CC BY
76
НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
Николаева Людмила Петровна
канд. мед. наук, кафедра «Хирургии» Красноярский государственный медицинский университет им. проф. Войно-Ясенецкого, Министерства
здравоохранения РФ г. Красноярск E-mail: lpnikolaeva@yandex. ru
NEW OPPORTUNITIES OF CELL-BASED THERAPY
Lyudmila Nikolaeva
candidate of Medical Science of the chair of Surgery, Krasnoyarsk State Medical University named after professor Voyno-Yasenetsky, Ministry of Healthcare of the
Russian Federation, Krasnoyarsk
АННОТАЦИЯ
У больных с критической ишемией нижних конечностей во время вынужденной ампутации, удаляется не только конечность, но и около 25 % всех стволовых клеток (СК), что значительно снижает возможности организма к восстановлению. Содержание стволовых клеток в костном мозге бедренной кости соответствует терапевтической дозе и может использоваться для аутологической трансплантации данному больному. Мононуклеарные фракции костного мозга ампутированной конечности, полученные в стерильных условиях операционной, могут в течение 1,5—2 часов быть готовы к применению.
ABSTRACT
Patients with critical ischemia of lower extremities during forced amputation have not only an extremity extirpated but also about 25 % of all stem cells (S.C.) that remarkably reduces organism abilities to recovery. Content of stem cells in bone marrow of a femoral bone corresponds to a curative dose and could be used for autologous transplantation to the particular patient. Bone marrow mononuclear fractions of a stump received in sterile conditions of an operative room could be ready for use during 1,5—2 hours.
Ключевые слова: стволовые клетки; клеточная терапия; гемопоэтическая стволовая клетка; аутотрансплантация; клеточная трансплантация.
Keywords: stem cells; cell-based therapy; hematopoietic stem cells; autotransplantation; cell transplantation.
Приблизительно 40—60 % всех нетравматических ампутаций нижних конечностей проводится у больных диабетом. У 80 % больных сахарным диабетом спустя 15—20 лет после начала болезни ампутируются одна или обе нижние конечности. В 40 % наблюдений после первой ампутации на уровне бедра или голени больные теряют подвижность и могут передвигаться только в пределах квартиры. С увеличением возраста больных прослеживается тенденция увеличения доли больших ампутаций, так у лиц возрастной категории 65—74 года ампутации голени и бедра составляют 32 % и 18 %, среди лиц старше 75 лет 34 % и 28 % соответственно. Уровень ампутации определяет летальность. Ампутация конечности — операция, травматичная как для самого больного, так и для его семьи. Высокие ампутации приводят к ограничению социальной адаптации пациентов, существенно сокращают продолжительность жизни больных в результате поражения контралатеральной конечности и присоединения различного рода осложнений. Нижняя конечность, удаляемая во время вынужденной ампутации, это важное депо костного мозга, где в полости бедренной кости находится около25 % всего костного мозга данного пациента. Важной особенностью костного мозга является его одновременная принадлежность двум регуляторным системам организма — системе крови и иммунной системе, клетки которых участвуют в обеспечении адаптивных реакций. В настоящее время доказано, что восстановление поврежденного органа происходит не только за счет активации органных регионарных стволовых клеток, но и за счет миграции в зону повреждения мезенхимальных стволовых клеток из других органов, и прежде всего из костного мозга. Если при операции, например ампутации конечности на уровни бедра, удаляется до 25 % всего костного мозга, то возможности к репарации и восстановлению снижены из-за уменьшения количества клеток отвечающих за это. Иммунная система при ампутации конечности сокращена
на четверть и как долго сохранится созданный иммунодефицит зависит от индивидуальных особенностей пациента. Важно, во время проведения вынужденной ампутации конечности, снизить потери костного мозга за счет аутологичной клеточной терапии. Применение тканевых и клеточных технологий уже вышло из разряда доклинических исследований. Ближайшая задача биомедицинских исследований в этой области - применение высоких клеточных технологий [1, с. 3]. Получение стволовых клеток путем культивирования имеет несколько общеизвестных недостатков и в первую очередь опасность отторжения. Большинство известных технологий взятия костного мозга у живых лиц с целью последующей трансплантации ткани костного мозга или выделенного концентрата стволовых клеток предполагает использование методик инвазивной трепанобиопсии [2, с. 352]. Впервые стволовые клетки были обнаружены именно в костном мозге и долгое время считалось, что основное депо стволовых клеток является именно костный мозг. В последние годы во всем мире началось интенсивное изучение стволовых клеток из различных источников. Было показано, что стволовые клетки присутствуют в любой ткани и органе: в печенее, селезенке, жировой ткани и пр. Вместе с тем, в практике хирургических стационаров достаточно часто приходится иметь дело с необходимостью проведения ампутаций конечностей. По статистическим данным в США ампутации нижних конечностей ежегодно проводятся примерно у 150000 человек [6, с. 188]. Предполагается, что среди прочих равных обстоятельств, определенное значение в этом имеет и факт утраты вместе с костно-мозговой тканью, находящейся в ампутированной кости, до 25 % всего количества стволовых клеток пациента [3, с. 350]. Полученную в результате вынужденной операции костномозговую ткань рассматривать как один возможных источников стволовых клеток, в том числе и с целью последующей аутотрансплантации. В настоящее время клеточная терапия применяется при многих заболеваниях, которые ранее считались неизлечимыми. Лечение стволовыми клетками возможно при 1 и 2 типе сахарного диабета. Для лечения сахарного диабета применяются стволовые
клетки, полученные из костного мозга. При получении стволовых клеток из ампутированной конечности (что часто наблюдается при сахарном диабете), можно использовать их для данного больного с целью улучшения качества жизни больного и профилактики осложнений диабета.
Целью исследования:
Возможность выделения стволовых клеток, полученных из костного мозга бедренной кости ампутированной конечности. Провести сравнительную оценку полученных результатов с традиционной костно-мозговой пункцией. Поставленную задачу решают за счет того, что в операционной, непосредственно после ампутации, извлекают костный мозг из костномозгового канала бедренной кости в стерильную емкость с последующей транспортировкой в лабораторию.
Материалы и методы:
Выделение клеток костного мозга: костномозговую массу объемом 3 мл гомогенизировали в 4 мл PBS. Полученную суспензию пропускали через нейлоновый фильтр с порами 40 мкм. Три раза клетки отмывали PBS центрифугированием 5 мин при 900 g. Клетки разводили PBS до конечной концентрации 600 тыс. в 1 мл. Определение CD34+ клеток: CD34+ определяли на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II по стандартной методике. В качестве флюоресцентной метки использовались меченые FITC антитела (BD) к CD34, отрицательный контроль — антитела меченые FITC к мышиным IgG1 (BD). CD34+ клетки считали от числа всех клеток в суспензии [5, с. 335].
Содержание стволовых клеток в костном мозге, полученном из ампутированной конечности, намного выше, чем количество стволовых клеток, полученных при пункции. Проведено 15 исследований ампутированной конечности. Количество стволовых клеток, полученных при пункции, не превышает 0,1 % [4, с. 283], а количество стволовых клеток, полученных из ампутированной конечности, больше в несколько десятков раз (до 40).
Результаты:
1. большой объем костного мозга (в сравнении с пункцией);
2. техническая простота взятия материала;
3. высокое содержание стволовых клеток в костном мозге ампутированной конечности (возможность клеточной терапии без культивирования);
4. больной не подвергается пункции.
Ни один из существующих на данный момент источников СК человека или методов их получения не может полностью обеспечить потребности исследователей и требования клиницистов. Получение взрослых СК ассоциировано с применением инвазивных, травмирующих, болезненных для донора (не без риска осложнений) и, что немаловажно, дорогостоящих процедур. Все это, безусловно, ограничивает экспериментальные исследования СК человека и тормозит внедрение клеточных технологий в клиническую практику. Ампутированную конечность, полученную в результате вынужденной операции, можно рассматривать как один из наиболее доступных источников стволовых клеток. Способность к дифференцировке в различные клеточные типы делает СК перспективными с точки зрения возможного использования для клеточной терапии целого ряда приобретенных и наследственных заболеваний. При введении в системный кровоток СК способны целенаправленно мигрировать в участок поражения [7, с. 1919].
Применение аутотрансплантации МСК кажется наиболее перспективными на данном этапе развития клинической науки, так как оно позволяет избежать этических и иммунных проблем, связанных с трансплантацией от донора к реципиенту. Кроветворные стволовые клетки уже на протяжении трех десятилетий используются для восстановления кроветворения у пациентов с онкологическими и гематологическими заболеваниями. Активно разрабатываются подходы к применению трансплантации стволовых клеток при лечении заболеваний, которые до последнего времени считались неизлечимыми с помощью традиционных подходов [8, с. 63]. Ампутация нижней конечности должна проводиться с учетом достижений современной науки и снизить ее повреждающий эффект необходимо в интересах больного.
Список литературы:
1. Пальцев М.А. Медицина ХХ! века в свете клеточной биологии // Вести. РАМН. — 2004. — № 9. — С. 3—11.
2. Питерс-Хармел Э., Матур Р. Сахарный диабет: диагностика и лечение. М.: ИД «Практика», 2008. 2. Руководство по лабораторной гематологии / Б. Сисла; пер. с англ. под общ. ред. А.И. Воробьева М.: Практическая медицина, 2011. — 352 с.
3. Руководство по лабораторной гематологии /.Б. Сисла; пер. с англ. под общ. ред. А.И. Воробьева М.: Практическая медицина, 2011. — 350 с.
4. Bruder S.P., Fink D.J., Caplan A.I. Mesenchymal stem cells in bone development, bone repair, and skeletal regeneration therapy// J. Cell. Biochem. — 1994. — Vol. 56. — P. 283—294.
5. Jamshidi K., Swaim W.R. Bone marrow biopsy with unaltered architecture: A new biopsy device. J. Lab. Clin. Med. 77:335, 1971.
6. Krause J. Bone marrou overview. In: Rodak B, ed. Hematology: Clinical Procedures and Appllications, 2nd ed. Philadelphia: WB Saunders, 2002; 188— 195.
7. Shake J.G., Gruber P.J., Baumgartner W.A. et al. Mesenchimal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects // Ann. Thorac.Surg. — 2002. — Vol. 73. — P. 1919—1956.
8. Weaver C.V., Garry D.G. Regenerative biology: a historical perspective and modern applications // Regenerative Medicine. — 2008. — Vol. 3, — № 1. — P. 63—82.
