CC BY
56
БИОФИЗИКА И МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
УДК 620.3:615.099
С.В. Козырев, В.В. Кораблев, П.П. Якуцени
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИХ РИСКОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ НАНОМАТЕРИАЛОВ
Ответственный и безопасный подход к развитию нанотехнологий, провозглашенный международным сообществом, предполагает необходимость выявления и оценки экологических и биологических рисков, связанных с наномате-риалами и наноструктурами [1]. Одновременно с этим при попытках проведения экспериментальных исследований действия наноматериалов на живые организмы возникают многочисленные вопросы корректности подготовки образцов, способов введения и форм испытываемых веществ, методов выявления токсикологической опасности. Эпидемиологический анализ заболеваемости, проводимый с целью установки долговременных факторов воздействия объектов различной наноприроды на здоровье человека, затруднен тем, что история рассматриваемого сектора человеческой деятельности только начинается. Расчетные методы предсказания биологических рисков использования нанообъек-тов, на основании их физико-химических или структурных свойств фактически отсутствуют.
В настоящее время в токсикологии обсуждаются следующие вопросы:
пути всасывания и перераспределения на-нообъектов в тканях и органах живого организма;
способности аккумуляции в окружающей среде и пищевых цепочках;
опасности, связанные с чрезвычайно высоким отношением площади поверхности к объему наночастиц;
критически важные физико-химические свойства, влияние квантовых эффектов и реакционная способность наноструктур;
факты связывания и переноса наночасти-цами некоторых особо опасных поллютантов.
При этом констатируется наличие разрыва между имеющимися и необходимыми методами испытания биологической опасности наноструктур. В сложившейся ситуации для выявления биологических и экологических рисков наноиндустрии могут рассматриваться два встречных направления.
С одной стороны, — создание базы, позволяющей осуществлять синтез, селекцию, наработку и испытания биологической опасности наноструктур методами высокопроизводительного экспериментального скрининга.
С другой, — формирование совокупности методов, определяющих возможность предсказания потенциальной опасности нанообъек-тов и прогнозирования процессов переноса, перераспределения и биологического действия выявляемых нанообъектов, накапливающихся в экологических средах, пищевых цепях, растениях, органах сельскохозяйственных животных и человека.
Целью настоящей работы стало рассмотрение возможностей создания тех основ вычислительной токсикологии, которые смогут обеспечивать развитие методологий прогнозирования нежелательных компонент биологического действия наноструктур с различными свойствами.
Составляющие биологических и экотоксикологических рисков
Главными составляющими потенциальных биологических рисков при использовании любых веществ являются: присутствие веществ в
окружающей среде (воздух, пища, вода, почва, растения и пр.); способы поступления вещества в тот или иной организм (дыхательная система, желудочно-кишечный тракт, кожа, искусственное введение или элементы протезов); факторы перераспределения вещества между различными тканями организма; интенсивности взаимодействия привносимого вещества с функционально значимыми молекулярными компонентами тех тканей, в которые оно проникает.
При изучении наноматериалов речь идет о необычных веществах класса нанокласте-ров углерода (фуллерены, нанотрубки, графе-ны, наноконусы и пр.) или агломератах типа коллоидных нанокапель, нанокристаллов, пленок и т. п., то есть агломератах, валентно не связанных или валентно фиксированных частиц. Фактическими источниками рисков для человека и окружающей среды являются промышленные отходы и выбросы нанотех-нологических производств, а также нанома-териалы и наночастицы различной структуры и химического состава, полученные с применением нанотехнологий: строительные материалы, покрытия, одежда, упаковки, косметические и лекарственные средства, а также другие бытовые материалы. В целях анализа предсказуемости токсикологических рисков можно выделить три основных источника потенциальной опасности.
Во-первых, продукты, содержащие водоне-растворимые (гидрофобные, аполярные) нано-компоненты, экотоксикологическая опасность которых обусловлена попаданием в пищевые цепочки воздух-человек и воздух-растения-жи-вотные-человек;
Во-вторых, продукты, содержащие водорастворимые (гидрофильные, полярные) на-нокомпоненты, способные через водные фазы включаться в трофические цепочки вода-расте-ния-животные-человек или непосредственные системы: вода-водоподготовка-человек.
В-третьих, продукты, искусственно приведенные в контакт с тканями организма в ходе применения медицинских, косметических или иных процедур (инъекции, протезы, кремы и т. п.). Такие продукты могут содержать как водо-нерастворимые, так и водорастворимые нано-компоненты.
Аполярные экотоксикологические наноагенты.
Потенциальные экотоксикологически опасные агенты, как правило, существуют в виде аэрозолей нанокластеров или наночастиц, взвешенных в газовой фазе. Возникают они при сжигании углеводородного топлива и мусора, сварке и пайке, добыче полезных ископаемых, в выбросах, связанных с промышленной, бытовой или иной деятельностью человека, включая целенаправленный синтез новых наноструктур. Будучи нерастворимыми в водной среде, эти агенты преимущественно переносятся по воздуху, где благодаря малому размеру, а соответственно весу, могут подниматься в верхние слои атмосферы, вновь опускаться к земной поверхности и циркулировать годами или десятилетиями.
Представляется, что одним из ведущих способов попадания в организм человека или животных является ингаляционный путь, а первичным механизмом биологического действия аполярных наноагентов должно быть взаимодействие с эпителиальными клетками верхних дыхательных путей. Для прогнозирования опасности этого взаимодействия на качественном уровне следует учитывать, что респираторный тракт человека состоит из трех различных частей: носовые пазухи, верхние дыхательные пути и газообменные области альвеол, эпителий которых связывает частицы с размерами 1 — 2, 2 — 8 и 9 — 80 нм на 80, 40 и 60 %, соответственно [2].
Если носовые пазухи и верхние дыхательные пути, связывающие частицы, имеют сравнительно выраженные клеточные барьеры, то альвеолы отделяются от кровотока всего на 500 нм, а барьеры, защищающие от всасывания частиц воздушной среды, гораздо менее выражены. При этом количество ежесуточно потребляемого воздуха у человека составляет около 16 кг, а площадь поверхности всасывания, где кровь контактирует с вдыхаемым воздухом, достигает 140 м2, что способствует возможности попадания значимых количеств циркулирующих в атмосфере наночастиц во внутренний кровоток. Кроме того, гидрофобные частицы небольшого размера (единицы нанометров), достаточно легко проникают сквозь клеточные мембраны за счет механизмов пассивной диффузии по градиенту концентрации. По мере
увеличения размеров (10 и более нанометров) пассивное внутриклеточное проникновение оказывается все более затрудненным. Однако следует учитывать, что в очагах воспалительного процесса существуют значительные межмембранные поры, способные пропускать соединения размерами 50 и более нанометров. Кроме того, при достижении размеров, сравнимых с бактериальными (500—5000 нм), включаются процессы фагоцитоза, прямо способствующие захвату и трансмембранному переносу внешних частиц клетками иммунной системы (рис. 1).
В результате на уровне качественного прогнозирования потенциальной опасности апо-
лярных нанообъекгов представляется возможным предположить, что такие сравнительно небольшие вещества, как короткие нанотрубки, фуллерены, наноалмазы и другие нанокластеры углерода, будут связываться в области назальных пазух и благодаря своей гидрофобности смогут проникать в лимфатическую систему и кровоток.
Ранее нами было показано [3 — 7], что ввиду своих необычных физических свойств нанокластеры углерода могут интенсивно связываться с различными биологическими микро- и макромолекулами: белками, нуклеиновыми кислотами, липидами и углеводами (рис. 1 и 2).
а) б)
Рис. 1. Нанокластеры углерода, взаимодействующие с белками: а — молекула фуллерена С60 в объемном окружении 14 аминокислотных остатков распознающего участка белка; б — несколько углеродных нанотрубок, взаимодействующих с поверхностями типичного структрообразующего белка
В результате можно предположить, что переносимые воздушным путем нанокласте-ры углерода связываются в области назальных пазух и верхних дыхательных путей, проникают через тканевые барьеры липидных мембран (рис. 2,6) и диффундируют в лимфу и кровоток. Связывание с белками (см. рис. 1), в частности с транспортными белками крови, в свою очередь, может способствовать дальнейшему перераспределению таких гидрофобных молекул, как фуллерены и другие нанокластеры углерода, по различным органам и тканям живого организма. Очевидно, что накопление в ткани и взаимодействие с функциональными молекулами белков, нуклеиновых кислот, мембранных липидов и сахаридов будет вызывать множество биологических эффектов, выраженность которых определяется как концентрацией наноугле-рода в ткани-мишени, так и интенсивностью возникающих молекулярных взаимодействий. Аналогичная ситуация будет наблюдаться и для нанокластеров углерода, поступающих в организм человека с пищей контаминированных животных или растений.
Действительно, экспериментальные исследования активности фуллеренов на лабораторных животных обнаруживают множественные и разнонаправленные биологические эффекты различной выраженности у нанокластеров углерода [3, 6, 8]. Полученные в результате молекулярного моделирования энергии взаимодействия кластеров наноуглерода с молекулами-мишенями колеблются от 4 — 9 ккал/ моль (связывание с одиночными цепочками полипептидов) до 20 ккал/моль, что обусловлено комбинацией л-катионных и гидрофобных взаимодействий с транспортными белками, распознающими участками ферментов и нейрорецепторов. Последнее означает, что при значительных концентрациях наноуглерода могут наблюдаться значимые биологические эффекты. Однако максимально достижимые концентрации наноуглерода в крови ограничиваются количеством белков — переносчиков гидрофобных веществ, и они сравнительно невелики. Расчеты, основанные на молекулярном моделировании связывания молекул наноуглерода и альбуминов в условиях конкуренции и связывания с другими транспортируемыми альбумином молекулами, например
эндогенных жирных кислот, показывают, что максимальный уровень фуллеренов в цельной крови не превышает 75 мг/л, что в пересчете на весь организм составляет около 4 мг/кг. Для сравнения: полулетальные дозы метанола составляют около 5000 мг/кг, никотина — 50 мг/кг, боевых отравляющих веществ — порядка 0,1 мг/кг. В целом, нанокластеры углерода оказываются способными проникнуть в организм, преодолев тканевые барьеры в месте введения, перераспределиться между различными гидрофобными ком-партментами в крови, связаться с различными классами и типами биологических молекул, и, как следствие, вызвать различные биологические, но нетоксические эффекты. Последнее объясняется обратимостью молекулярного взаимодействия нанокластеров углерода с вовлекающимися биоструктурами, а главное — уровнем концентрации всасывающихся гидрофобных углеродных структур: он не достигает токсически опасного значения, несмотря на возможности длительного депонирования.
Полярные экотоксикологические наноагенты. К полярным (водорастворимым) наноструктурам относится значительное число материалов, представленных наночастицами или их агломератами. Как правило, они содержат металлы или оксиды, могут попадать в организм ингаляционным путем, но преимущественно — с водой. В отличие от неполярных веществ на-ночастицы и их агломераты с трудом преодолевают клеточные барьеры и перераспределяются в водную фазу, например в кровь, где могут накапливаться в любых концентрациях. Для прогнозирования биологических рисков первоочередной задачей является оценка влияния наночастиц на клеточные поверхности и водорастворимые молекулы крови, а именно белки, углеводы и малые регуляторные молекулы. К главным факторам опасности, свойственным наночастицам, относятся чрезвычайно высокая площадь свободной поверхности по отношению к весу, наличие электрического заряда и высокая активность поверхности в связывании окружающих веществ.
На ранних этапах своего проникновения в организм наночастицы способны взаимодействовать с клеточными поверхностями дыхательных путей или желудочно-кишечного
тракта, а это определяет возможности мембра-нотоксического действия этих агентов. В ряде случаев, в зависимости от размера и формы, они способны проникать во внутриклеточные пространства и нарушать функционирование различных субклеточных структур, например митохондрий. В обоих случаях индуцируются клеточные повреждения, сопровождающиеся гибелью клеток с последующим воспалением. Выраженность обоих процессов зависит от дозы, и воспаление может развиваться в диапазоне от локального до системного.
На более поздних этапах всасывания в организм полярные наночастицы попадают в кровь, где немедленно начинают взаимодействовать с молекулами находящихся в ней веществ. Типичная металлооксидная наночастица сферической формы состоит примерно из 2 тыс. атомов и имеет диаметр около 50 нм, что соответствует площади примерно 8000 нм2. Площадь поперечного сечения малых молекул, циркулирующих в крови, составляет около 20 — 50 нм2, белков — около 200 нм2. Это означает, что одна такая наночастица может связать до 400 малых молекул или 40 белков. При этом связывание не обязано носить специфичный характер. После попадания наночастиц в кровь человека, последние оказываются окруженными «короной» одинарного слоя белков, способного, в зависимости от соотношения размеров, включать от сотни до тысячи белков на одну наночастицу [10]. Процесс инициируется электростатическими взаимодействиями, а его результат стабилизируется гидрофобными связями. Действительно, такие аминокислоты, как аргинин, гистидин, лизин несут положительные заряды на концевых фрагментах азота или, в зависимости от рН, содержат неподе -ленную электронную пару. Аспарагиновая или глютаминовая кислота, напротив, заряжены отрицательно. Следует учесть, что, во-первых, эти аминокислоты составляют четверть всех аминокислот, присутствующих в организме в своем свободном виде; во-вторых, это 25 % от всех аминокислотных остатков, входящих в состав любого белка, и, как правило, большая часть остатков располагается на поверхности белка. Независимо от состава, знака и наличия поверхностного заряда при взаимодействии наночастицы с белками неизбежно
возникают кулоновские взаимодействия типа заряд-заряд или заряд-диполь. Возможны также донорно-акцепторные взаимодействия. В результате такого взаимодействия наноструктур с белками возникают нежелательные конфор-мационные изменения белков и необычные концентрационные сгущения связываемых белков, затрудняющих их распознавание. При этом связывание с наночастицами представляет собой быстрый процесс, протекающий в период времени, измеряемый минутами, и зависящий скорее от типа поверхности и размера наночастиц, чем от вида связываемых ими белков [11]. Функционирование иммобилизованных наночастицами белков фактически прекращается, что означает появление потенциальных биологических рисков, возникающих вследствие попадания в организм сторонних наночастиц.
Прогнозирование потенциального риска
Согласно определению Еврокомиссии, принятому в 2011 году, рекомендуется употреблять термин «нано-» в отношении материалов естественного и искусственного происхождения, содержащих частицы в свободном виде, в виде групп или агломератов, причем как минимум 50 % из этих материалов имеет один из линейных размеров в пределах от 1 до 100 нм. Отдельно отмечается, что в случаях, когда речь идет о здоровье, окружающей среде или конкурентоспособности, доля частиц с размерами 1 — 100 нм может браться в пределах от 1 до 50 %. Также отмечается, что фуллерены, графеновые хлопья и углеродные нанотрубки, у которых одно из измерений может быть меньше нанометра, тоже относятся к наноматериалам [12].
В целях прогнозирования биологической опасности нам представилось целесообразным выделить два класса наноструктур: аполярные и полярные.
Неполярные наноструктуры, как это следует из примера, приведенного для нанокластеров углерода, после своего попадания в организм перераспределяются в гидрофобных компар-тментах, то есть ассоциируются с липидными фракциями клеточных мембран и диффундируют сквозь клеточные барьеры. Проникая в кровоток, они связываются с транспортными белками и распространяются по тканям живого организма, минуя водную фазу. Далее вновь
связываются с мембранными липидами клеток, все более удаленных от места введения. Основным источником биологической опасности может быть фактор длительного депонирования неполярных наноструктур, сочетающийся с возможностями их взаимодействия с биологическими макромолекулами. Авторами данной статьи показана возможность моделирования особенностей взаимодействия наноструктур с белковыми, нуклеиновыми, липидными и углеводными биомолекулами, открывающая возможность систематического прогнозирования биологической опасности наноматери-алов в отношении всех классов возможных, и, в первую очередь, мембранотропных мишеней. Констатирована обратимость молекулярного действия рассматриваемых наноструктур. Для наноуглерода установленная возможность переноса транспортными белками означает, что нанокластеры углерода могут не только переноситься в различные ткани, но и элиминировать из них. Токсикологические риски, связанные с известными формами наноуглерода, на настоящий момент предсказываются нами как умеренные.
Ведущими факторами опасности полярных наноструктур выступает сочетание их свойств, и одно из самых важных — площадь свободной поверхности. Количественные оценки опасности могут быть достигнуты на уровне сопоставления суммарной площади наноча-стиц, проникающих в водные компартменты (кровь, внутриклеточная среда, межклеточная жидкость) организма, и полного поперечного сечения сорбируемых ими биомолекул. Например, при концентрации в крови наночастиц диаметром 50 нм, равной 0,0025 ммоль/л и соответствующей их умеренному уровню, каждая из наночастиц будет связывать до 60 молекул белков сывороточного альбумина, т. е. будут связанными 0,15 ммоль/л белка. При диаметре наночастицы 70 нм количество изымаемых из физиологического оборота белковых молекул будет составлять уже 160 на одну наночастицу, т. е. всего будут связанными около 0,4 ммоль/л белка. Норма содержания альбуминов в крови человека составляет 0,5 — 0,8 ммол/л. Нетрудно
сделать заключение, что при заданной концентрации наночастиц в случае диаметра 0,50 нм уровень альбуминов в крови будет снижаться, а возможно и выходить за пределы физиологической нормы. Во втором примере (диаметр наночастиц 70 нм) имеем критическое содержание уровня альбуминов, вызывающее сдвиги кислотно-основного равновесия крови вплоть до генерализованных отеков, например, легких.
Аналогичная ситуация описывается и при взаимодействии с малыми молекулами. При условии связывания каждой из наночастиц четырьмястами циркулирующими в крови малыми молекулами будет иммобилизовано от 1,0 (5,4 ммоль/л) микромолекулы. Норма содержания глюкозы в цельной крови составляет около 5 ммоль/л, а фосфора — примерно 1 ммоль/л. В случае, если попавшие в кровь наночастицы будут связывать преимущественно глюкозу, то ее уровень может снизиться вплоть до состояний, вызывающих гипогликемическую кому. Снижение уровня общих фосфатов в крови будет вызывать расстройства центральной нервной системы, дефицит АТФ, заторможенность и судорожные припадки. Риски, связанные с полярными наночастицами, могут быть существенными при определенных уровнях их концентрации, размера и поверхностных свойств.
В целом, в качестве основы предсказания биологической опасности полярных наноструктур предлагаются расчеты снижения пулов свободных биологических макромолекул, микромолекул или ионов, нормально циркулирующих в таких водных средах, как плазма крови, межклеточная жидкость и т. п. Для неполярных наноструктур ведущим методом оказывается систематическое молекулярное моделирование взаимодействия с различными классами биомолекул, и в первую очередь — с липидными фракциями биомембран и мембранолокали-зованными белками.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ с использованием оборудования ЦКП «Гетероструктурная СВЧ-электроника и физика широкозонных полупроводников».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Magarshak, Y. Silicon versus carbon. Fundamental nanoprocesses, nanobiotechnology and risks assessmenent [Text]/ Y. Magarshak, S. Kozyrev, A.K. Vaseashta (eds.). — Netherlands, Dordrecht: Springer, 2009.— 416 p.
2. Ramachandran, G. Assessing exposures to nanomaterials in the occupational environment [Text] / G. Ramachandran, J. Park, P. Raynor // Assessing Nanoparticle Risks to Human Health. — Amsterdam, 2011.- P. 21 - 64.
3. Yakutseni, P.P. Biology of fullerenes [Text] / P.P. Yakutseni // Book of Abs. of International Workshop "Fullerenes and Atomic Clusters". — St. Petersburg, 1995. — P. 37.
4. Kozyrev, S.V. Nanobiotechologies: A panorama of directions [Text] / S.V. Kozyrev , P.P. Yakutseni // Russian Nanotechnologies. — 2008. — No. 3. — P. 8 — 11.
5. Yakutseni, P.P. Fullerenes and carbohydrates: Unexpected complex [Text] / P.P. Yakutseni, L.S. Denisova, N.I. Povarov, D.E. Sivokon, S.V. Kozyrev // Fullerenes, Nanotubes and Carbon Nanostructures. — 2006. — Vol. 14, No. 2-3. — P. 537 — 540.
6. Kozyrev, S.V. Fullerenes and biomolecules: Hybrid structures for nanobionics and pharmacology [Text] / S.V. Kozyrev, P.P. Yakutseni// Book of Abs. of International Workshop "Fullerenes and Atomic Clusters". — St. Petersburg, 2005. — P. 49.
7. Kozyrev, S.V. Nanocarbon technology: Prospects and risks [Text] / S.V. Kozyrev, P.P. Yakutseni // Silicon versus
carbon. Fundamental nanoprocesses, nanobiotechnology and risks assessmenent. — Netherlands: Dordrecht, 2009.— P. 9 - 18.
8. Savateeva, T.N. Neurobiological activity offUllerenes C60/C70 [Text] / T.N. Savateeva, M.K. Shevtchuk, P.P. Yakutseni // Book of Abs. of International Workshop "Fullerenes and Atomic Clusters". — St. Petersburg, 1995. — P. 174.
9. Mukovsky, L.A. The toxicological characteristics of fullerenes [Text] / L.A. Mukovsky, P.P. Yakutseni, Yu.A. Lybimov [et al.] // Book of Abs. of International Workshop "Fullerenes and Atomic Clusters". — St. Petersburg, 1995. — P. 173.
10. Bousquet, Y. Molecular mechanisms of the adsorption of the model protein (Human Serum Albumin) on poly(Methylidene Malonate 2.1.2) nanoparticles [Text] / Y. Bousquet, P.J. Swart, N. Schmitt-Colin [et al.]// Pharmaceutical Research. — 1999. —Vol. 16. — No. 1. —P. 141 — 147.
11. Zhang, H. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size [Text] /H. Zyang, K.E. Burnum, M.L. Luna [et al.] // Proteomics. — 2011. — Vol. 11.—Iss. 23. — P. 4569 — 4577.
12. Commission Recommendation of 18 October 2011 on the definition of nanomaterial [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://ec.europa.eu/environment/ chemicals/nanotech/#definition
