфонилгидразин) - фирмы "Pierce" (Швейцария). Изобутил-хлорформиат - производства фирмы "Chemapol" (Чехия).
Хроматография
ВЭЖХ-ФЛ-МС-анализ жирных кислот проводили на жидкостном хроматографе, снабженном масс-спектрометрическим детектором Agilent 1100 MSD ("Hewlett-Packard", США). Для записи хроматограмм по флюоресценции к прибору после УФ-детектора подсоединяли цифровой флю-ориметрический детектор RF-551 ("Shimadzu", Япония). Флюориметри-ческий детектор работал в режиме: длина волны возбуждения X = 350 нм, детектируемая длина волны X = 530 нм, частота сканирования 1 с. Анализ проводили на колонке "Chromatronix" (4,6 х 250 мм) RSil C18 ("Chromatronix", США) в системе растворителей ацетонитрил-вода (85: 15) при скорости элюирования 1 мл/мин, на микроколонке Nu cleosil C18 (0,5 х 250 мм), в изократическом режиме в системе растворителей ацетонитрил-вода (85: 15) при скорости элюирования 7 мкл/мин ("Хроматограф ХЖ-1311", СССР), на микроколонке Shim-Pack ODS (4,6 x 50 мм, 3 мкм) Agilent 1100 MSD ("Hewlett-Packard", США). Газожидкост-
42
ную хроматографию жирных кислот осуществляли на газовом хроматографе GC-14B ("Shimadzu", Япония), снабженном капиллярной колонкой (30 м х 0,35 мм, 0,25 мкм) с неподвижной фазой "Supelcowax 10M" ("Supelco", США) и пламенно-ионизационным детектором в режиме: температура колонки, инжектора, детектора - соответственно 190, 220 и 220 оС. Газ-носитель - гелий (о.с.ч.).
Тонкослойную хроматографию дансилгидразидов жирных кислот выполняли на пластинках Merck RP-C8 ("Merck", Германия) в системе растворителей ацетонитрил-вода (85: 15) при двойном элюировании.
Получение дансилгидразидов карбоновых кислот на примере арахидоновой кислоты
К 10 мг (30 мкмоль) 20:4ю6 добавляли 100 мкл 54 мкМ раствора изобутилхлорформиата в ацетонитриле и 100 мкл 42 мкМ раствора триэтиламина в ацетонитриле. Реакцию проводили при 0-4 оС в течение 30 мин, после чего избыток реагента упаривали и к полученному смешанному ангидриду прибавляли 500 мкл 45 мкМ раствора дансил-гидразина в метаноле. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 18 ч. Полученный раствор дансилгидразида арахидоновой кислоты использовали для ВЭЖХ.
Получение метиловых эфиров жирных кислот для ГЖХ-анализа
10 мг жира растворяли в 0,5 мл 0,01 %-ного раствора концентрированной серной кислоты в метаноле и запаивали в ампулу. Ампулу выдерживали 1 ч при температуре 100 оС, охлаждали, вскрывали, переносили содержимое в пробирку, прибавляли 1 мл дистиллированной воды и 1 мл гексана и встряхивали. Верхний слой отделяли, промывали водой (1,0 х 0,5 мл), сушили над безводным сульфатом натрия; осушенный гексановый экстракт хроматографировали на 1 г силикагеля, используя в качестве подвижной фазы смесь растворителей гексан - диэтиловый эфир (95: 5) в объеме 2 мл. Элюат собирали, упаривали досуха в вакууме при температуре 30 оС, перерастворяли в 1 мл гексана, и далее аликвоту анализировали ГЖХ.
Гидролиз жиров, получение свободных жирных кислот на примере жира медведя
Гидролиз запасного жира медведя Ursus thibetanus проводили обработкой исходного жира (100 мг) в течение 6 ч смесью 1 мл 40 %-ного КОН, 1 мл Н20 и 2 мл этанола. Жирные кислоты экстрагировали этила-цетатом, после чего превращали в дансилгидразиды, как описано выше. Аналогично осуществляли гидролиз образца льняного масла и смеси насыщенных жирных кислот.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Интенсивно развивая исследования по химии и анализу ЖК и их окисленных производных (Модифицированные жирные кислоты, 1997), мы разработали новый эффективный метод анализа ЖК в виде их дан-силгидразидов с использованием ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС.
Принцип метода заключается в активировании свободной карбоксильной функции жирной кислоты (рис. 1, структура 1) изобутилхлор-формиатом (рис. 1, структура 2) с образованием соответствующего сме-
43
шанного ангидрида (рис. 1, структура 3). Полученный смешанный ангидрид без выделения вводили в реакцию с полуторакратным избытком дансилгидразина (5^^-диметиламинонафталин-1-сульфонилгидразин (рис. 1, структура 4) при 0-4 °С (подробнее см. в Материалах и методах). Образующийся дансилгидразид жирной кислоты (рис. 1, структура 5, DnsHz) анализировали методом ВЭЖХ. В ходе работы нами синтези-ровны дансилгидразиды различных индивидуальных насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, а также дансилгидразиды их искусственных и природных смесей. Полученные производные анализировали методами ТСХ, ВЭЖХ с УФ-детектором (ВЭЖХ-УФ), ВЭЖХ с флюоресцентным детектором (ВЭЖХ-ФЛ) и ВЭЖХ-ФЛ с масс-спектрометричес-ким детектором (ВЭЖХ-ФЛ-МС).
Рис. 1. Принципиальная схема синтеза дансилгидразидов карбоновых кислот
Fig. 1. Scheme of the carbonic acid dansylhydrazides synthesis
Эффективность применения разработанного нами метода можно проиллюстрировать некоторыми примерами.
Смесь насыщенных жирных кислот, состоящую из лауриновой (12:0), миристиновой (14:0), пальмитиновой (16:0), маргариновой (17:0), стеариновой (18:0), нанодеценовой (19:0) и арахиновой кислот (20:0), превращали в смесь соответствующих дансилгидразидов и анализировали методом обращенно-фазовой ТСХ (рис. 2). Наилучшего разделения удалось достичь при использовании подвижной фазы ацетонитрил-вода (85: 15) при двукратном элюировании.
На пластинке ТСХ (рис. 2) при облучении ртутной УФ-лампой (X = = 254 нм) ясно видны ярко светящиеся желто-зеленые пятна дансилгидразидов на темном фоне при очень хорошем разделении компонентов смеси. Пятно № 7 с Rf 0,95 образовано неразделившейся смесью продукта взаимодействия избытка изобутилхлороформиата с дансилгидра-зином и непрореагировавшим дансилгидразином, пятна № 1-6 образованы соответственно дансилгидразидами лауриновой (Rf 0,86), мирис-
44 f
Фронт тиновой (R 0,63), пальмитиновой (R^ 0,51), маргариновой (Rf 0,4), стеариновой (Rf 0,3), нонадеценовой (Rf 0,24) и арахиновой кислот (R, 0,12).
Рис. 2. Зарисовка обращенно-фа-зовой тонкослойной хроматографичес-кой пластинки RP-C8 ("Merck", Германия). Хроматографическое разделение смеси дансилгидразидов насыщенных жирных кислот при двукратном проявлении в системе ацетонитрил-вода (85: 15). Подробнее в тексте
Fig. 2. The reverced-phase TLC plate (RP-C8, "Merck", Germany) drawing. The chromatographic separation of saturated fatty acids dansylhydrazides mixture after twice repeated elution in acetonitryl-water (85: 15). The numbering was shown in text below
Смесь насыщенных жирных кислот, состоящую из лауриновой, ми-ристиновой, пальмитиновой, маргариновой, стеариновой, нонадеценовой, арахиновой и докозановой кислот (22:0), превращали в смесь соответствующих дансилгидразидов и анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ-ФЛ-МС ХИАД. Наилучшего разделения достигали (работа с вод-но-метанольными фазами) при использовании подвижной фазы метанол-вода (90: 10). Хроматограмма по флюоресценции характеризуется очень хорошим разделением пиков DnsHz-ЖK, малой длительностью анализа и чувствительностью порядка 100 пг на компонент (рис. 3). Профиль ионного тока, полученный с масс-детектора, характеризуется хорошим разделением пиков дансилгидразидов (однако худшим, чем при использовании ФЛ-детектора, что связано с конструктивными особенностями ионизационной камеры масс-детектора) (рис. 4) и интенсивными пиками протонированных молекулярных ионов (режим ХИАД-регистрация положительных ионов), например, масс-спектр пика № 5 -дансилгидразида стеариновой кислоты (рис. 5).
Разделение искусственной смеси дансилгидразидов одиннадцати насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, играющих важную роль во многих процессах жизнедеятельности, показано на рис. 6. Разделение происходит успешно как на аналитической, так и на микроколонке с использованием подвижной фазы ацетонитрил-вода (80: 20) в течение двух часов. Псевдохроматограмма, полученная с масс-детектора, как и в случае со смесью насыщенных ЖК, характеризуется хорошим разделением пиков дансилгидразидов и интенсивными пиками протонирован-ных молекулярных ионов, например, масс-спектр пика № 4 - DnsHz-альфа-линоленовой кислоты (рис. 7). Необходимо отдельно подчеркнуть,
45
Рис. 5. Масс-спектр с вершины пика № 5 из хроматограммы (рис. 4). Идентифицирован как дансилгидразид стеариновой кислоты (18:0). Режим анализа: ХИАД, регистрация положительных ионов, напряжение коронного разряда 2500 В, напряжение на фрагменторе - 100 В, щель - 1 m/z, интервал записи спектра (m/z) 200-850
Fig. 5. Mass-spectrum was written from the reak number 5 top (see fig. 4) and identified as dansylhydrazide of stearic acid (18:0). Conditions of analysis: APCI mode, positive ion registration, corona voltage 2500 V, fragmentor voltage 100 V, slot 1 m/z, spectrum range 200-850 m/z
Рис. 6. ВЭЖХ-анализ искусственной смеси дансилгидразидов насыщенных и ненасыщенных жирных кислот: 2 - 14:0, 3 - 20:5œ3, 4 - 18:3œ3, 5 -22:6œ3, 6 - 20:4œ6, 7 - 16:0, 8 - 20:3œ6, 10 - 17:0, 11 - 18:0, 12 - 19:0, 13 - 22:0. Микроколонка Nucleosil C18 (0,5 х 250 мм, 5 мкм), подвижная фаза ацетонит-рил-вода (85: 15), расход 7 мкл/мин
Fig. 6. HPLC analysis of saturated and unsaturated fatty acids dansylhydrazides mixture: 2 - 14:0, 3 - 20:5œ3, 4 - 18:3œ3, 5 - 22:6œ3, 6 - 20:4œ6, 7 - 16:0, 8 -20:3œ6, 10 - 17:0, 11 - 18:0, 12 - 19:0, 13 - 22:0. Conditions of analysis: Nucleosil C18 column (0,5 х 250 mm, 5 |im), eluent acetonitryl-water (85: 15), elution rate 7 |l/min
Рис. 7. Масс-спектр с вершины пика № 4 из хроматограммы (рис. 6). Идентифицирован как дансилгидразид альфа-линоленовой кислоты (18:3ю3). Режим анализа: ХИАД, регистрация положительных ионов, напряжение коронного разряда 2500 В, напряжение на фрагменторе - 100 В, щель - 1 m/z, интервал записи спектра (m/z) 200-850
Fig. 7. Mass-spectrum was written from the peak number 4 top (see fig. 6) and identified as dansylhydrazide of alpha-linolenic acid (18:3ю3). Conditions of analysis: APCI mode, positive ion registration, corona voltage 2500 V, fragmentor voltage 100 V, slot 1 m/z, spectrum range 200-850 m/z
В качестве природного объекта для апробации метода было использовано льняное масло, состав ЖК которого был подтвержден методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Состав ЖК образца, проанализированного разными методами, приведен в таблице. Из представленных данных видно, что результаты ГЖХ анализа ЖК состава льняного масла в виде метиловых эфиров ЖК несколько отличаются от ВЭЖХ-анализа той же смеси в виде дансилгидразидов. Заметно, что при ГЖХ-анализе происходит некоторая дискриминация ненасыщенных жирных кислот, что, по-видимому, связано с их деградацией в процессах пробо-подготовки (использовалась переэтерификация в метаноле при 100 оС в течение одного часа) и анализа (температура колонки 190 оС).
~ о/ Применимость описы-
Состав жирных кислот масла льна, % r ^
ваемого метода в биохими-
Content of linseed oil fatty acids, %
ческих исследованиях можно проиллюстрировать анализом состава жирных кислот запасного жира медведя Ursus thibetanus с целью проследить включение пиноленовой ((52,92,122)-октадекатри-еновой) кислоты, входящей в состав липидов семян многих видов голосеменных растений, в липиды запасного жира медведя, и возможность ее удлинения (С2-элонгации) при метаболизме. В качестве стандартов известной структуры использовали дансилгидразид (72,112,142)-эйкозатриеновой кислоты, полученной из природной пино-
48
Жирная ГЖХ-анализ ВЭЖХ-анализ
кислота метиловых дансилгидразидов
эфиров ЖК ЖК
16:0 5,4 4,8
18:0 5,5 4,7
18:1 ю9 20,6 19,9
18:2ю6 16,2 15,9
18:3ю3 52,3 54,7
