CC BY
136
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.633.963.42-039.31-076.5
НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДИАГНОСТИКИ КЛОНА ПАРОКСИЗМАЛЬНОЙ НОЧНОЙ ГЕМОГЛОБИНУРИИ
Гальцева И.В. 1, Фидарова З.Т. 1, Борисов В.И. 2, Михайлова Е.А. 1
1ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, г. Москва, Россия; 2ООО Алексион Фарма,
Россия
Резюме. Современная диагностика клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ) основана на выявлении с помощью проточной цитометрии клеток крови, не имеющих на своей поверхности гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ), связанный белок. Международным обществом клинической цитометрии (ICCS) был предложен протокол 4-цветного метода диагностики, определяющего ПНГ-клон среди моноцитов и гранулоцитов в двух разных пробах периферической крови. Экспрессия белка CD157 одновременно на моноцитах и гранулоцитах позволяет использовать его как мишень для определения ПНГ-фенотипа вместо CD24 и CD14 и таким образом усовершенствовать метод выявления ПНГ-клона. В данной работе выполнено сравнение результатов, полученных при использовании стандартного метода диагностики ПНГ-клона с 4-цветным сочетанием антител (FLAER-Alexa 488, CD45-PerCP, CD15-APC/ CD64-APC, CD24-PE/CD14-PE) и метода с использованием 5-цветного набора антител (FLAER-Alexa 488, CD45-PerCP, CD15-PE-Cy7, CD64-APC, CD157-PE) для одновременного определения ПНГ-клона среди моноцитов и гранулоцитов в одной пробе. Размер ПНГ-клона в обеих популяциях клеток был идентичен и имел высокую корреляцию (R2 > 0,99) между стандартным 4-цветным набором антител и 5-цветной комбинацией с антителами к CD157. Новая 5-цветная комбинация позволила определить с аналогичной чувствительностью минорный ПНГ-клон и имела низкий уровень ложноположительных событий в контрольных образцах крови. Важно, что метод с использованием моноклональных антител против CD157 может иметь преимущество при первичном скрининге пациентов из групп риска.
Ключевые слова: пароксизмальная ночная гемоглобинурия; ПНГ-клон; проточная цитометрия;
CD157.
Для цитирования: Гематология и трансфузиология. 2015; 60 (2): 6-9.
NEW POTENTIALITIES IN THE DIAGNOSIS OF PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA CLONE
Galtseva I.V.1, Fidarova Z.T.1, Borisov V.I .2, Mikhailova E.A.1 hematological Research Center, 125167, Moscow, Russia; 2Alexion Pharma, Moscow Region, Russia
Summary. Modern diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) clone is based on the detection (by flow cytometry) of blood cells free from surface glycosylphosphatidylinositol (GPI)-bound protein. The International Clinical Cytometry Society (ICCS) suggests a 4-color diagnostic protocol, detecting the PNG clone among monocytes and granulocytes in two different specimens of peripheral blood. Simultaneous expression of CD157 protein on monocytes and granulocytes suggests using it as a target for detection of PNH phenotype instead of CD24 and CD14 and thus improve the method for detection of PNH clone. We compared the results of PNH clone detection by 4-color combination of antibodies (FLAER-Alexa 488, CD45-PerCP, CD15-APC/CD64-APC, and CD24-PE/CD14-PE) and by 5-color set of antibodies (FLAER-Alexa 488, CD45-PerCP, CD15-PE-Cy7, CD64-APC, and CD157-PE) for simultaneous detection of PNH clone among monocytes and granulocytes in the same sample. The size of PNH clone was identical in both cell populations and the results of the standard 4-color and 5-color combinations of antibodies to CD157 were in high correlation (R2>0.99). The new 5-color test detected the minor PNH clone with sensitivity similar to the standard test with a low level of false-positive events in control blood samples. Importantly that the use of monoclonal antibodies to CD157 could be preferable in primary screening of risk group patients.
Key words: paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; PNH clone; flow cytometry; CD157. Citation: Gematologiya i transfuziologiya. 2015; 60 (2): 6-9. (in Russ)
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) -редкое клональное заболевание, при котором в результате соматической мутации нарушается синтез гликозилфосфатидилинозитола (ГФИ) - гликолипи-да, прикрепляющего белки к клеточной мембране. Мутация в гене ГФИ приводит к уменьшению или полному исчезновению ГФИ-связанных регулиру-
Для корреспонденции:
Гальцева Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4. Телефон: +7(495) 614-90-42 E-mail: irinagaltseva@gmail.com
Corresponding author:
Galtseva Irina, MD, PhD (irinagaltseva@gmail.com)
ющих белков системы комплемента CD55 и CD59, которые определяют чувствительность клеток к ком-плементопосредованному лизису. Хроническая неконтролируемая активация комплемента приводит к развитию внутрисосудистого гемолиза, тромботиче-ских осложнений, хронической болезни почек и др. [1, 2]. Кроме того, ПНГ-клон выявляется и при так называемых синдромах костномозговой недостаточности, к которым относят апластическую анемию (АА) и миелодиспластические синдромы (МДС) из группы низкого риска. Ряд исследователей [3, 4] рассматривают этот феномен в качестве благоприятного прогностического маркера ответа на иммуносупрес-сивную терапию (ИСТ). Поэтому тестирование периферической крови на наличие ПНГ-клона у пациентов с такими диагнозами, как АА, МДС, и при со-
Таблица 1
Многоцветный набор реагентов для ПНГ-типирования лейкоцитов
Набор моноклональных Клеточные популяции
антител гранулоциты моноциты эритроциты
4-цветный CD45-PerCP (2D1), BD CD15-APC (HI98), BD D24-PE (ALB9), BC FLAER-Alexa488, CED CD45-PerCP (2D1), BD CD64-APC (10.1), BD CD14-PE (RMO52), BC FLAER-Alexa488, CED CD235a (гликофорин A)-FITC (11E4B-7-6), BC, CD59-PE (MEM-43), Invitrogen
5-цветный CD45-PerCP (2D1), BD CD15-PE-Cy7 (HI98), BD
CD157-PE (eBioSY11B5), eBio FLAER-Alexa488, CED
Примечание. BD - «Becton Dickinson», США, BC - «Beckman Ci стояниях, проявляющихся гемолизом и цитопенией, должно обязательно входить в комплекс диагностических мероприятий [5-7].
Последние методические руководства по диагностике ПНГ-клона рекомендуют использовать проточную цитометрию как золотой стандарт. Принцип метода основан на выявлении в периферической крови клеток с ПНГ-фенотипом, т.е. эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов, на поверхности которых в связи с полным (III тип) или частичным (II тип) отсутствием ГФИ-якоря отсутствуют белки ГФИ-комплекса. Процентное отношение данных клеток в каждой клеточной линии определяет размер ПНГ-клона среди эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов. Обязательным условием современной диагностики ПНГ-клона среди лейкоцитов является использование реагента FLAER [8]. FLAER непосредственно связывается с ГФИ-якорем, и его отсутствие позволяет точно выявить ПНГ-клон. Для большей специфичности и чувствительности дополнительно применяют антитела против ГФИ-белков, которые специфически экспрессируются на определенных типах клеток: CD24 - на гранулоцитах, CD14 - на моноцитах [9]. При анализе только одновременное отсутствие FLAER и одного из антител против ГФИ-связанных белков позволяет точно определить размер ПНГ-клона [10]. Использование сертифицированного метода позволяет сопоставлять результаты, полученные в разных лабораториях [11].
Предложенное Международным обществом клинической цитометрии практическое руководство по диагностике ПНГ [8] включает измерение клона среди гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов. Для каждой популяции клеток происходит измерение в отдельной пробирке со своим определенным набором реагентов, что занимает длительное время при
;r», США, CED - «Cedarlane», Канада, eBio - «eBioscience», США. пробоподготовке и анализе. Основываясь на использовании такого реагента, как FLAER, общая методика проведения диагностики с помощью проточной цитометрии продолжает совершенствоваться и оптимизироваться.
Белок CD157 является ГФИ-связанным и экс-прессируется как на моноцитах, так и гранулоци-тах, что теоретически позволяет использовать его вместо предложенных в руководстве CD24/CD14. Практическое применение метода с использованием CD157 и FLAER [12] показало более четкое разделение гранулоцитов и моноцитов на II тип (частичное отсутствие экспрессии ГФИ-белков) и III тип (полное отсутствие экспрессии ГФИ-белков). Однако в настоящее время клиническое значение выявления лейкоцитов II типа неизвестно, но их важно включать для оценки размера ПНГ-клона.
Целью данной работы является проведение сравнительного исследования результатов тестирования стандартным 4-цветным методом и методом с использованием антител к ГФИ-белку CD157, что позволит создать 5-цветный набор реагентов для определения ПНГ-клона на моноцитах и гранулоцитах в одной пробирке и таким образом уменьшить трудоемкость метода диагностики ПНГ-клона и снизить расход моноклональных антител.
Материалы и методы
В исследование включены 35 больных (22 женщины и 13 мужчин) в возрасте от 15 до 66 лет: 32 больных АА, 2 - ПНГ, 1 - МДС, которым проводили обследование в ФГБУ Гематологический научный центр (ГНЦ) Минздрава России (Москва). У всех пациентов ранее был выявлен ПНГ-клон стандартным методом проточной цитометрии. В контрольную группу вкючили 5 доноров в возрасте от 23 до 40 лет и 7 больных АА без ПНГ-клона в возрасте от 19 до 29 лет.
Рис. 1. Сравнение стандартного 4-цветного метода (а, б) выявления ПНГ-клона с использованием CD24 для гранулоцитов и CD14 для моноцитов и метода с использованием 5-цветного набора реагентов с CD157 (в, г).
Проведено сравнение стандартного 4-цветного метода для определения размера ПНГ-клона среди моноцитов (реагенты FLAER, CD14, CD64, CD45) и гранулоцитов (реагенты FLAER, CD24, CD15, CD45) с 5-цветным методом, при котором использовали антитела против ГФИ-белка CD157 с целью детекции обеих популяций клеток в одной пробирке (FLAER, CD157, CD15, CD64, CD45) (табл. 1).
Для выявления ПНГ-эритроцитов цельную кровь предварительно разбавляли Cellwash (BD) в 100 раз, затем отбирали 50 мкл и добавляли моноклональные анти-CD235 и анти-CD59-антитела в объеме согласно указаниям производителя, инкубировали 20 мин при комнатной температуре в темноте с последующей двойной отмывкой Cellwash («BD», США) при 1000 об/мин в течение 5 мин.
Для определения ПНГ-клона среди лейкоцитов цельную кровь предварительно лизировали OptiLyse ("BD", США), согласно инструкции производителя, затем осаждали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок встряхивали и затем клетки разносили по трем цитометрическим пробиркам: в одну добавляли комбинацию линейно-специфичных антител, FLAER и CD157, в две другие добавляли также комбинацию линейно-специфичных антител, FLAER и ГФИ-связывающие антитела для моноцитов и гранулоцитов (см. табл. 1). Антитела добавляли в объеме согласно инструкции производителя, инкубировали в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре, затем отмывали Cellwash ("BD", США) при 1000 об/мин 5 мин.
Полученные образцы анализировали на проточном ци-тометре FACS Canto II ("BD", США).
Выделение гранулоцитарного гейта проводили по параметрам каналов светорассеяния и показателям экс-
прессии CD45, CD15 и бокового светорассеяния. Анализ экспрессии FlAER и CD24, FlAER и CD157 проводили с помощью точечных графиков. Моноциты выделяли также по параметрам каналов светорассеяния и показателям экспрессии CD45 и CD64 и бокового светорассеяния. Определение экспрессии FlAER и CD14, FlAER и CD157 на моноцитах проводили с помощью точечных графиков. ПНГ-гранулоциты/ПНГ-моноциты находились в левом нижнем квадранте точечных графиков, нормальные грану-лоциты/моноциты - в правом верхнем. Получено хорошее разделение популяции ПНГ-клеток и нормальных гранулоцитов и моноцитов (рис. 1) и сопоставимые значения ПНГ-клона при использовании разных методик как среди гранулоцитов (см. рис. 1, а, в: 45,6% против 46,7%), так и среди моноцитов (см. рис. 1, б, г: 55,5% против 54,27%).
Корреляцию между методами рассчитывали с помощью линейного регрессионного анализа с использованием метода наименьших квадратов. Однако сильная корреляция двух величин еще не означает их совпадение, сходство между ними. Учитывая данный факт, сравнение результатов, полученных двумя методами, проводили с помощью линейного регрессионного анализа. Систематическую ошибку (bias) рассчитывали как среднее различий между двумя методами в определении показателя ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов отдельно. Пределы соглашения (Limits of Agreement - LOA) между двумя методами для 95% доверительного интервала (confidence interval - CI) рассчитывали как bias ± 2 стандартных отклонения. Сравнение систематической ошибки и LOA проводили с помощью метода Бленда-Альтмана [13], процентную ошибку определяли как отношение двух стан-
100-
90"
80-
et 70-
ш
60-
LL
1 50-
Ю 40"
5
о зо-
SS 20"
ю-
0
40 60 % CD24-/FLAER-
100
60 100 % С014-Л=1-АЕ1Ч-
Рис 2. Корреляционная прямая между результатами, полученными при использовании реагентов CD24"/FLAER" против CD157"/FLAER" для гранулоцитов и CD14"/FLAER" против CD157-/FLAER- для моноцитов.
8
б н
4 2 0 -.. -2 -4 -6 -i -8 --10-12 Н -14-16-20
а.
LU <
о
о +
к.
LU
5
■ +95%CL (6,059) -+1.96SD (4,618)
■ -95%CL (3,177)
о-----+95%CL
— Bias
4 -i
3 -
2 - """
1 -
0------
-1 --2 - ---3 --4--
fcp.271 95%CL (-2,
Щ05)
720)
-■ +95%CL (-2,720) ---1,96SD (-5,160) - --95%CL (-6,601)
0 20 40 60 80 100 120 CD14/FLAER*+CD 157/FLAER* 1, %
б
+95%CL (6,059) +1,96%SD (2,169) -95%CL (1,531)
+95%CL (0,3935) . Bias (0,2916) -95%CL (0,3345)
+95%CL (-1,450) -1.96SD (-2,110) -95%CL (-2,741)
-20 0 20 40 60 80 100 CD14/FLAER4-CD157/FLAERM, %
120
Рис. 3. Метод Бленда-Альтмана для сравнения ПНГ-клона среди гранулоцитов (а) и моноцитов (б), определенного стандартным 4-цветным методом и с применением СD157.
Таблица 2
Среднее значение ПНГ-клона в популяции лейкоцитов пациентов разных групп в зависимости от метода исследования (М ± т)
Размер ПНГ-клона среди лейкоцитов, определенный 4-цветным методом ПНГ-клон среди гранулоцитов, % ПНГ-клон среди моноцитов, %
CD24-/FLAER- CD157VFLAER CD14-/FLAER- CD157-/FLAER-
0-0,99% 0,19 ± 0,064 0,376 ± 0,087 0,323 ± 0,045 0,378 ± 0,05
1-9,99% 3,98 ± 0,570 3,8 ± 0,70 4,38 ± 0,72 4,16 ± 0,72
более 10% 69,27 ± 10,7 73,26 ± 10,05 60,0 ± 9,70 58,52 ± 9,97
дартных отклонений парных различий к среднему значению ПНГ-клона, определенному стандартным 4-цветным методом. В соответствии с критериями L. Critchley и J. Critchley [14] процентная ошибка менее 30% свидетельствует о допустимых различиях между методами.
Результаты и обсуждение
При проведении исследования клона ПНГ-клеток среди лейкоцитов была выявлена высокая корреляция между результатами, полученными двумя методами. Оба метода показали высокую чувствительность определения размера ПНГ-клона в пределах от 0 до 99,3% (min-max). Коэффициент корреляции составил для гранулоцитов R2 = 0,9956 и для моноцитов R2 = 0,9992 (рис. 2).
Методом Бленда-Альтмана установлено, что при измерении гранулоцитарного ПНГ-клона (рис. 3, а) процентная ошибка составила 22,9%. Для моноцитар-ного ПНГ-клона (рис. 3, б) процентная ошибка - 9,1%. Таким образом, процентная ошибка между стандартным методом определения ПНГ-клона и методом с использованием CD157 для определения ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов была менее 30% (22,9 и 9,1% соответственно), что свидетельствует о допустимых различиях между методами.
С целью сравнения двух методов больные были распределены в зависимости от размера ПНГ-клона по гранулоцитам, определенным стандартным методом, на группы: от 0 до 1%, 1-10% и 10-100%. Результаты представлены в табл. 2, из которой видно, что при измерении стандартным методом при размере клона менее 1% гранулоцитарный клон был почти в 2 раза меньше моноцитарного. Однако различие это статистически незначимо (р = 0,14), вероятно, вследствие небольшого количества наблюдений. С антителами к CD157 эти различия исчезают (см. табл. 2). У больных со значением ПНГ-клона от 1 до 10% размер ПНГ-клона, определенного 5-цветным методом, среди гранулоцитов был несколько меньше, чем среди моноцитов, и эти различия были одинаковы при использовании обеих методов. В группе с ПНГ-клоном больше 10% также не было различий в размерах ПНГ-клона между гранулоцитами и моноцитами, как при измерении классическим методом, так и с антителами к CD157.
Результаты определения ПНГ-клона в контрольной группе показали идентичность двух методов и не привели к ложноположительным результатам по выявлению ПНГ-клона как среди доноров, так и среди больных АА без ПНГ-клона.
Результаты выявления ПНГ-клона, полученные при применении нового метода с использованием моноклональных антител к CD157, сопоставимы с результатами стандартного метода. Однако примене-
ние антител к CD157 имеет важное техническое преимущество: определение размера ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов происходит в одной пробирке с использованием 5-цветной комбинации, что значительно уменьшает время выполнения исследования и расход антител в отличие от стандартной методики с использованием 2 пробирок и 4-цветной комбинации. Анализ полученных данных позволяет рекомендовать метод с антителами CD157 для выявления и мониторинга минорного ПНГ-клона (менее 1%) у больных АА и МДС.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]
1. Hill A., Richards S.J., Hillmen P. Recent developments in the understanding and management of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br. J. Haematol. 2007; 137(3): 181-92.
2. Parker C., Omine M., Richards S., Nishimura J., Bessler M., Ware R., et al. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 2005; 106(12): 3699-709.
3. Nakao S., Sugimori C., Yamazaki H. Clinical significance of a small population of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria-type cells in the management of bone marrow failure. Int. J. Hematol. 2006; 84(2): 118-22.
4. Kulagin A., Lisukov I., Ivanova M., Golubovskaya I., Kruchkova I., Bondarenko S., et al. Prognostic value of paroxysmal nocturnal haemo-globinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: results of two-centre prospective study. Br. J. Haematol. 2014; 164(4): 546-54.
5. Lewis S.M., Dacie J.V. The aplastic anaemia-paroxysmal nocturnal haemoglobinuria syndrome. Br. J. Haematol. 1967; 13(2): 236-51.
6. Dunn D.E., Tanawattanacharoen P., Boccuni P., Nagakura S., Green S.W., Kirby M.R. et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure syndromes. Ann. Intern. Med. 1999; 131(16): 401-8.
7. Sugimori C., Mochizuki K., Qi Z., Sugimori N., Ishiyama K., Kondo Y., et al. Origin and fate of blood cells deficient in glycosylphosphatidylino-sitol-anchored protein among patients with bone marrow failure. Br. J. Haematol. 2009; 147(1): 102-12.
8. Borowitz M.J., Craig F.E., Digiuseppe J.A., Illingworth A.J., Rosse W., Sutherland D.R., et al.; International Clinical Cytometry Society. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemo-globinuria and related disorders by flow cytometry. Cytometry B Clin. Cytom. 2010; 78(4): 211-30. doi: 10.1002/cyto.b.20525.
9. Brodsky R.A., Mukhina G.L., Li S., Nelson K.L., Chiurazzi P.L., Buckley J.T., Borowitz M.J. Improved detection and characterization of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria using fluorescent aerolysin. Am. J. Clin. Pathol. 2000; 114(3): 459-66.
10. Sutherland D.R., Keeney M., Illingworth A. Practical guidelines for the high-sensitivity detection and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones by flow cytometry. Cytometry B Clin. Cytom. 2012; 82(4): 195-208.
11. Наумова Е.В., Почтарь М.Е., Кисиличина Д.Г., Плеханова О.С., Си-пол А.А., Бабенко Е.В. и др. Стандартизация диагностики парок-сизмальной ночной гемоглобинурии с помощью проточной цитометрии. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 7: 54—8.
[Naumova E.V., Pochtar M.E., Kisilitchina D.G., Plekhanova O.S., Sipol A.A., Babenko E.V., et al. The standardization of diagnostic of paroxysmal night hemoglobinuria cytometry. Klinicheskaya laboratornaya diag-nostika. 2013; 7: 54-8]. (in Russian)
12. Sutherland D.R., Acton E., Keeney M., Davis B.H., Illingworth A. Use of CD157 in FLAER-based assays for high-sensitivity PNH granulocyte and PNH monocyte detection. CytometryB Clin. Cytom. 2014; 86(1): 44—55.
13. Bland J.M., Altman D.G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet 1986; 1: 307—10.
14. Critchley L.A., Critchley J.A. A meta-analyzis of studies using bias and precision statistics to compare cardiac output measurement techniques. J. Clin. Monit. Comput. 1999; 15: 85-91.
Поступила 02.04.15 Received 02.04.15
