CC BY
59
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ / BRIEF COMMUNICATIONS Оригинальная статья / Original article УДК 577.22:577.23
DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-143-146
НОВЫЕ СУПЕРКОМПЛЕКСЫ В СИСТЕМЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА PISUM SATIVUM L.
© М.А. Кондакова, И.В. Уколова, Г.Б. Боровский, В.К. Войников
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
При помощи одномерного и двумерного голубого нативного электрофорезов 1D BNE, 2D BNE/BNE и 2D BNE/SDS, энзимографии, иммунохимии и MALDI TOF масс-спектрометрии изучена организация и обнаружены новые суперкомплексы системы окислительного фосфорилирования (OXPHOS) митохондрий из этиолированных проростков гороха (Pisum sativum L.). Показано, что в состав OXPHOS изучаемых органелл входят как ранее обнаруженная в других растительных видах респирасома I+III2+IVn, так и новые суперкомплексы, такие как: мажорная респирасома I+NDA+III+IV, суперкомплекс NDA+NDB+III2+IV, мегакомплекс (II+III2+IV)n, и АТФ-синтасома - NDA +NDB +AOX+АТФ-синтаза. Присутствие альтернативных ферментов в составе суперкомплексов может увеличивать адаптационные возможности OXPHOS растительных митохондрий.
Ключевые слова: суперкомплексы, митохондрии, система окислительного фосфорилирования, Pisum sativum L.
Формат цитирования: Кондакова М.А., Уколова И.В., Боровский Г.Б., Войников В.К. Новые суперкомплексы в системе окислительного фосфорилирования митохондрий проростков гороха Pisum sativum L. // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016, Т. 6, N 3. С. 143-146. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-143-146.
NEW SUPERCOMPLEXES OF THE OXIDATIVE PHOSPHORYLATION SYSTEM IN PEA (Pisum sativum L.) SEEDLINGS MITOCHONDRIA
M.A. Kondakova, I.V. Ukolova, G.B. Borovskii, V.K. Voinikov
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
The organization of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS) in mitochondria isolated from etiolated pea (Pisum sativum L.) seedlings was studied by 1D BN-PAGE, 2D BNE/BNE и 2D BNE/SDS with following histochemi-cal staining, immunochemical and MALDI TOF mass spectrometry analysis and as a result new supercomplexes were revealed. It was shown that pea mitochondria OXPHOS comprises the respirasome I+III2+IVn being earlier detected in other plant species and new supercomplexes, such as a major respirasome I+NDA+III2+IV, supercomplex NDA+NDB+III2+IV, megacomplex (II+III2+IV)n, and ATP-synthasome - NDA +NDB +AOX+ATP-synthase. The association of the alternative respiratory enzymes with other OXPHOS complexes could improve adaptive potential of plant mitochondria.
Keywords: supercomplexes, mitochondria, oxidative phosphorylation system, Pisum sativum L.
For citation: Kondakova M.A., Ukolova I.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. New supercomplexes of the oxidative phosphorylation system in pea (Pisum sativum L.) seedlings mitochondria. Izvestiya Vuzov. Priklad-naya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no 3, pp. 143-146. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-143-146 (in Russian)
ВВЕДЕНИЕ
Окислительное фосфорилирование - процесс, в результате которого энергия, образовавшаяся при окислении питательных веществ, конвертируется в митохондриях в АТФ. Система
окислительного фосфорилирования (OXPHOS) этих органелл состоит из пяти ферментов: комплекса I (НАДН-дегидрогеназы), комплекса II (сук-цинатдегидрогеназы), комплекса III (убихинон-цитохром с-оксидоредуктазы), комплекса IV (ци-
тохромоксидазы) и комплекса V (АТФ-синтазы). Четыре первых фермента составляют дыхательную цепь и вовлечены в процесс переноса электронов, который в трех пунктах сопряжен с транслокацией протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану. Образующийся протонный градиент используется АТФ-синтазой для синтеза АТФ. Долгое время считалось, что все ферменты OXPHOS располагаются во внутренней митохондриальной мембране отдельно, однако при помощи современных методов исследования обнаружены ассоциации между компонентами OXPHOS, которые имеют определенную стехиометрию и представлены комбинациями I+III2, I+III2+IV1 III2+IV и V2. Считается, что в митохондриях растений альтернативные ферменты и комплекс II дыхательной цепи не входят в состав суперкомплексов OXPHOS. В то же время выявлены ассоциации альтернативных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ либо c дыхательным комплексом III [1], либо с комплексами III и IV в митохондриях дрожжей [2], а в митохондриях из печени мышей обнаружено, что комплекс II входит в состав суперкомплекса I+II+III2+IV [3]. Эти данные позволяют предположить, что in vivo подобные ассоциации могут образовываться и в растительных митохондриях. Используя неионный детергент дигитонин и более мягкие по сравнению с классическими [4] условия натив-ного голубого электрофореза (BNE), мы впервые обнаружили подобные и другие суперкомплексы OXPHOS в митохондриях этиолированных проростков гороха.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Работа проводилась на этиолированных 6-суточных проростках гороха (Pisum sativum L., сорт "Аксайский усатый 55"), выращенных в темноте на влажной фильтровальной бумаге при температуре +20 °С. Выделение и очистку митохондрий проводили по стандартной методике [5] с модификациями для проростков гороха. Митохондриальные нативные белковые комплексы солюбилизировали при помощи ди-гитонина [4]. Разделение солюбилизированных белков и их ассоциаций проводили при помощи 1D BNE, 2D BNE/BNE и 2D BNE/SDS [4]. Изучение состава ассоциаций нативных белков проводили при помощи энзимографии на гелях 1 D BNE, масс-спектрометрического анализа белковых пятен на гелях 2D BNE/SDS и иммунохимической детекции белков при помощи соответствующих антител на субъединицы дыхательных комплексов и альтернативные ферменты дыхательной цепи, такие как альтернативная оксидаза (АОХ), внутренняя (NDA1) и внешняя (NDB1) НАД(Ф)Н-дегидроге-назы. Эксперименты выполнены в 3-4 биологических повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее Taylor с соавторами [6] предпринимали попытку изучения организации дыхательной цепи митохондрий зеленых растений гороха при помощи более жесткого детергента додецил-мальтозида, разбивающего суперкомплексы на отдельные комплексы или более мелкие ассоциации дыхательных комплексов. В результате исследований авторы обнаружили в составе электрон-транспортной цепи только один суперкомплекс I+III2 и отдельно функционирующие дыхательные ферменты. При помощи методов одномерного и двумерного голубого нативного форе-зов (1D BNE, 2D BNE/BNE) с последующим энзи-мографическим окрашиванием ферментативной активности отдельных комплексов в геле, имму-ноблоттинга и масс-спектрометрического анализа двумерных 2D BNE/SDS-гелей мы уточнили ранее полученные данные и обнаружили новые особенности организации OXPHOS митохондрий из этиолированных проростков гороха. Результаты наших исследований показали, что система окислительного фосфорилирования в этих орга-неллах представлена более сложными ассоциациями, чем предполагалось ранее [6]. В частности, в составе OXPHOS изучаемых органелл нами обнаружены как ранее выявленная в других растительных видах респирасома I+III2+IVn, так и новые суперкомплексы, содержащие альтернативные внутренние (NDA) и внешние (NDB) НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, а именно: мажорный суперкомплекс I+NDA+III2+IV и суперкомплекс NDA+NDB+ +III2+IV (рисунок).
Присутствие NDA в составе респирасомы I+NDA+III2+IV может увеличивать адаптационные возможности OXPHOS митохондрий, т.к. оптимум активности NDA отмечен при подкислении pH среды, когда активность комплекса I подавляется. В этих условиях NDA альтернативно может поддерживать работу комплексов III и IV в составе респирасомы I+NDA+III2+IV. Обнаруженная ассоциация NDA и NDB с суперкомплексом III2+IV также образует респирасомо-подобную структуру, т.е. автономную мультиферментную машину, выполняющую весь цикл переноса электронов от НАД(Ф)Н на молекулярный кислород. Кроме того, во внутренней мембране митохондрий гороха обнаружен новый мегакомплекс (II+III2+IV)n, представляющий собой цепочку из ассоциированных друг с другом суперкомплексов II+III2+IV. Помимо дыхательных ферментов, NDA, NDB и АОХ ассоциируют и с АТФ-синтазой, образуя новый тип АТФ-синтасомы, функциональную значимость которого ещё предстоит выяснить.
Полученные результаты дополняют и расширяют имеющиеся данные о структуре системы окислительного фосфорилирования растительных митохондрий и позволяют предположить её более сложную нативную организацию, чем считалось ранее.
Схема надмолекулярной организации OXPHOS митохондрий этиолированных проростков гороха: А - схематическое представление этапов изучения нативной организации OXPHOS. Солюби-лизированный митохондриальный белок делится на Ю BNE и 2D BNE/SDS гелях и далее используется для энзимографии (после 1D BNE), иммунохимического или масс-спектромет-рического анализов (после 2D BNE/SDS). Б - результат исследования в виде схемы организации OXPHOS митохондрий проростков гороха, пунктиром обозначены новые суперкомплексы. АТФ-синтасома - ассоциация NDA+NDB+AOX+АТФ-синтаза
Благодарность: Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 14-04-01233 а.
Acknowledgement: This work was supported by RFBR according to the research project № 14-04-01233 a.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Grandier-Vazeille X., Bathany K., Chaigne-pain S., Camougrand N., Manon S., Schmitter J.-M. Yeast mitochondrial dehydrogenases are associated in a supramolecular complex // Biochemistry. 2001. Vol. 40. P. 9758-9769.
2. Matus-Ortega M.G., Cárdenas-Monroy C.A., Flores-Herrera O., Mendoza-Hernández G., Miranda M., González-Pedrajo B., Vázquez-Meza H., Pardo J. P. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Sac-charomyces cerevisiae. Yeast, 2015. DOI: 10.1002/yea.3086.
3. Acin-Perez R., Fernandez-Silva P., Peleato M. L., Perez-Martos A., Enriquez J. A. Respiratory
active mitochondrial supercomplexes // Molecular Cell. 2008. Vol. 32. P. 529-539.
4. Schagger H. Blue native electrophoresis // In C. Hunte, G. Von Jagow, H. Schagger ed. Membrane protein purification and crystallization (second edition). Academic press, 2003. Chapter 5. P. 105-130. DOI:10.1016/B978-012361776-7/50006-1.
5. Douce R. Mitochondria in higher plants: structure, function and biogenesis. London: Academic press, 1985. 327 p.
6. Taylor L., Heazlewood J. L., Day D. A., Millar A. H. Differential impact of environmental stresses on the pea mitochondrial proteome // Mol. Cell. Prote-omics. 2005. Vol. 4. P. 1122-1133.
REFERENCES
1. Grandier-Vazeille X., Bathany K., Chaigne- in a supramolecular complex. Biochemistry. 2001, vol.
pain S., Camougrand N., Manon S., Schmitter J.-M. 40, pp. 9758-9769.
Yeast mitochondrial dehydrogenases are associated 2. Matus-Ortega M.G., Cardenas-Monroy C.A.,
Flores-Herrera O., Mendoza-Hernández G., Miranda M., González-Pedrajo B., Vázquez-Meza H., Pardo J.P. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2015. DOI: 10.1002/yea.3086.
3. Acin-Perez R., Fernandez-Silva P., Peleato M. L., Perez-Martos A., Enriquez J.A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 2008, vol. 32, pp. 529-539.
4. Douce R. Mitochondria in higher plants:
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Марина А. Кондакова
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 Ведущий инженер kondakova-marina@mail.ru
Ирина В. Уколова
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132
К.б.н, с.н.с.
irina@sifibr.irk.ru
Геннадий Б. Боровский
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 Д.б.н., профессор, гл.н.с. borovskii@sifibr.irk.ru
Виктор К. Войников
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132
Д.б.н., профессор, гл. н. с.
vvk@sifibr.irk.ru
Поступила 29.06.2016
structure, function and biogenesis. London, Acad. Press, 1985, 327 p.
5. Schagger H. Blue native electrophoresis. In: C. Hunte, G. Von Jagow, H. Schagger ed. Membrane protein purification and crystallization (second edition). Academic press, 2003, Chapter 5, pp. 105-130. D0l:10.1016/B978-012361776-7/50006-1.
6. Taylor L., Heazlewood J.L., Day D.A., Millar A.H. Differential impact of environmental stresses on the pea mitochondrial proteome. Mol. Cell. Prote-omics. 2005, vol. 4, pp. 1122-1133.
AUTHORS' INDEX Affiliations
Marina A. Kondakova
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia Lead engineer kondakova-marina@mail.ru
Irina V. Ukolova
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia PhD (Biology), senior researcher irina@sifibr.irk.ru
Gennadii B. Borovskii
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia Doctor of Biology, Professor, Chief researcher borovskii@sifibr.irk.ru
Viktor K. Voinikov
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia Doctor of Biology, Professor, Chief researcher vvk@sifibr.irk.ru
Received 29.06.2016
