CC BY
28
УДК 617.713-002.6:579.882.11
О.и. ЛЕБЕДЕВ1, А.В. СУРОВ1, Е.В. АКЕНТЬЕВА2, М.М. САЛИХОВ3
1Омский государственный медицинский университет, 644099, г. Омск, ул. Ленина, д. 12 2Клиническая офтальмологическая больница им. В.П. Выходцева, 644024, г. Омск, ул. Лермонтова, д. 60 3Исилькульская центральная районная больница, 646020, Омская область, г. Исилькуль, ул. Тельмана, д. 167
Новые возможности верификации хламидийной этиологии идиопатических увеитов
Лебедев Олег Иванович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой офтальмологии, тел. +7-968-107-55-55, e-mail: leo.55@mail.ru
Суров Александр Владимирович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры офтальмологии, тел. +7-906-197-93-16, e-mail: abc55.79@mail.ru
Акентьева Евгения Витальевна — врач-офтальмолог, тел. +7-904-328-88-51, e-mail: evgenia.akenteva@mail.ru Салихов Максим Маратович — врач-офтальмолог, тел. +7-905-099-23-28, e-mail: max25111989@mail.ru
С целью изучения информативности методов этиологической верификации хламидийных увеитов проведено комплексное клиническое обследование 30 пациентов с первичным эпизодом или рецидивами воспалительных заболеваний сосудистой оболочки глаз с подозрением на хламидийную природу заболевания. Верификация диагноза проводилась на базе Академического центра лабораторной диагностики г. Омска с применением следующих методов: метода иммуноблотинга с исследованием слезной жидкости набором RecomLine Chlamidia IgMgG (иммуноглобулинов А/иммуноглобулинов G) и тест-системы ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости. Хламидийная этиология заболевания подтвердилась у 4 пациентов. Примененные методы лабораторной диагностики: recomLine Chlamydia IgA/IgG (иммуноблот) и тест-система ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA впервые были использованы с целью исследования слезной жидкости на обнаружение Chlamydia trachomatis с определением маркера острой фазы инфекционного процесса (IgA). Полученные результаты в сравнении с традиционными методами диагностики сыворотки крови (метод ИФА с определением IgМ/IgG к Chlamydia trachomatis) позволяют заключить о большей информативности исследуемых методов в диагностике офтальмохламидиоза с поражением сосудистого тракта глаза.
Ключевые слова: этиологическая верификация, увеиты, иммуноблот, слезная жидкость.
O.I. LEBEDEV1, A.V. SUROV1, E.V. AKENTYEVA2, М.М. SALIKHOV3
1Omsk State Medical University, 12 Lenin Str., Omsk, Russian Federation, 644099 2Clinical Ophthalmologic Hospital named after V.P. Vykhodtsev, 60 Lermontov Str., Omsk, Russian Federation, 644024
3Isilkul Central Regional Hospital, 167 Telman Str., Isilkul, Omsk region, Russian Federation, 646020
Application of new opportunities of chlamydial etiology verification in patients with idiopathic uveites
Lebedev O.I. — D. Med. Sc., Professor, Head of Ophthalmology Department, tel. +7-968-107-55-55, e-mail: leo.55@mail.ru Surov A.V. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of Ophthalmology Department, tel. +7-906-197-93-16, e-mail: abc55.79@mail.ru Akentyeva E.V. — ophthalmologist, tel. +7-904-328-88-51, e-mail: evgenia.akenteva@mail.ru Salikhov М.М. — ophthalmologist, tel. +7-905-099-23-28, e-mail: max25111989@mail.ru
The research objective was to assess the methods of etiological verification of chlamydial uveites. 30 patients were examined, with the primary episode or relapse of inflammatory diseases of choroid of suspected chlamydial origin. The diagnosis was verified in the Omsk Academic Center of Laboratory Diagnostics. The following methods were applied: immunoblotting of plaintive liquid with the RecomLine Chlamidia IgA/IgG set (immunoglobulins A/immunoglobulins G) and ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA test system with research of plaintive liquid was used. The chlamydial etiology of a disease was confirmed
in 4 patients. The applied laboratory diagnostic methods: immunoblotting of plaintive liquid with the recomLine Chlamydia IgA/ IgG and ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA set were used for the first time for the research of plaintive liquid to diagnose the Chlamydia trachomatis and the marker of acute phase of infectious process (IgA). The obtained results compared to the traditional methods of diagnosing the blood serum (determining the IgМ/IgG to Chlamydia trachomatis) proved to be more informative for diagnosing the chlamydial eye infection with lesions of the eye vascular tract.
Key words: etiological verification, uveites, immunoblot, plaintive liquid.
Значимость проблемы увеитов определяется не столько распространенностью заболевания, сколько тяжестью и рецидивирующим характером течения, его высоким инвалидизирующим эффектом, а также преимущественным поражением лиц молодого и трудоспособного возраста [1-3]. Неуклонно растет количество больных с увеитами хламидий-ной этиологии, что связано с урбанизацией и изменением в половом поведении населения [1, 4]. Все вышесказанное диктует необходимость поиска и внедрения в практическую деятельность новых методов диагностики с целью повышения качества лабораторной верификации хламидийной инфекции.
Отсутствие единого подхода к диагностике ге-матогеннных форм офтальмохламидиоза объясняется недостаточным знанием патогенетических механизмов развития воспалительного процесса хламидийной этиологии, связанного с гематогенной диссеминацией [5]. Фагоцитоз при хламидий-ной инфекции является незавершенным, сопровождается крайне неблагоприятной разновидностью внутриклеточного паразитирования, развитием микроорганизмов в цитоплазме клеток очагов поражения, что приводит к гибели фагоцитов [6]. Сложные комплексы микробов, образованные вследствие накопления лейкоцитов с незавершенным фагоцитозом, диссеминируют по сосудистому руслу, формируя новые очаги инфекции [7]. Предрасполагающими факторами для метастатического поражения сосудистой оболочки служит выраженная разветвленность кровеносных сосудов и замедленный кровоток в области увеального тракта, способствующие задержке здесь патогенных агентов [7, 8].
Исследование иммунного статуса слезной жидкости при воспалительной офтальмопатологии является перспективным и в то же время малоизученным направлением для прогнозирования течения заболевания и оценки проведенного лечения. [9]. Общеизвестно, что внедрение в макроорганизм хламидийной инфекции активирует индукцию секреторного IgA, цитотоксическое действие T-клеток и гуморальный ответ путем выработки специфических к возбудителю антител класса IgA, IgG, IgM [6]. Однако длительная персистирующая, хроническая хламидийная инфекция, частые рецидивы заболевания приводят к комбинированному иммунодефициту: снижению активности клеточного и гуморального иммунитета с тенденцией к снижению общего количества T- и В-лимфоцитов [6].
Пониманию специфического иммунопатологического механизма развития воспалительных заболеваний сосудистого тракта и их осложнений, своевременной диагностике и патогенетически ориентированной терапии может способствовать комплексное изучение факторов иммунологической реактивности слезной жидкости [10-12]. В связи с этим появление на рынке тест-систем им-муноблотинга с набором RecomLine Chlamidia IgA/ IgG значительно расширило возможности верификации хламидийной инфекции.
Цель исследования — провести оценку информативности методов иммуноблотинга слезной жидкости с набором RecomLine Chlamidia IgA/IgG и тест-системы ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости в сравнении с методом иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки крови антител к Chlamydia trachomatis (IgM, IgG) в качестве методов верификации хлами-дийных поражений сосудистой оболочки глаз.
Материал и методы
Исследование проведено на базе БУЗОО «Клиническая офтальмологическая больница имени В.П. Выходцева», кафедры офтальмологии ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России, Академического центра лабораторной диагностики г. Омска. Всего обследовано 30 человек, средний возраст которых составил 34±7,8 лет. Критерием включения являлось наличие у пациентов воспалительных заболеваний переднего и заднего отдела сосудистой оболочки глаза предположительно хламидийной этиологии.
Первый этап обследование включал: биомикроскопию переднего отрезка глаза, офтальмоскопию, общие анализы крови и мочи, реакцию Райта — Хед-дельсона на бруцеллез, ревмотесты, диагностику инфекционных агентов методом иммунофермент-ного анализа (ИФА) сыворотки крови (определение антител к токсоплазменным антигенам (A-TOXO IgA, IgG), антител к вирусу простого герпеса IgM, IgG, антител к капсидному антигену IgM, IgG вируса Эпштейн — Барра, антител к раннему антигену вируса Эпштейн — Барра, антител к ядерному антигену вируса Эпштейн — Барра, антител к Chlamydia trachomatis (IgM, IgG). Для исключения сопутствующей патологии пациентам были назначены консультации смежных специалистов (оториноларинголога, стоматолога, фтизиатра, ревматолога).
На втором этапе материалом для исследования являлась слезная жидкость пациентов, забор которой производился из конъюнктивальной полости. Слезотечение стимулировали 10% нашатырным спиртом. Слезу при помощи микрокапилляра собирали в колбу Эппендорфа. Слезотечение стимулировали нашатырным спиртом. Образцы материалов были доставлены в Академический центр лабораторной диагностики г. Омска. У 15 пациентов исследование слезной жидкости проводили методом иммуноблота слезной жидкости набора recomLine Chlamydia IgA/IgG, предназначенного для качественного определения человеческих IgA/IgG-антител к Chlamydia trachomatis. Тестовый стрип с нанесенным на его поверхности экстрактом антигенов Chlamidia trachomatis помещали в лунку инкубационного лотка с буферным раствором, затем добавляли 20 микролитров слезной жидкости пациента. Следующим этапом проводили инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре с мягким встряхиванием. Разведенную сыворотку аспи-рировали из индивидуальных лунок, промывали готовый к использованию буфер 3 раза на шейке-ре, после чего добавляли 2 миллилитра, приготов-
| ОФТАЛЬМОЛОГИЯ
ленного конъюгата и снова инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре при мягком встряхивании. Затем проводился цикл трехкратного промывания на шейкере и инкубация стрипа в течение 5-10 минут. После промывали стрипы деиони-зованной водой, высушивали между двумя слоями фильтровальной бумаги в течение 2 часов. Идентификацию стрипов осуществляли на основании сравнения с контрольным тест-стрипом (см. рис.).
Также у 15 пациентов для диагностики хлами-дийной инфекции была использована тест-система ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости. В тест-системе ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA используется метод непрямого твердофазного иммунофер-ментного анализа (ИФА)
Результаты и обсуждение
При исследовании сыворотки крови методом у 100% пациентов IgM к Chlamydia trachomatis не были обнаружены. Ограниченная информативность
Рисунок.
Результаты оценки стрипов методом имму-ноблотинга слезной жидкости с набором RecomLine Chlamidia иммуноглобулинов А и G
метода объясняется рядом причин. IgM антитела в сыворотке пациентов являются ранним маркером инфекции, появляются первыми при иммунологическом ответе макроорганизма, инфицированного хламидиями. Основное количество IgM сосредоточено в сосудистом русле [12]. Период полураспада составляет 5 дней. Пик IgM приходится на 1-2-ю неделю. Затем происходит снижение титра антител. Как правило, IgM полностью исчезают через 1-2 месяца независимо от проведенного лечения. Эти антитела присутствуют только при острой фазе заболевания и не определяются при реинфекции [13]. Антитела данного класса в ряде случаев могут не выявляться у подростков и взрослых при острой реинфекции (предыдущее инфицирование Chlamydia trachomatis или другими видами хлами-дий (Chlamydia pneumonia)) [4].
У всех пациентов отмечаются средние титры IgG к Chlamydia trachomatis (1:16 - 1:32). Полученные результаты малоинформативны. Величина титра не всегда свидетельствует об интенсивности воспалительного процесса или о стадии заболевания [14]. Этиология воспаления на первом этапе обследования не была установлена.
Следует отметить, что в последнее время достигнут значительный прогресс в разработке и применении современных лабораторных технологий диагностики различных оппортунистических инфекций: развитие серологических тестов, главным образом, иммуноферментного анализа с исследованием сыворотки крови, где определяют титры антител IgG (маркер хронической фазы инфекционного процесса) и антител IgM (маркер острой фазы инфекционного процесса) с определением индекса авидности, появление метода иммуноблота с исследованием сыворотки крови и слезной жидкости [15, 16]. Учитывая возможность выявления методом иммуноблота разноспецифичных антигенов (белков), формируемых в разных фазах инфекционного процесса, можно на данном этапе в каждом конкретном случае установить степень активности, давность инфекции и провести клинико-лабораторные параллели между инфекцией и воспалением глаза [17-19]. Диагностическая значимость данного метода особенно повышается при увеитах и их рецидивирующих формах, когда методом ИФА с исследованием сыворотки крови и исследованием соскобов (РИФ, ПЦР) исключить или подтвердить активность инфекции невозможно [17-19].
На втором этапе при исследовании методом иммуноблота слезной жидкости набора recomLine Chlamydia IgA/IgG у 2 пациентов, стандартное исследование которых оказалось неинформативным, в слезной жидкости обнаружено наличие IgA Chlamidia trachomatis.
В результате исследования слезной жидкости с использованием тест-системы ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA у трех пациентов подтвердилась хламидийная этиология увеитов
Выводы
1. Определение IgM в сыворотки крови методом ИФА к Chlamydia trachomatis в практическом здравоохранении имеет ограниченное значение, из-за невысоких уровней и короткого времени выработки антихламидийных антител класса M [13]. Определение уровня антител IgG к хламидиям в крови необходимо проводить в динамике, оценка результатов исследований, основанная на однократном анализе, ненадежна [13].
я
2 Определение антител к Chlamydia trachomatis в крови методом ИФА является вспомогательным тестом для диагностики хламидиоза, так как из-за низкой иммуногенности у 50% больных хламидио-зом антитела не обнаруживают [8].
3. Впервые примененные нами методы иммуно-блота слезной жидкости набора recomLine Chlamydia IgA/IgG и ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости с целью диагностики офтальмохламидиоза оказались информативным при воспалительных заболеваниях переднего и заднего отдела сосудистой оболочки глаза. Хла-мидийная этиология заболевания подтвердилась у 13% пациентов. Таким образом, использование данных методов этиологической верификации способствует ранней диагностике офтальмохламидио-за и проведению своевременной этиотропной и им-муномодулирующей терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бейшенова Г.А. Исследования эффективности антиоксидант-ной терапии при увеите (экспериментальное исследование): авто-реф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.07, 03.01.04 / Г.А. Бейшенова. — М., 2015. — C. 3.
2. Wensing B., Relvas L.M., Caspers L.E., et al. Comparison of rubella virus and herpes virus-associated anterior uveitis // Ophthalmology. — 2011. — 118 (10). — P. 1905-1910.
3. Kongyai N., Sirirungsi W., Pathanapitoon K., et al. Viral causes of unexplained anterior uveitis in Thailand // Eye (Lond). — 2012. — 26 (4). — P. 529-534.
4. Хворик Д.Ф., Цыркунов В.М., Конкин Д.Е. Оценка иммунного ответа при экспериментальном хламидиозе // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. — 2008. — №3 (23). — С. 80.
5. Воробьева М.С., Манзенюк И.Н. Chlamidia trachomatis: современные представления о возбудителе. Серодиагностика // Науч.-метод. пособие. — Новосибирск. — 2001. — 29 с.
6. Земсков А.М., Гертнер Л.В. Клинико-иммунологические нарушения у пациентов с различными формами хламидийной инфекции // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». — 2011. — №1. — С. 36-37.
7. Ченцова О.Б., Межевова И.Ю., Качков И.А. Этиология, патогенез, клинические формы, диагностика и лечение офтальмохла-
мидиоза (обзор литературы) // РМЖ «Клиническая Офтальмология». — 2004. — №1. — С. 35.
8. Jabs D.A., Rosenbaum J.T., Foster C.S. et al. Guidelines for the use of immunosuppressive drugs in patients with ocular inlammatory disorders: recommendations of an expert panel // Am. J. Ophthalmol. — 2000. — 130 (4). — P. 492-513.
9. Лебедев О.И, Суров А.В., Акентьева Е.В., Именнова Н.Г. Эволюция возможностей диагностики воспалительных заболеваний сосудистого тракта глаза на примере субъекта Федерации // Российский офтальмологический журнал. — 2016. — №4. — С. 22-28.
10. Smith J.A., Mackensen F., Sen H.N. et al. Epidemiology and course of disease in childhood uveitis // Ophthalmology. — 2009. — 116 (8). — P. 1544-1551.
11. Kenneth G.-J. Ooi, Galatowicz G., Calder V.L., Lightman S.L. Cytokines and Chemokines in Uveitis — Is there a Correlation with Clinical Phenotype? // Clinical Medicine & Research. — 2006. — Vol. 4, №4. — P. 294-309.
12. Волкович Т.К. Защитные факторы слезной жидкости и их значение в диагностике заболеваний глаз // Вестник Витебского государственного медицинского университета. — 2008. — Т. 7, №3. — С. 104-109.
13. Межевова И.Ю., Ченцова О.Б. Эффективность иммунодиагностики и иммуномодулирующего лечения при офтальмохлами-диозе // Альманах клинической медицины. — М., 2010. — №22. — С. 17-20.
14. Лебедев О.И., Суров А.В., Молчанова Е.В. Показатели ци-токинового профиля у пациентов с увеитами при оппортунистических инфекциях // Офтальмологические ведомости. — 2010. — 3 (4). — С. 32-36.
15. Суров А.В., Лебедев О.И., Молчанова Е.В. Иммунологические показатели у пациентов с увеитами и их рецидивирующими формами на фоне оппортунистических инфекций // Российский офтальмологический журнал. — 2011. — Т. 4, №2. — С. 56-59.
16. Geisler W.M., Morrison S.G., Doemland M.L., et al. Immunoglobulin-Specific Responses to Chlamydia Elementary Bodies in Individuals with and at Risk for Genital Chlamydial Infection // Journal of Infectious Diseases Advance. — 2014. — 7 (2). — P. 13-17.
17. Лебедев О.И., Суров А.В., Акентьева Е.В. Особенности верификации воспалительных заболеваний глаз (на примере субъекта федерации) // Офтальмологические ведомости.
18. Лебедев О.И., Суров А.В., Матненко Т.Ю., Салихов М.М. Иммунотерапия увеитов, ассоциированных с системными заболеваниями // Русский медицинский журнал. — 2013. — 2. — С. 69-71.
19. Ченцова О.Б., Межевова И.Ю., Качков И.А. Метод специфической диагностики гематогенных форм офтальмохламидиоза // РМЖ «Клиническая Офтальмология». — 2007. — №2. — С. 52.
