CC BY
28
УДК 579.266:574.4
НОВЫЕ ПРОЦЕССЫ МИКРОБНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ АЗОТА В ПОЧВАХ КАК ИСТОЧНИК ПАРНИКОВЫХ ГАЗОВ*
Е.А. Сошникова, А.С. Черобаева, А.Л. Степанов, Е.В. Лебедева, Н.А. Манучарова, П.А. Кожевин
Выделение ДНК из почвы с последующим проведением амплификации фрагмента ключевого гена нитрификации (амоА) архей и бактерий указывают на наличие продукта во всех исследованных образцах.
Выявлены особенности структуры аммонийокисляющего прокариотного комплекса в агроценозах и ненарушенных почвах. В агроценозах (при значении рН, близком к нейтральному) по численности и активности доминируют бактерии, а в ненарушенных лесных экосистемах (при низком значении рН) возрастает доля представителей домена ЛгеЬаеа филогенетической группы Thaumarchaeota. Вклад таумархеот в поток закиси азота из серой лесной почвы может достигать 20—25%.
Ключевые слова: аммонийокисляющие археи и бактерии, почва, нарушения местообитаний, цикл азота.
Введение
Процесс нитрификации в почвах является одним из важных источников закиси азота в современной атмосфере Земли. Экологическая роль ее определяется тем, что в атмосфере она претерпевает ряд фотохимических превращений с образованием промежуточных продуктов, приводящих к деградации стратосферного озона. Помимо этого, закись азота, обладая высокой способностью к поглощению инфракрасного излучения, отраженного с поверхности Земли, относится к главным парниковым газам и вносит важный вклад в глобальное изменение климата. В связи с недавним открытием нитрифицирующих архей (таумархеот) [3, 8, 14, 16, 17], активно исследуется их распространение и вклад в процесс нитрификации в наземных и морских экосистемах [5, 13, 20, 21]. Установлено, что во многих типах почв нитрифицирующие археи численно преобладают над бактериями [6, 7, 9], но отсутствуют данные об их участии в процессах образования и эмиссии закиси азота. Цель работы — изучение нитрифицирующих микробных сообществ дерново-подзолистой и серой лесной почв с оценкой их вероятного вклада в образование N2O.
Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследования взяты образцы дерново-подзолистой и серой лесной почв, характеристика которых представлена в табл. 1.
Выделение ДНК проводили с помощью Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit («MoBio», Канада). Навески почвы массой 0,5 г помещали в 2-милли-литровые пробирки Bead Solution со стеклянны-
ми шариками, встряхивали на вортексе и вносили 60 мкл раствора 51. Для проведения полимеразно-цепной реакции (ПЦР) добавляли 200 мкл раствора IRS (Inhibitor Removing Solution), встряхивали 10 мин. и центрифугировали 30 с при 10 000 g. Супернатант переносили в чистую микроцентрифужную пробирку. После этого доливали 250 мкл раствора 52 и встряхивали на вортексе в течение 5 с. Полученный раствор помещали в холодильник (+4°) на 5 мин. Супернатант переливали в чистую микроцентрифужную пробирку, не касаясь осадка. Добавляли 1,3 мкл реактива 53 и встряхивали на вортексе в течение 5 с.
Полученный раствор переносили на колонку с фильтром и центрифугировали 1 мин. при 10 000 g, после чего добавляли 300 мкл реактива 54 и снова центрифугировали 30 с при 10 000 g. После прохождения раствора через фильтр повторяли центрифугирование при 10 000 g в течение 1 мин. Колонку с фильтром переносили в чистую 2-миллилитровую пробирку, помещали 50 мкл реактива 55 в центр белого мембранного фильтра и снова центрифугировали 30 с при 10 000 g. Выделенный осадок, содержащий ДНК, хранили при температуре —20° для дальнейшего анализа. Очистку выделенного препарата ДНК проводили с помощью коммерческого набора Wizard Genomic DNA Purification Kit в соответствии с протоколом производителя («Promega», США).
Для всех ПЦР общий объем реакционной смеси составлял 100 мкл. Объем смеси для ПЦР-фраг-ментов 16S рРНК включал: ПЦР-буфер — 10 мкл, BSA — 2 мкл, dNTPs — 2 мкл, по 4 мкл праймеров (341F и 907R), 4 мкл ДНК, 0,5 мкл Taq ДНК-по-лимеразы, 75,5 мкл H2O. Объем смеси для ПЦР
* Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 14-04-01573 и Президиума РАН № 14-26-00079.
Таблица 1 Общая характеристика образцов почв
Название почвы Растительность рНвод с ^общ' % N %
Дерново-подзолистая на моренном суглинке (лес) смешанный лес (ель, береза) 4,7 2,1 2,3
Дерново-подзолистая на моренном суглинке (пашня) ячмень 5,3 1,7 2,1
Серая лесная сред-несуглинистая на лессовидном суглинке (лес) лиственный лес (береза, осина) 6,3 3,4 2,7
на amoA гены включал: ПЦР-буфер — 10 мкл, BSA — 2 мкл, dNTPs — 4 мкл, по 15 мкл прай-меров (amoAFи amoAR), 4 мкл ДНК, 0,8 мкл Taq ДНК-полимеразы, 49,2 мкл H2O. Амплификацию проводили на приборе MyCycler («BioRad», США).
После амплификации ставили гель-электрофорез для обнаружения ее продуктов. Из каждой ПЦР-пробы брали по 5 мкл раствора, окрашивали на планшете и переносили в лунки для электрофореза. Состав геля: на 75 мл ТЕ-буфера (1х) — 0,7 г агарозы LE 2 и 1,3 мкл бромистого этидия.
Для выделения аммонийокисляющих бактерий из дерново-подзолистой почвы использовали минеральную среду следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 — 1,0; K2HPO4 — 0,5; NaCl — 2,0; MgSO4 ■ 7H2O — 0,2; FeSO4 ■ 7H2O — 0,05; СаСОз — 6,0; раствор микроэлементов — 1 мл. Высевали по два образца почвы, отобранной из лесного фитоценоза и пашни (бессменный ячмень), каждый в две колбы со средой, одну — инкубировали при комнатной температуре, другую — при 37°. Рост культуры поддерживался в течение месяца, пересев проводили через две недели. Контроль за развитием культуры осуществляли через каждые 7 дней с помощью реактива Грисса. По интенсивности окрашивания минеральной среды делали вывод о количестве образовавшихся нитри-тови, соответственно, об активности АОБ. После завершения процесса выращивания отбирали среды (по 1 мл из четырех колб) для выделения ДНК и проведения амплификации.
Для определения интенсивности выделения закиси азота образцы почвы массой 5 г помещали в пенициллиновые флаконы, увлажняли водным раствором (NH4)2SO4 (из расчета 0,3 мг N/г почвы), закрывали резиновыми пробками и вводили ацетилен, достигая парциального давления 10 Ра, что достаточно для ингибирования аэробного окисления аммония протеобактериями (т.е. активности аммониймоно-оксигеназы) [2]. В этой концентрации С2Н2 не оказывает влияния на ак-
тивность таумархеот, так как окисление аммония у них осуществляется с участием иной ферментной системы [7]. Активность денитрифика-ции оценивали традиционным методом — по эмиссии N2O в присутствии ацетилена (10 кРа) [22]; вклад таумархеот в поток закиси азота из почв по отношению к контролю определяли по разности между вариантами с введением ацетилена (10 Ра и 10 кРА).
Газовые пробы отбирали с интервалом, равным 20 ч. Скорость накопления закиси азота в газовой фазе над образцами почв оценивали на хроматографе московского опытного завода «Хроматограф», модель 3700. Длина колонки — 3,2 м, наполнитель — Полисорб 1. Температура термостата 40°. Сила тока катарометра — 150 мА. Газ-носитель — гелий. Скорость расхода — 30 мл/мин.
Результаты и их обсуждение
Для проверки правильности работы прайме-ров на функциональный ген amoA первоначально проводили амплификацию с использованием чистой культуры нитрификаторов Nitrosomonas euro-paea (рис. 1, лунка 1). Дополнительно ставили ПЦР на культуру Escherichia coli, у которой заведомо отсутствует функциональный ген (рис. 1, лунка 2), и добавляли отрицательный контроль без ДНК-матрицы (рис. 1, лунка 3). Присутствие характерной полосы на агарозном геле напротив N. euro-paea свидетельствовало о том, что использованные условия ПЦР могут быть применимы для детекции АОБ. ПЦР-анализ фрагмента функционального
12 3 MR в
4 5 6 7 MR
Рис. 1. Результаты амплификации фрагментов гена amoA для ДНК, полученных из: 1 — Nitrosomonas europaea, 2 — Escheri-hea coli, 3 — без ДНК-матрицы (отрицательный контроль), 4 — N. europaea, 5 — накопительной культуры (дерново-подзолистая почва, лес), 6 — E. coli, 7 — без ДНК-матрицы (отрицательный контроль), MR — маркер молекулярной массы ДНК (1000 пн)
Рис. 2. Результаты амплификации фрагментов гена amoA для ДНК, полученной из образцов дерново-подзолистой почвы (1 и 2), 3 — Nitrosomonas europaea, 4 — Escherihea coli, 5 — без ДНК-матрицы (отрицательный контроль); результаты амплификации фрагментов гена 16S рРНК для ДНК, полученной из образцов дерново-подзолистой почвы (6 — лес, 7 — агроценоз), 8 — E. coli, 9 — без ДНК-матрицы (отрицательный контроль), MR — маркер молекулярной массы ДНК (1000 пн)
гена amoA из накопительной культуры, выделенной из почвы, представлен на рис.1, лунка 5. Присутствие характерных полос на агарозном геле напротив N. europaea и накопительной культуры свидетельствует о том, что использованные условия ПЦР применимы для детекции АОБ в почвенных образцах.
ПЦР-анализ фрагмента функционального гена amoA ДНК, выделенной из почвенных образцов, представлен на рис. 2 (лунки 1 и 2). В качестве положительного контроля и сравнения продуктов амплификации также использовали чистую культуру N. europaea (рис. 2, лунка 3), для проверки специфичности работы праймеров — культуру E. coli (рис. 2, лунка 4), в качестве отрицательного контроля — воду (рис. 2, лунка 5). На полученной картине электрофореза выделяются три полосы продуктов амплификации на одном уровне 320 kb напротив лунок 1, 2, 3, что подтверждает наличие нитрификаторов в обоих почвенных образцах. Напротив лунок 4 и 5 отсутствуют полосы сигнала, так как в пробах E. coli и воды нет функционального гена amoA. Специфическая полоса образца дерново-подзолистой почвы из агро-ценоза более интенсивна по сравнению с таковой для образца из лесного фитоценоза, что может указывать на относительно повышенное обилие нитрификаторов в почве агроценоза. Количественный анализ полос с помощью программы ImageJ показал, что индекс обилия данной популяции в почве поля действительно превышает таковой в лесной почве примерно в 1,3—1,5 раза.
Таким образом, использованные нами условия выделения ДНК из почвенных образцов с последующим проведением амплификации фрагмента ключевого гена нитрификации амоА могут быть успешно использованы для детекции автотроф-ных АОБ в почве без использования традиционных методов культивирования. В дерново-подзолистую почву агроценоза регулярно вносятся азотные
удобрения, что приводит к росту интенсивности нитрификации по сравнению с лесной почвой и увеличению доли автотрофных нитрификаторов в микробном сообществе агроценоза. Этот вывод об особенностях экониш объектов согласуется с данными других исследователей [1,4, 10, 15].
Изучение динамики нитрифицирующей активности в экспериментах с накопительными культурами показало, что в течение первой недели интенсивное окрашивание после добавления реактива Грисса регистрируется только в накопительной культуре из пашни. Такой результат свидетельствует о высокой активности автотрофных нитрифи-каторов в агроценозах после применения азотных удобрений [18, 19].
Даже после двухнедельной инкубации накопительная культура из лесного фитоценоза так и не приобрела красный оттенок, а признаки слабого окрашивания в этом случае отмечены только после трехнедельной инкубации.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об относительно низком уровне активности нитрификаторов в лесном фитоценозе по сравнению с агроценозом, в котором показатели численности и активности автотрофных нитрификаторов могут значительно превышать аналогичные показатели в лесной почве [11].
Оценка вклада таумархеот в газообразные потери азота в форме N20 в дерново-подзолистой почве показала (табл.2), что закись азота обнаруживается только в микрокосмах с аммонием и ацетиленом (10 Ра), т.е. детектируется только ар-хейная нитрификация. Это подтверждают данные других исследователей [12]. В образцах с аммонием без ацетилена (ожидалось проявление активности аммонийокисляющих бактерий) образование закиси азота за период эксперимента не обнаружено. В контрольной почве (без добавления аммо-
Таблица 2
Динамика выделения закиси азота из образцов почвы в присутствии сульфата аммония и ацетилена
Дерново-подзолистая почва, нМ N20/t (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 + C2H2
1 срок фоновый уровень фоновый уровень
2 срок то же 784,9
3 срок —— 1456,3
Серая лесная почва, нМ N20/t (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 + C2H2
1 срок фоновый уровень фоновый уровень
2 срок то же 477,576
3 срок —— 1083,39
ния) в присутствии ацетилена (10 Ра) закись азота также не выделялась: в этих условиях автотрофная нитрификация ингибируется, а денитрификаторы не развиваются (за непродолжительный промежуток времени во время эксперимента) из-за отсутствия достаточного количества нитратов. Активность таумархеот в этом варианте может быть связана с деятельностью архей из кластера £ (почвенные археи), активно развивающимися в присутствии аммония.
В серой лесной почве в отсутствие ацетилена, при внесении сульфата аммония, стимулирующего активность аммонийокисляющих бактерий, эмиссия закиси азота практически не проявлялась. Введение ацетилена в газовую фазу (10 кРа), позволяющее оценить вклад денитрификаторов, свидетельствует о низкой активности процесса в связи с малым содержанием нитратов в исследуемом образце. Только совместное введение ацетилена (10 Ра) и аммония сопровождалось ростом потока закиси азота из почвы, что может быть вызвано деятельностью только аммонийокисляющих архей.
По разности между активностью денитрифи-кации в серой лесной почве и выделением закиси азота после внесения аммония и ингибирова-ния аммонийокисляющих бактерий ацетиленом (10 Ра) была сделана оценка вклада аммонийокисляющих архей (АОА) в эмиссию N20, что составило 20—25% от общего потока закиси азота из этой почвы.
Выводы
Результаты амплификации фрагментов гена атоА архей и бактерий согласуются с данными других исследователей [6, 9, 12] о доминировании архейных генов над бактериальными в почвах ненарушенных экосистем по сравнению с таковыми агроценоза с относительно высокими показателями обилия и активности аммонийокисляющих бактерий при нейтральных значениях рН. Вклад таумархеот в поток закиси азота из серой лесной почвы может достигать 20—25%.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Степанов А.Л., Лебедева Е.В. Образование и поглощение парниковых газов в почвенных агрегатах. М., 2008.
2. Степанов А.Л., Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии. М., 2002.
3. Brochier-Armanet C, Boussau B., Gribaldo S., For-terre P. Mesophilic Crenarchaeota: proposal for a third archaeal phylum, the Thaumarchaeota // Natl. Rev. Microbiol. 2008. Vol. 6, N 3. P. 245—252.
4. Chu H., Fujii T., Morimoto S. et al. Community structure of ammonia-oxidizing bacteria under long-term application of mineral fertilizer and organic manure in a sandy loam soil //Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73. P. 485—491.
5. Francis C., Roberts K., Beman J. et al. Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. Vol. 102. P. 14683—14688.
6. He J.Z., Shen J.P., Zhang L.M. et al. Quantitative analyses of the abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria and ammonia-oxidizing archaea of a Chinese upland red soil under long-term fertilization prac-tices//Environ. Microbiol. 2007. Vol. 9,N2. P. 2364—2374.
7. Jia Z, Conrad R. Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil // Ibid. 2009. Vol. 11, N 7. P. 1658—1671.
8. Konneke M., Bernhard A.E., Torre J.R. de la et al. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine ar-chaeon // Nature. 2005. Vol. 437. P. 543—546.
9. Leininger S., Urich T., Schloter M. et al. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils // Ibid. 2006. Vol. 442. P. 806—809.
10. Limpiyakorn T., Kurisu F., Sakamoto Y., Yagi O. Effects of ammonium and nitrite on communities and populations of ammonia-oxidizing bacteria in laboratory-
scale continuous-flow reactors // FEMS Microbiol. 2007. Vol. 60. P. 501—512.
11. Nicol G.W., Leininger S., Schleper C, ProsserJ.I. The influence of soil pH on the diversity, abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10. P. 2966—2978.
12. Offre P., Prosser J.I., Nicol G. Growth of ammonia-oxidizing archaea in soil microcosms is inhibited by acetylene//FEMS Microbiol. Ecol.2009.Vol.70.P.99—108.
13. Santoro A.E., Buchwald C., McIlvin M.R., Cas-ciotti K.L. Isotopic signature of N2O produced by marine ammonia-oxidizing archaea // Science. 2011. Vol. 333. P. 1282—1285.
14. Spang A., Hatzenpichler R., Brochier-Armanet C. et al. Distinct gene set in two different lineages of ammonia-oxidizing archaea supports the phylum Thaumarchaeota // Trends Microbiol. 2010. Vol. 18. P. 331—340.
15. Stopnisek N., Gubry-Rangin C., Hofferle S. et al. Thaumarchaeal ammonia oxidation in an acidic forest peat soil is not influenced by ammonium amendment // Appl. Environ. Microbiol. 2010. Vol. 76. P. 7626—7634.
16. Tourna M., Stieglmeier M., Spang A. et al. Nitro-sosphaera viennensis, an ammonia oxidizing archaeon from soil //Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Vol. 7. P. 1012—1017.
17. Treusch A.H., Leininger S., Kletzin A. et al. Novel genes for nitrite reductase and Amo-related proteins indicate a role of uncultivated mesophilic crenarchaeota in nitrogen cycling // Environ. Microbiol. 2005. Vol. 7. P. 1985—1995.
18. Turk O., Mavinic D.S. Maintaining nitrite buildup in a system acclimated to free ammonia // Water Res. 1989. Vol. 23. P. 1383—1388.
19. Vadivelu V.M., Keller J., Yuan Z.G. Free ammonia and free nitrous acid inhibition on the anabolic and ca-tabolic processes of Nitrosomonas and Nitrobacter //Water Sci. Technol. Vol. 56. P. 89—97.
20. Walker C.B., Torre J. de la, Klotz M.G. et al. Nit-rosopumilus maritimus genome reveals unique mechanisms for nitrification and autotrophy in globally distributed marine Crenarchaea // Proc. Natl. Acad. Sci. 2010. Vol. 107. P. 8818—8823.
21. Wang S.Y., Wang Y, Feng X.J. et al. Quantitative analyses of ammonia-oxidizing archaea and bacteria
in the sediments of four nitrogen-rich wetlands in China // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. Vol. 90. P. 779—787.
22. Webster E.A., Hopkins ^.^.Contributions from different microbial processes to N2O emission from soil under different moisture regimes // Biol. Fertil. Soils. 1996. Vol. 22. P. 331—335.
Поступила в редакцию 15.11.2015
NEW PROCESSES OF MICROBIAL TRANSFORMATION OF NITROGEN
IN SOILS AS A SOURCE OF GREENHOUSE GASES
E.A. Soshnikova, A.S. Cherobaeva, A.L. Stepanov, E.V. Lebedeva,
N.A. Manucharova, P.A. Kozhevin
Isolation of DNA from soil samples, followed by amplification of a fragment of a key gene nitrification (amoA) archaea and bacteria indicate the presence of the product in all the investigated soil samples.
It was established that in agrocenoses (at a pH ~7) dominates the bacteria, whereas in undisturbed forest ecosystems (at low pH) in prokaryotic ammoniyoxigen complex increases the proportion of archaea domain of representatives of the phylogenetic group Thau-marchaeota. Contribution taumarheot in nitrous oxide stream of gray forest soils may reach 20—25%.
Key words: ammonia oxidizing archaea, ammonia oxidizing bacteria, soil, disturbance, N cycling.
Сведения об авторах
Сошникова Елена Анатольевна, аспирант каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: [email protected]. Черобаева Анна Сергеевна, канд. биол. наук, вед. специал. Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Центр планирования семьи и репродукции. E-mail: [email protected]. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: [email protected]. Лебедева Елена Владимировна, докт. биол. наук, ст. науч. сотр. ФГУ «Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук» (ФИЦ Биотехнологии РАН), ИНМИ РАН. E-mail: [email protected]. Манучарова Наталия Александровна, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Тел.: 8(495) 939-34-05; e-mail: [email protected]. Кожевин Петр Александрович, докт. биол. наук, вед. науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Тел.: 8(495) 939-35-98; e-mail: [email protected].
