CC BY
44
НОВІ МЕТОДИ
УДК 577.15 + 543.6 + 543.9 + 543.55
НОВИЙ АМПЕРОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРОЛОКСИДАЗИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ГЛІЦЕРОЛУ
Горюшкіна Т. Б.1, 2
Шкотова Л. В.1
Гайда Г. З.3
Клепач Г. М.3, 4
Гончар М. В.3
Солдаткін О. П.1
Дзядевич С. В.1
Проведено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристиками препаратів гліцеролоксидази для створення амперометричного біосенсора, призначеного для визначення вмісту гліцеролу. Вибрано препарат ферменту, після іммобілізації якого на поверхню перетворювача сенсор демонструє найкращі аналітичні характеристики. Визначено рН-оптимум роботи амперометричного біосенсора, показано, що величина буферної ємності та концентрація фонового електроліту не впливають на його роботу. За допомогою створеного амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої гліцеролоксидази здійснено аналіз гліцеролу у модельних розчинах.
1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ 2Київський національний університет імені Тараса Шевченка 3Інститут біології клітини НАН України, Львів ^Дрогобицький державний педагогічний університет ім. Івана Франка Е-mail: dzyad@yahoo.com
Ключові слова: амперометричний біосенсор, гліцеролоксидаза, гліцерол, іммобілізація, електрохімічна
п ліме| Ііі.іаи.гі.
Гліцерол є одним із метаболітів спиртового бродіння, його широко використовують у виробництві та фармакології. Ще в 1857 році Л. Пастер у своїх класичних дослідженнях алкогольного бродіння показав, що крім головних продуктів бродіння — спирту та вуглекислоти — утворюються побічні продукти, у тому числі й гліцерол (2,5-3,6 г на 100 г збродженого цукру) [1]. Велика кількість гліцеролу утворюється у процесі бродіння сусла в присутності бісульфіту натрію. У цьому разі оцтовий альдегід, який зазвичай є акцептором водню, зв’язується бісульфітом, а його місце у ланцюгу перетворень займають діоксіацетофосфат та 3-фос-фогліцероловий альдегід; вони отримують водень від відновленого коферменту НАД"Н2, утворюючи 1-гліцерофосфат, який у результаті дефосфорилювання перетворюється на гліцерол. Таке бродіння називається гліце-ропіруватним і має найбільшу інтенсивність у перші фази процесу бродіння. Воно відіграє важливу роль у синтезі багатьох вторинних продуктів, які впливають на якість вина [1]. Гліцерол також утворюється в тому разі, якщо бродіння сусла відбувається в лужному середовищі.
Визначення концентрації гліцеролу має особливо велике значення у виноробстві. Необхідність і важливість детекції цього продукту бродіння можна пояснити тим, що з усіх компонентів вина кількісно він поступається лише етиловому спирту. Загальна кількість гліцеролу, яка формується упродовж процесу ферментації сусла, становить від 1:10 до 1:15 кількості спирту з кінцевою концентрацією від 1 до 10 г/л [2]. Вагому роль гліцерол відіграє у формуванні смаку вин, наданні їм маслянистості та м’якості [2-4]. Саме тому точні відомості про наявність та концентрацію гліцеролу в алкогольних напоях є важливим показником їхньої якості.
Визначення вмісту гліцеролу є також важливим у клінічній діагностиці для контролю рівня триацилгліцеридів у крові, оскільки моніторинг цих сполук має прогностичне значення для зменшення ризику захворювань серцево-судинної системи [5].
Сучасні стандартні методи визначення глі-церолу, такі як рідинна хроматографія та спектрофотометричні підходи на основі хімічних
і ферментативних реакцій, зокрема оксидаз-но-пероксидазний метод [6, 7], потребують
наявності кваліфікованого персоналу, складного й дорогого обладнання, необхідного для проведення рідинної хроматографії та спектрофотометрії. Ще одним недоліком зазначених методів є потреба у досить складній попередній підготовці проб для аналізу.
Відомі фірми Boehringer Mannheim (Німеччина) та Sigma (США) пропонують тест-на-бори для ферментативного аналізу гліцеролу. Висока вартість наборів часто зумовлена необхідністю використання кількох ферментів та коферментів або косубстратів. Наприклад, мультиферментна система [8] включає три ферменти — гліцеролкіназу, піруваткіназу та лактатдегідрогеназу, а також потребує присутності коферменту — NADH і двох косуб-стратів — ATP та фосфоенолпірувату:
гліцеролкіназа Гліцерол + ATP-------—Гліцеролфосфат + ADP;
піруваткіназа Фосфоенолпіруват + ADP — Піруват + ATP;
лактатдегідрогеназа Піруват + NADH(H)---------— Лактат + NAD+.
За цим методом концентрацію гліцеролу визначають за зменшенням кількості спожитого NADH, який реєструють фотометрично при довжині хвилі 340 нм.
Іншим методом для визначення вмісту гліцеролу є двоферментний, у першому варіанті якого використовують гліцеролкіна-зу і гліцерол-3-фосфатдегідрогеназу, а моніторинг реакції здійснюють за утворенням NADH(H) при 340 нм:
гліцеролкіназа
Гліцерол + ATP-------— Гліцерол-3-фосфат +
+ ADP
гліцерол-3Р-дегідрогеназа
Гліцерол-3-фосфат + NAD+--------— Дигідроксі-
ацетонфосфат +
+ NADH(H).
У другому варіанті двоферментного методу гліцерол-3-фосфатдегідрогеназна реакція замінена на гліцерол-3-фосфатоксидазну, що покладено в основу діагностичного набору для визначення гліцеролу:
гліцерол-3Р-оксидаза
Гліцерол-3-фосфат + О2-------— Дигідроксі-
ацетонфосфат + Н2О2
пероксидаза
Н2О2 + хромоген (-2Н)-------— Барвник + 2Н2О.
Третій метод для визначення вмісту гліцеролу — дегідрогеназний — ґрунтується на визначенні кількості NADH(Н+), генерованого в результаті ферментативної реакції, каталізованої гліцеролдегідрогеназою:
гліцеролдегідрогеназа
Гліцерол + NAD+-------у Гліцеральдегід +
NADН(Н+).
Використання цього методу в аналітичній практиці є ускладненим, оскільки реакція окиснення гліцеролу гліцеролдегідрогена-зою є оборотною, а фермент — недостатньо селективний.
Традиційні ферментативні підходи для визначення гліцеролу недостатньо селективні, як і в разі дегідрогеназних реакцій, або неекономічні у повсякденному використанні їх в лабораторії. З огляду на це сьогодні є актуальним питання створення більш зручного, точного, селективного, швидкого та дешевого методу визначення вмісту гліце-ролу в різноманітних харчових продуктах.
Розроблення та створення ферментних біосенсорів для визначення вмісту гліцеро-лу може вирішити проблеми, пов’язані з переліченими вище недоліками, та задовольнити усім вищезазначеним вимогам. Головна перевага біосенсорів — висока специфічність, швидкість отримання результатів, легкість оброблення даних та низька собівартість аналізу.
На цей час розроблено й досліджено чимало біосенсорів, призначених для детекції гліцеролу. Їх було створено на основі ферментів гліцеролдегідрогенази [4, 9] та гліце-ролкінази, коіммобілізованої з гліцерол-3-фосфатоксидазою [2]. В останньому випадку головним недоліком створеного біосенсора була його низька стабільність: після трьох днів зберігання в робочому буфері залишалось 10% активності ферментів. У разі використання гліцеролдегідрогенази істотним недоліком біосенсора, який суттєво підвищує собівартість аналізу, є те, що цей фермент не містить у своєму складі кофактору (НАД), а тому його потрібно вводити в систему додатково. При цьому НАД може легко дифундувати з ферментативної мембрани, спричинюючи значне зниження чутливості біосенсора [9].
Створення амперометричного біосенсора на основі гліцеролоксидази (ГО) може стати гідною уваги альтернативою вищезазначеним датчикам, адже цей фермент уже містить у своїй структурі природний кофактор — ФАД.
На сьогодні на ринку ферментів ГО відсутня, а відтак актуальною проблемою залишається пошук продуцентів ГО і розроблення ефективних методів очищення цього ферменту. ГО виявлена у низки плісеневих грибів роду Aspergillus, Penicillium [10], Neurospora [11], Botrytis [12], а також актиноміцетів. У високоочищеному стані фермент виділено тільки із трьох видів — Aspergillus japonicus [5], Penicillium sp. [13]
1 Botrytis allii [14]. У попередніх дослідженнях нами було проведено скринінг серед потенційних продуцентів ГО — штамів плісеневих грибів, обрано джерело ферменту — гриб B. allii 100(5), визначено оптимальні умови культивування клітин продуцента для забезпечення максимального синтезу ГО [15], розроблено методи отримання безклітинних екстрактів і схеми виділення та очищення ферменту, запропоновано способи стабілізації препаратів ГО та показано можливість біоаналітичного використання ферменту [20].
Метою даної роботи було розроблення амперометричного біосенсора на основі платинового друкованого електрода SensLab (SensLab GmbH, Leipzig, Німеччина) з іммобілізованою ГО та оптимізація його робочих характеристик.
Матеріали і методи
У роботі використовували препарати ГО, одержані з плісеневого гриба B. аИй, штам 100 (5) [15]. Клітини гриба вирощували 3 доби в колбах об’ємом 500 мл при 28 0С на шей-кері за постійної аерації (200 об/хв) на середовищі з рН 3,0-3,5 такого складу, г/л: К^з — 3,5, KH2PO4 — 3, NaCl — 0,5, MgSO4-7H2O — 0,5, Саа2 — 0,03, CuSO4 • 5H2O — 0,001, гліцерол 60, меляса — 2 (компоненти середовища розчиняли у водопровідній воді); клітини гриба відмивали водою, ресус-пендували у 50 мМ боратному буфері (BB), рН 9,18, заморожували і зберігали при -20 0С. Для отримання безклітинного екстракту (BE) міцелій гриба руйнували механічним розтиранням у ступці, з охолодженням, у присутності інгібіторів протеаз —
2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти ^ДТА), 0,5 мМ фенілметилсульфонілфто-риду, 0,1 мМ м-амінофенілборної кислоти та 10 мкМ лейпептину. BE відокремлювали від уламків клітин центрифугуванням (15 000 об/хв, гсєр=8 см, 30 хв, 4 0С), визначали активність [15] та концентрацію білка за Лоурі.
Первинне очищення ГО із БЕ проводили за схемами А або К.
Схема А — фракціонування ацетоном. До БЕ (питома активність ГО —
0,16-0,2 мкмоль^хв^мг-1 білка) додавали охолоджений (-25 0С) ацетон до 10 %, інку-бували 30 хв при -10 0С, центрифугували (15 000 об/хв, гсер = 8 см, 30 хв, -10 0С). Осад відкидали, до супернатанту додавали порцію (1:1) ацетону — до 55 %, інкубували 30 хв при -10 0С, осад збирали центрифугуванням, суспендували у ББ. Суспензію освітлювали центрифугуванням, осад відкидали. Екстракт 55%-го осаду містив ГО.
Схема К — колонкова хроматографія. БЕ наносили на колонку з бацитрацин-си-лохромом, зрівноважену ББ, з інгібіторами протеаз, промивали сорбент 3-кратним об’ємом буфера ББ. Проскок і промивні розчини містили ГО.
Хроматографічне очищення ферменту на аніонообмінному сорбенті. Розчини, що містили первинноочищені препарати ГО з питомою активністю 0,25-0,5 мкмоль*хв-имг-1 білка, наносили на колонку з аніонітним сорбентом целюлозної природи — DEAE-Toyopearl 650 M (TSK-Gel, Японія), зрівноважену ББ. ГО елюювали 0,2-1М NaCl або 20% -м (від насичення, при 0 0С) розчином сульфату амонію у вихідному ББ, у кожній фракції визначали питому активність ГО. Фракції елюатів, у яких активність ГО була вищою за 1,5 мкмоль*хв-1'мг-1 білка, об’єднували. Фермент концентрували і додатково очищували осадженням сульфатом амонію до 70% (від насичення, при 0 0С). Осад збирали центрифугуванням, розчиняли в мінімальному об’ємі ББ, визначали активність ГО і каталази [15]. До препаратів ГО додавали різні стабілізувальні додатки і зберігали при 0 0С.
Як полімерну матрицю для електрохімічного нанесення ферменту використовували мономер 3,4-етилендіокситіофен (ЕДТ) виробництва фірми Baytron M (Німеччина) та поліетиленгліколь ММ=1450 фірми Sigma (США).
Також у роботі застосовували реагенти: Na2HPO4 • 7H2O, KH2PO4, KCl, NaOH та гліцерол вітчизняного виробництва. Усі реактиви, як вітчизняного, так й імпортного виробництва, були кваліфікації «ос. ч.» і «х. ч.».
Вимірювання. Усі електрохімічні експерименти було виконано за допомогою традиційної триелектродної системи, в якій друкований електрод SensLab (SensLab GmbH, Leipzig, Німеччина) об’єднував у собі всі три електроди: платиновий робочий, допоміжний та електрод порівняння [16].
Платинові друковані електроди SensLab досліджували на відтворюваність та працездатність у діапазоні потенціалу від 0 до +300 мВ (швидкість розгортання потенціалу становила 20 мВ/с). Циклічну вольтам-перометрію було виконано на потенціостаті ПІ-50-11 (Україна).
Амперометричне вимірювання при постійному потенціалі проводили в електрохімічній комірці об’ємом 5 мл за допомогою потенціостата ПІ-50-11(Україна) та програматора ПР-8 (Україна).
Іммобілізація ГО електрохімічною полімеризацією у полі-(3,4-етилендіокситіофе-ні) (ПЕДТ). Процес електрохімічної полімеризації становить особливий інтерес, оскільки є технологічно зручним. Він дозволяє вибирати і підтримувати розмір, форму й товщину матриці та забезпечує чіткий контроль за процесом осадження [17].
ПЕДТ належить до родини політіофенів — електропровідних полімерів з відносно новими та досить цікавими властивостями. Виконані з ними дослідження [18] демонстрували слабку провідність, невелику зміну заряду, підвищену стабільність і дуже добру здатність до формування плівки. ЕДТ є комерційним продуктом фірми Baytron, який нещодавно надійшов на ринок від фірми Bayer AG (Німеччина).
Гомогенна плівка ПЕДТ фіксується на поверхні робочого електрода, заполімеризо-ваного електрохімічно ЕДТ, за умов нейтрального рН та температури. Формування плівки відбувається краще у водних та, якщо є можливість, гідрофільних полімерах типу полівінілпіролідон (ПВП) чи поліети-ленгліколь (ПЕГ), розчинених у воді з елект-рополімеризуючим розчином. При цьому підвищується гідрофільність полімеру, що наноситься. Окиснення та відновлення залежать від прикладеного потенціалу, який контролює формування позитивного заряду в структурі полімеру. Для ПЕДТ є докази, що поліаніони як олігонуклеотиди можуть бути ефективно утримані у полімерній сітці, що працює за слабкої іонної сили [19].
Для електрохімічної полімеризації в роботі використовували суміш компонентів, приготованих у 20 мМ фосфатному буфері з рН 6,2, яка складалася з 10-2 М 3,4-ети-лендіокситіофену, 10 3 М поліетиленгліко-лю та розчину ГО.
Полімеризацію ЕДТ здійснювали, прикладаючи потенціал від +0,2 В до +1,5 В зі швидкістю 0,1 В/с протягом 15 циклів.
Визначення гліцеролу у модельних розчинах. Вимірювання проводили у 100 мМ К,
Na-фосфатному буферному розчині, рН 7,2, при кімнатній температурі у відкритій місткості за інтенсивного перемішування. Концентрації субстратів змінювали, додаючи певні аліквоти концентрованих розчинів.
Після отримання кожного відгуку сенсор відмивали буферним розчином до стабілізації базового сигналу.
Результати та обговорення
В основі роботи амперометричної системи для визначення вмісту гліцеролу лежить ферментативна реакція:
гліцеролоксидаза Гліцерол + G2-------у Гліцеральдегід + Н^2.
Процес ферментативного перетворення гліцеролу супроводжується утворенням електрохімічно активної речовини — пероксиду водню, який окиснюється з утворенням електронів, які, у свою чергу, можна реєструвати за допомогою амперометрично-го перетворювача:
Н2О2------уG2 + 2Н+ + 2е .
Відсутність комерційного препарату ферменту спонукала виділити ГО з обраного штаму-продуцента плісеневого гриба B. allii [штам 100(5)] [15]). Запропоновані схеми виділення та очищення ферменту із безклітин-ного екстракту гриба, які включали стадію первинного очищення ГО за схемами А (фракціонування ацетоном) або К (колонкова хроматографія) з наступним хроматографічним очищенням ферменту на аніонообмінному сорбенті, дозволили одержати препарати ГО з питомою активністю до 5,7 мкмоль^хв-1^мг-1 білка, тобто очистити фермент у 30 разів [20]. Було доведено стабі-лізувальний вплив іонів Mn2+ (5-10 мМ), Са2+ (1-2 мМ),сульфату амонію (20-70% від насичення при 0 0С), 1 мМ EДTA, сахарози (50%) та поліетиленіміну ^EI) (0,05%) на активність ГО у розчині, тому саме ці сполуки додавали до очищених препаратів ГО, які було використано для іммобілізації на електродах у процесі створення гліцеролсе-лективного біосенсора (табл. 1).
На першому етапі роботи з конструювання біосенсора на поверхню амперометричного перетворювача було іммобілізовано всі одержані препарати ГО. У ході порівняльного аналізу біосенсорів досліджували їхні діапазони роботи, граничні концентрації гліцеро-лу, що визначаються сенсором, а також їхню стабільність під час зберігання (табл. 2).
Таблиця 1. Характеристика препаратів гліцеролоксидази, які було досліджено у процесі створення біосенсорів для визначення гліцеролу
№ пре- па- рату Схема первинного очищення Характеристика препаратів ГО Кількість ГО у біомембрані
Активність Стабілізувальні додатки у 50 мМ ББ, рН 9,18 Домішки каталази мкг од. 10 3
відносна, од./мл питома, од./мг
1 А 1,4 1.1 70% СА; 5 мМ МпС12 ; 1 мМ ЕДТА; 0,05%ПЕІ - 0,84 4,2
2 А 0,8 5,7 70% СА; 1мМ СаС12 1 мМ ЕДТА; 0,05%ПЕІ - 0,42 2,4
3 А 1,0 2,0 70% СА; 1 мМ СаС12; 0,05%ПЕІ ■ 1,5 3,0
4 К 1,5 1,7 1 М №С1 ; 1 мМ МпС12 - 2,7 4,6
5 К 1,0 2,0 0,3 М ШС1; 1 мМ СаС12; 0,05%ПЕІ - 1,5 3,0
6 А 0,3 3,0 1М №С1; 1 мМ МпС12 ;50% сахароза - 0,3 0,9
7 К 1,6 2,5 70% СА ^.; 5 мМ МпС12; 0,05%ПЕІ - 2,0 4,9
8 К 0,9 1,5 70% СА ^.; 5 мМ МпС12; 0,05%ПЕІ + 1,8 2,7
9 К 1,3 1,8 70% СА; 5мМ МпС12; 0,05%ПЕІ + 2,2 3,9
Примітка. СА — сульфат амонію; ПЕІ — поліетиленімін; ЕДТА — етилендіамінтетраоцтова кислота.
Таблиця 2. Порівняльний аналіз лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів, створених на основі різних препаратів гліцеролоксидази
№ препарату ГО Активність при іммобілізації у чутливу мембрану Мінімальна детектована ^ концентрація гліцеролу Лінійний діапазон роботи сенсора Стабільність сенсора під час зберігання
1 + 0,05 мМ 0,05-25,6 мМ 75% активності через 15 діб, 14% — через 40 діб
2 - - -
3 + 0,002 мМ 0,002-< 3,4 мМ 30% активності через 4 доби
1 + Низький сигнал 0,002 мМ 0,002-0 ,05 мМ 10% активності через 3 доби
5 - - -
6 - - -
7 - - -
8 + 0,2 мМ, з часом 0,8 мМ 0,2-25 ,6 мМ 10% активності через 5 діб
9 + 0,2 мМ 0,2-25 ,6 мМ 10% активності через одну добу
На рис. 1 наведено калібрувальні криві лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів, одержаних на основі різних препаратів ГО.
Виходячи з отриманих результатів, для подальшої роботи було обрано препарат ГО №1, який характеризувався лінійною залежністю величини відгуку біосенсора від концентрації гліцеролу в діапазоні 0,05-25,6 мМ, мінімальною концентрацією гліцеролу, що визначається, — 0,05 мМ та кращою стабільністю порівняно з іншими препаратами.
На рис. 2 зображено відгуки амперомет-ричного біосенсора на послідовне внесення
гліцеролу в експериментальну комірку. Форма відгуків була типовою для ферментних біосенсорів. Окрім того, з рисунка видно, що величини відгуків на додавання однакових кількостей гліцеролу були теж однакові.
На подальшому етапі роботи було визначено рН-оптимум роботи амперометричного біосенсора з іммобілізованою ГО №1. Оптимум роботи амперометричного біосенсора
з ГО, іммобілізованою у ПЕДТ, спостерігається при рН 7,2 (рис. 3). Отримані результати добре корелюють з даними літератури, згідно з якими рН-оптимум роботи ГО у розчині становить близько 7,0 [13, 21].
Гліцерол, мМ
Рис. 1. Калібрувальні криві лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів, одержаних електрохімічною полімеризацією у ПEДT на основі різних препаратів гліцеролоксидази.
Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносно внутрішнього електроду порівняння
■ Рис. 2. Відгук амперометричного
... біосенсора з іммобілізованою
електрохімічною полімеризацією у ПEДT гліцеролоксида-зою на 25,6 та 51,2 мМ гліцеролу
рН
Рис. 3. Залежність величини відгуку амперометричного біосенсора на основі гліцеролоксидази, іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенням, від рН розчину.
Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному буфері, потенціал +300 мВ відносно електроду порівняння. Концентрація гліцеролу в комірці: 3,2 мМ (1); 1,6 мМ (2); 0,8 мМ (3); 0,4 мМ (4)
Дослідження впливу концентрації фонового електроліту в буфері та буферної ємності на роботу амперометричного біосенсора показало, що їх зміна істотно не впливає на величину відгуку (рис. 4, 5). Це є типовою ситуацією для ферментних амперометричних біосенсорів.
Було вивчено стабільність амперометрично-го біосенсора на основі іммобілізованої гліцеро-локсидази і встановлено, що величина відгуку
Концентрація фонового електроліту, мМ Рис. 4. Залежність величини відгуку амперометричного біосенсора на основі гліцеролоксидази, іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенням, від концентрації фонового електроліту в буфері. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносно електроду порівняння. Концентрація гліцеролу в комірці: 6,4 мМ (1);
3,2 мМ (2); 1,6 мМ (3); 0,8 мМ (4); 0,4 мМ (5)
Концентрація фосфатного буфера, мМ Рис. 5. Залежність величини відгуку амперометричного біосенсора на основі гліцеролоксидази, іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенням, від концентрації буферного розчину.
Концентрація гліцеролу в комірці: 1,6 мМ (1);
0,8 мМ (2); 0,4 мМ (3); 0,2 мМ (4); 0,1 мМ (5)
сенсора знижується в середньому на 2,5% за добу, а після 50 днів зберігання сенсора відгук на додавання гліцеролу був майже відсутній (рис. 6).
Таким чином, здійснено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристиками препаратів ГО з метою створення амперометричного біосенсора для визначення вмісту гліцеролу. Встановлено, що біосенсор на основі препарату ГО №1 (схема первинного очищення А, питома активність — 5 од./мг, стабілізувальні додатки — 70%-й сульфат амонію; 5 мМ Мпс12; 1 мМ ЕДТА; 0,05%-й поліетиленімін у 50 мМ боратному буфері, рН 9,18) демонструє найкращі робочі характеристики — лінійний діапазон у межах
Доба
Рис. 6. Стабільність амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої електрохімічною полімеризацією гліцеролоксидази у ПEДT.
Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносно внутрішнього електроду порівняння
ЛІТЕРАТУРА
1. Родопуло А. К. Биохимия виноделия. — М.: Пищевая промышленность, 1971.
2. Compagnone D., Esti M., Messia M.C.et al. Development of a biosensor for monitoring of glycerol during alcoholic fermentation // Biosensors Bioelectron. — 1998. — V.13. — P.875-880.
3. Жилякова Т. А., Гержикова В. Г., Семен-чук В. А. Исследование динамики накопления глицерина в ходе брожения виноградного сусла // Виноградарство и виноделие. — 2003. — T. 3. — С. 18-21.
4. Kiba N., Azuma N., Furusawa M. Chemilumi-nometric method for the determination of glycerol in wine by flow-injection analysis with co-immobilized glycerol dehydrogenase/NADH oxidase // Talanta. — 1996. — V.43. — P. 1761-1766.
5. Uwajima T., Shimizu Y., Terada O. Glycerol oxidase, a novel copper hemoprotein from Aspergillus japonicus. Molecular and catalytic properties of the enzyme and its application to the analysis of serum triglycerides // J. Biol. Chem. — 1984. — V. 259. — P. 2748-2753.
6. A.c. № 1636773 СССР, МКИ5 G 01 N 33/52. Способ определения пероксидазной активности биологических объектов / М. В. Гончар, А. А. Сибирный (СССР). — № 4363857/14; Заявл. 13.01.88; Опубл. 23.03.91, Бюл. № 11. — 6 с.
7. Гончар М. В. Чутливий метод кількісного визначення пероксиду водню та субстратів оксидаз у біологічних об’єктах // Укр. біохім. журн. — 1998. — Т. 70, № 5. — С. 157-163.
0,05-25,6 мМ гліцеролу і мінімальну концентрацію гліцеролу, що визначається, — 0,05 мМ, та зберігає 75% своєї активності через 15 діб після іммобілізації у чутливу мембрану.
Визначено рН-оптимум роботи створеного амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої електрохімічною полімеризацією ГО у ПЕДТ, який становить 7,2. Показано, що величина буферної ємності та концентрації фонового електроліту в буфері не впливає на роботу біосенсора. За допомогою створеного амперометричного біосенсо-ра на основі іммобілізованої ГО проведено аналіз концентрації гліцеролу в модельних розчинах.
Роботу виконано за фінансової підтримки НАН України в рамках комплексної науково-технічної програми «Сенсорні системи для медико-екологічних та промислово-технологічних потреб».
8. West S. I. Analitical enzymes: diagnostics. — London: Macmillan Press Ltd., 1998. — P. 63-68.
9. Laurinavicius V., Kurtinaitiene B., Gureivi-ciene V. et al. Amperometric glyceride biosensor // Anal. Chim. Acta. — 1996. — V. 330. — P. 159-166.
10. Uwajima T., Akita H., Ito K. et al. Some characteristics of new enzyme «Glycerol Oxidase» // Agric. Biol. Chem. — 1979. — V. 43. — P. 2633-2634.
11. Hill P., Martin S. M. Cellular proteolytic enzymes of Neurospora crassa. Purification and some properties of five intracellular proteinases // Eur. J. Biochem. — 1975. — V. 56, N1. — P. 271-281.
12. Куплетская М. Б., Лихачев А. Н. Глицери-ноксидазная активность грибов рода Botrytis micheli // Микология и фитопатология. — 1996. — Т. 30, Вып. 5-6. — С. 55-58.
13. Lin S. F., Chiou C. M., Tsai Y. C. Purification and characterization of a glycerol oxidase from Penicillum sp. TS-622 // J. Enzyme Microb. Technol. — 1996. — V. 18. — P. 383-387.
14. Пат. 2117702С1 Россия, МПК6 C12N 9/04//(C12N9/04, C12R1:645). Способ получения глицеролоксидазы /ООО «Им-пакт» (Россия). — № 95115005/13; Заявл. 22.08.95; Опубл. 20.08.98.
15. Павлішко Г., Гайда Г., Гончар М. Скринінг штамів продуцентів, очищення та первинна характеристика гліцеролоксидази із плісеневих грибів // Вісник Львів. ун-ту. — Сер. Біол. — 2004. — Вип. 38. — С. 67-73.
16. Шкотова Л. В., Сластья Е. А., Жиляко-ва Т. А. та ін. Амперометричний біосенсор
для аналізу етанолу у вині та у виноградному суслі в процесі його ферментації // Укр. біохім. журн. — 2005. — Т. 77, №1. — С. 96-103.
17. Шкотова Л. В., Горюшкіна Т. Б., Сластья Е. А. та ін. Амперометричний біосенсор для аналізу лактату у вині та у виноградному суслі у процесі його ферментації // Там само. — 2005. — Т. 77, №5. — C.123-130.
18. Ghosh S., Rasmusson J,. Inganas O. Supra-molecular self-assembly for enhanced conductivity in conjugated polymer blends: ionic crosslinking in blends of Poly (3,4-ethy-lenedioxythiophene)-Poly (styrenesulfonate) and Poly (vinylpyrrolidone) // Adv. Mater. — 1998. — V. 10, N14. — P. 1097-1099.
19. Piro B., Pham M-C., Ledoan T. Electrochemical method for entrapment of oligonucleoti-
des in polymer-coated electrodes // J. Biom. Mat. Res. — 1999. — V. 46, N4. — P. 566-572.
20. Гайда Г. З., Павлішко Г. М., Cмуток О. В. та ін. Гліцеролоксидаза плісеневого гриба Botrytis allii: виділення, характеристика та біоаналітичне використання // Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій / За ред. акад. Г. В. Єльської, акад. В. Д. Походенка. — К.: Ін-т. мол. біології і генетики НАН України, 2006. — С. 5-12.
21. Isobe K. Oxidation of ethylene glycol and glycolic acid by glycerol oxidase // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1995. — V. 59, N4. — P. 576-81.
НОВЫЙ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОЛОК-СИДАЗЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛИЦЕРОЛА
Т. Б. Горюшкина1, 2, Л. В. Шкотова1,
Г. З. Гайда3, Г. М. Клепач3-4, М. В. Гончар3,
А. П. Солдаткин1, С. В. Дзядевич1
1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 2Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко 3Институт биологии клетки НАН Украины, Львов 4Дрогобычский государственный педагогический университет им. Ивана Франко
E-mail: dzyad@yahoo.com
Проведен сравнительный анализ эффективности использования различных по способу получения и характеристикам препаратов глицеролоксидазы для создания амперометрического биосенсора для определения содержания глицерола. Выбран препарат фермента, после иммобилизации которого на поверхность преобразователя сенсор демонстрирует лучшие аналитические характеристики. Определен рН-оптимум работы биосенсора, показано, что величина буферной емкости и концентрация фонового электролита не влияют на его работу. С помощью созданного амперометрического биосенсора на основе иммобилизированной глицеролооксидазы осуществлен анализ глицерола в модельных растворах.
Ключевые слова: амперометрический биосенсор, глицеролоксидаза, глицерол, иммобилизация, электрохимическая полимеризация.
NOVEL AMPEROMETRIC BIOSENSOR BASED ON GLYCEROL OXIDASE FOR GLYCEROL DETERMINATION
T. B. Goriushkina1,2, L. V. Shkotova1,
G. Z. Gayda3, H. M. Klepach3-4,
M. V. Gonchar3, O. P. Soldatkin1, S. V. Dzyadevych1
institute of Molecular Biology and Genetics, of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2Taras Shevchenko Natoinal University, Kyiv 3Institute of Cell Biology, of National Academy of Sciences of Ukraine, L’viv 4Ivan Franko State Pedagogical University, Drogobych
E-mail: dzyad@yahoo.com
The paper presents comparative effectiveness analysis of glycerol oxidase preparations, used for development of amperometric biosensor for glycerol determination, which are different in method of preparation and in characteristics. Enzyme preparation, whose immobilization on transducer surface results in sensor demonstrating its best operational characteristics, was selected. PH-optimum for the operation of the developed amperometric biosensor was determined; the values of buffer volume and background electrolyte concentration in buffer were shown to have no effect on the work of glycerol biosensor. The analysis of glycerol concentration in sample solutions was carried out using the developed ampero-metric biosensor based on glycerol oxidase.
Key word: amperometric biosensor, glycerol oxidase, glycerol, immobilization, electrochemical polymerization.
