CC BY
110
УДК 616.987-07
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ УРОГЕНИТАЛЬНОГО
ХЛАМИДИОЗА
Д.Ф. Хворик, к.м.н., доцент
Кафедра дерматовенерологии с курсом эндокринологии УО «Гродненский государственный медицинский университет»
Установлена взаимосвязь между серотипами, молекулярно-биологическими характеристиками С. trachomatis и клиническими проявлениями хламидийной инфекции.
Ключевые слова: хламидийная инфекция, ПЦР, ДНК, ИППП.
The correlation between serotypes, molecular-biological characteristics of C.trachomatis and different clinical manifestations of Chlamidia infection has been determined. Key words: chlamydia infection, PCR, DNA, STD.
Инфекции, передаваемые половым путем (ИППП) - важнейшая медико-социальная проблема современного общества [1, 2, 3, 5, 6, 7]. Особенностью современной эпидемической ситуации является выраженная активизация процесса распространения ИППП «нового поколения», к которым, в первую очередь, относят хламидийную инфекцию (ХИ) [5]. Ежегодно в мире регистрируется 89 миллионов новых случаев заражения хлами-диозом [6]. Это связано с медицинской и социальной значимостью ХИ, обусловленной целым рядом факторов: высоким уровнем заболеваемости всех слоев населения, трудностями этиологической верификации, стертостью клинической симптоматики, сложностью выбора эффективной терапии, полиморфизмом внутриутробной патологии плода и новорожденного, а также влиянием на демографические показатели [6]. Эпидемиологическая ситуация по урогенитальному хламидиозу (УГХ) также усугубляется нередкой и длительной персистен-цией возбудителя у людей разного возраста. Широкое применение антибиотиков и самолечение при инфекционных заболеваниях способствуют возникновению стертых форм ХИ и носительства возбудителя [8]. Следует учитывать, что распространение хламидиоза регулируется определенными механизмами: свойствами возбудителя заболевания (вирулентность), иммунной структурой населения (восприимчивость к заболеванию), а также особенностями механизма передачи возбудителя [2].
Хламидии - это патогенные для человека микроорганизмы, они не входят в состав нормальной микрофлоры. Возбудители ХИ относятся к семейству Chlamidiaceae, роду Chlamydia. В основу подразделения хламидий на виды положены их различия в антигенном строении. Так, серологически вид С. trachomatis подразделяют на 18 основных серо-варов: А-С выделяются в зонах, эндемичных по трахоме (конъюнктивит хламидийной этиологии); D-K верифицируются при различных клинических формах урогенитальной патологии человека, в том числе, осложненных пневмонией и конъюнктивитом; L1-L3 - соответствуют штаммам,выделенным у больных с клиническими признаками венеричес-
кой лимфогранулемы. Вид C.psittaci включает не менее 13 сероваров, а C.pneumoniae - один серо-вар [10, 11]. Изучая зависимость характера клинической патологии от серотипа возбудителя, установлено, что частота развития эндоцервицита и кровотечения у женщин с хламидийной инфекцией не зависит от варианта серотипа, в то время как у мужчин с низким количеством полиморфноядер-ных лейкоцитов в уретральных соскобах была достаточно высока вероятность выявления серотипа F или G. Серовар F был выявлен у женщины из Сан-Франциско с наличием воспаления тазовых органов [9]. В другом исследовании у мужчин с симптомами хламидиоза оказалась высока вероятность выделения сероварианта Da, в отличие от женщин, у которых выделялся серовариант К [12, 13].
Выраженный полиморфизм клинических проявлений и отсутствие патогномоничных симптомов значительно осложняет клиническую диагностику хламидиозов [7]. Решающее значение в выявлении УГХ имеют методы лабораторной диагностики [3]. Среди методов идентификации возбудителя выделяют: морфологические, культуральные, иммунологические и молекулярно-биологические. В последние годы широкое распространение получили молекулярно-генетические методы диагностики ХИ, позволяющие, помимо качественного ответа о наличии фрагмента ДНК, определять относительную концентрацию ДНК возбудителя в исследуемом материале.
В настоящее время для количественного анализа концентрации специфической ДНК используется метод ПЦР в режиме реального времени (Realtime PCR), сущность которого заключается в детекции накопления флуоресценции реакционной смеси, при этом интенсивность сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР [4]. Важнейшей особенностью этого метода является синхронизация регистрации и амплификации, что дает возможность оценить кинетику процесса, которая зависит от начального количества исследуемого наследственного материала [4, 6].
Цель исследования - установить взаимосвязь между серотипами, молекулярно-биологическими
характеристиками C.trachomatis и различными клиническими проявлениями хламидийной инфекции.
Материалы и методы
Клинико-микробиологическое обследование проведено 42 больным (18 женщин и 24 мужчины) в возрасте от 17 до 44 лет, обратившимся в УЗ «Гродненский областной кожно-венерологический диспансер». Больные были распределены на группы в зависимости от концентрации ДНК С. trachomatis, выделенных серотипов C. trachomatis, варианта инфекции (моно-, микст-инфекция), устойчивости/чувствительности к антибиотикам и преобладающего клинического варианта хлами-дийной инфекции (локализация воспалительного процесса, осложнения).
Диагноз хламидийной инфекции был установлен по клиническим проявлениям и результатам этиологической верификации: определение в сыворотке крови антител к антигенам C.trachomatis методом иммуноферментного анализа (ИФА), выделение хламидий в соскобе из цервикального канала и уретры методом прямой реакции иммуно-флюоресценции (ПИФ). Этиологическая расшифровка микст-инфекции осуществлялась общепринятыми методами.
Для количественного определения специфических фрагментов ompA гена C.trachomatis, кодирующих главный поверхностный протеин MOMP, проводилась полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени (Rotor-Gene 3000, Австралия) с применением видоспецифичных праймеров и TaqMan олигонуклеотидных проб.
Для определения серотипов C.trachomatis образцы ДНК, выделенные из 42 образцов биологического материала (соскобы эпителиальных клеток из урогенитального тракта), положительных в отношении C.trachomatis и прошедших этап амплификации, а также очистки с использованием Centricon-100 колонок, подвергались секвенирующей ПЦР с использованием пар праймеров для детекции вариабельных доменов (VDI-VDIV) ompl гена.
Амплифицированные фрагменты визуализировались электрофорезом в 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Для каждого из 42 образцов было характерно наличие на электрофо-реграмме 4 специфических фрагментов (P1/OMP2, P1/CT6R, CT6F/OMP2 и NL-F/NL-R). Длина фрагмента P1/OMP2 была представлена 1124 парами нуклеотидов (п.н.) в 28 пробах и 1114 п.н. в 14 пробах, фрагмента P1/CT6R 670 п.н. в 28 пробах и 679 п.н. в 14 пробах, фрагмента CT6F/OMP2 в 28 пробах 479 п.н., в 14 - 480 п.н., фрагмента NL-F/NL-R во всех 42 пробах 482 п.н.
ПЦР амплификоны очищались с использованием BigDye XTerminator Purification kit и подвергались секвенированию (с последующим проведением электрофореза на генетическом анализаторе ABI Prism 310) с использованием пар праймеров P1/ OMP2, P1/CT6R, CT6F/OMP2, NL-F/NL-R.
Амплификоны секвенировались в двух направ-
лениях для повышения достоверности реакции. Данные обо всех нуклеотидных последовательностях собирались в единую последовательность порядка 863 пар нуклеотидов, включающую 4 ompl вариабельных домена. Данная последовательность представляла собой порядка 73% от общей протяженности гена C. trachomatis ompl гена.
Данные о нуклеотидной последовательности образцов рассматривались с использованием нук-леотид-нуклеотид BLAST поисковой системы (www. ncb i.nlm.nlm. nih. gov/b last/b l2seq/b 12. html) для идентификации принадлежности той или иной последовательности к определенному серотипу.
Результаты и обсуждение
Сиквенс-анализ региона, включающего VDI-VDIV, показал, что 15 образцов от больных принадлежали к серотипу K с 95% соответствием последовательности геноварианта K/UW31/Cx, 23 образца относились к серотипу D, причем, для 9 образцов имело место 95% соответствие с последовательностью геноварианта D/B185 (X62919), для 3 образцов - 94% соответствие с последовательностью геноварианта D/B185 (X62919), для 11 образцов имело место 95% соответствие с последовательностью геноварианта D/B120 (X62918), 4 образца соответствовали серотипу С с 95% совпадением последовательности геноварианта C/TW-3/OT (AF352789). Исследования по изучению последовательности нуклеотидов 42 ПЦР-положитель-ных образцов, проводимые с использованием программы BLAST, показали преимущественное превалирование генотипа C.trachomatis серотипа D (n=23; 54,8%) над серотипами K (n=15; 37,7%) и С (n=4; 9,5%), при этом имели место различного рода нуклеотидные изменения в исследуемом фрагменте omp 1 гена. Следует отметить, что 19 изолятов, выделенных из биологического материала и идентифицированные как серотип D, различались по 2-м нуклеотидам от D/B185 или D/B120 гена ompl в позициях 574 и 843, а 4 образца имели дополнительное нуклеотидное изменение в позиции 1042. В то же время, 15 изолятов, идентифицированные как серовар K, различались по 2-м нуклеотидам от K/UW31/Cx гена omp1 в позициях 503 и 628, а 4 изолята, идентифицированные как серовар С, различались по 4-м нуклеотидам от C/TW-3/OT гена omp1 в позициях 569, 571, 972 и 1003.
Таким образом, на исследуемой территории отмечено преимущественное выявление серотипов D, K и С C.trachomatis в биологическом материале больных с хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта. Преобладающим серотипом является вариант D (54,7%), несколько реже встречается вариант К (35,7%), еще реже - вариант С (9,6%). При этом отмечается 9495% гомология со стандартными штаммами D/ B120 (X62918), D/B 185 (X62919), K/UW31/Cx (AF063204).
Далее сопоставлен характер клинических проявлений хламидийной инфекции, топического ди-
агноза, осложнением и концентрации ДНК у больных с различными установленными сероти-пами возбудителя. В табл. 1 представлено распределение больных в зависимости от серотипа, осложнений, концентрации ДНК и преобладающей патологии.
Как видно из табл. 1, обращала на себя внимание группа больных, у которых был выявлен се-ротип С C.trachomatis. Несмотря на небольшое количество больных в этой группе, мужчины и женщины имели осложнения хламидийной инфекции в виде артропати-ческой формы хламидиоза (болезни Рейтера) или бесплодия, что весьма важно учитывать в прогностическом плане. В группе пациентов с серотипа-ми D и К C.trachomatis таких больных было заметно меньше. С другой стороны, ни у одного больного с серотипом D C.trachomatis не выявлена артро-патическая форма инфекции (болезнь Рейтера), что также важно учитывать для прогноза развития осложнений. Частота такого осложнения, как бесплодие в сравниваемых группах была неодинаковой: от 13,3% при серотипе К C.trachomatis, 26,0% с серотипом D C.trachomatis и до 50% с серотипом С C.trachomatis. Кроме того, средний стаж заболевания пациентов с серотипом С C.trachomatis был значительно выше, чем у больных с серотипами К и D C.trachomatis.
Топический диагноз был представлен различной патологией. Среди больных мужчин с тремя серотипами C.trachomatis преобладали уретриты и простатиты, частота которых при серотипе К C.trachomatis заметно превышала показатели других групп. Среди женщин обращало внимание наличие большего количества больных с эндоцерви-цитами в группе с серотипом D C.trachomatis, чем при других серотипах. Бесплодие среди женщин диагностировано во всех группах, однако в при серотипе С C.trachomatis отмечено у всех больных, в группе К - у 2 из 3 больных, в группе D ф/В120 (Х62918) - у 3 из 6 больных, в группе D ф/В185 (Х62919) - у 3 из 7 больных.
Ранее нами было установлено, что у больных хламидийной инфекцией имело место колебание концентрации ДНК C.trachomatis в широких пределах, зависящее от различных причин: от условно низкого уровня (до 1,0х104 копий/мл), среднего - от 1,1 х104 до 2,0х105, до высокого - свыше 2,1х105 копий/мл. Причем, средняя концентрация ДНК C.trachomatis без учета характера патологии и локализации воспалительного процесса у мужчин составляла 1,5х105±0,2х105 копий/мл, у женщин -
Таблица 1 - Распределение наблюдаемых больных хронической формой хламидийной инфекции в зависимости от серотипа C.trachomatis, характера патологии, осложнений и концентрации ДНК
Пол Серотипы C.trachomatis Топический диагноз, (п) Осложнения, (п) Концентрация ДНК, копий/мл
Мужчины (n=24) C/TW-3/OT (AF352789) Уретрит (1) Простатит (1) Болезнь Рейтера (2) 3,3х103±0,5х103
D/B120 (X62918) Уретрит (5) Нет 7,1х104±1,3х104
D/B185 (X62919) Уретрит (5) Простатит (4) Нет 8,6х104±0,4х104
K/UW31/Cx (AF063204) Уретрит (12) Простатит (3) Болезнь Рейтера (3) 4,1х104±1,0х104
Женщины (n=18) C/TW-3/OT (AF352789) Вульвовагинит (2) Бесплодие (2) 5,9х103±0,2х103
D/B120 (X62918) Вульвовагинит + Эрозия шейки матки (2) Аднексит (2) Вульвовагинит (1) Эндоцервицит (1) Бесплодие (3) 6,8х104±2,3х104
D/B185 (X62919) Вульвовагинит (3) Эндоцервицит (2) Аднексит (1) Эрозия шейки матки (1) Бесплодие (3) 5,9х104±1,9х104
K/UW31/Cx (AF063204) Вульвовагинит (2) Эрозия шейки матки (1) Бесплодие (2) 2,2х104±0,3х104
4,3х104 ±0,5х104 копий/мл [4]. В связи с этим нами были проведены сравнения показателей концентрации ДНК в зависимости от серотипа C.trachomatis. Как видно из табл. 1, среди мужчин и женщин наиболее низкие концентрации ДНК выявлены у больных с генотипом С, что совпадало с ранее полученными данными о низком уровне ДНК у больных с осложненными формами хронической инфекции [4]. Наиболее высокие концентрации установлены при серотипе D у мужчин (выше, чем у женщин). Также более высокий уровень ДНК среди мужчин оказался при серотипе К, в 2 раза превышающий показатель женщин.
Выделение у больных хламидийной инфекцией других возбудителей инфекций, передающихся половым путем (микст-инфекции), послужило причиной изучения зависимости варианта инфекции (моно-, микст-) от серотипа (табл. 2).
Хламидии в качестве единственного этиологического агента были выявлены только у 10 пациентов (23,8 %). Среди микст-инфекционных агентов выделялись уреаплазмы (28,6%), кандиды (16,7%), микоплазмы (14,3%), трихомонады (11,9%), гарднереллы (4,8%). Как видно из табл. 2, во всех группах больных, независимо от серотипа и его вариантов, не выявлено преобладания хла-мидийной инфекции, протекающей в виде моноинфекции (23,8%).У всех больных с серотипом С хламидиям сопутствовали грибы рода Candida. Этот возбудитель редко встречался при серотипе D и не был выделен у женщин с серотипом К. В группе женщин с серотипов D заметно было преобладание трихомонад. Уреаплазмы чаще встречались в группах мужчин и женщин с серотипом К, чем в других группах.
Известна высокая частота антибиотикорезис-тентности (полирезистентности) C.trachomatis при хронической хламидийной инфекции [14]. Основными стартовыми препаратами, применяемыми для лечения хламидиоза, являются тетрациклины и макролиды. Нами изучена частота антибиотико-
Таблица 2 - Данные о наличии смешанной инфекции и показатели устойчивости C.trachomatis к антибиотикам у больных хламидиозом в зависимости от серотипа
Серотипы C.trachomatis Устойчивость к:
Пол Вариант инфекции тетрациклинам тетрациклинам и макролидам
Мужчины (n=24) C/TW-3/OT (AF352789) Моноинфекция (1) +Кандиды (1) -/- 2/0
D/B120 (X62918) Моноинфекция (2) +Уреаплазмы (1) +Микоплазмы (1) +Кандиды (1) 4/0 1/0
D/B185 (X62919) Моноинфекция (1) +Уреаплазмы (4) 3/1 1/1
K/UW31/Cx Моноинфекция (5) +Кандиды (3) 6/0 6/0
(AF063204) +Уреаплазмы (3) +Микоплазмы (1)
Женщины (n=18) C/TW-3/OT (AF352789) Моноинфекция (1) +Кандиды (1) 0/0 2/0
D/B120 (X62918) +Трихомонады (3) +Микоплазмы (2) +Гарднереллы (1) 4/1 1/1
+Трихомонады (2) +Микоплазмы (2) 2/1 4/1
D/B185 (X62919) +Гарднереллы (1) +Уреаплазмы (1) +Кандиды (1)
K/UW31/Cx (AF063204) +Уреаплазмы (2) +Микоплазмы (1) 2/0 1/0
резистентности C.trachomatis к данным антибиотикам в зависимости от варианта серотипа возбудителя. Обращало внимание то, что C.trachomatis всех больных с серотипом С была 100% устойчива как к тетрациклинам, так и к макролидам одновременно. Если учесть, что это были больные с осложненными вариантами инфекции, то можно найти объяснения данному факту.
Такая же ситуация отмечена у больных с серотипом К, у которых все выделенные штаммы C.trachomatis имели резистентность к испытуемым антибиотикам, а среди больных так же, как в группе с серотипом С, были пациенты с осложненными формами (артропатический вариант и бесплодие), что совпадало с известными данными о преимущественном персистировании возбудителя, связанного с серотипом группы С [9].
Заключение
На основании проведенных исследований было установлено преимущественное распространение серотипов D (54,7%), К (35,7%) и С (9,6%) C.trachomatis в биологическом материале пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта. При этом в 94-95% отмечается гомология со стандартными штаммами D/B120 (X62918), D/B185 (X62919), K/UW31/ Cx (AF063204). Установлено, что для 19 изолятов, идентифицированных как серотип D, было характерно наличие различий по двум нуклеотидам от D/B185 или D/B120 гена ompl в позициях 574 и 843, а 4 образца имели дополнительное нуклеотид-ное изменение в позиции 1042; в отношении серо-типа К были выявлены нуклеотидные изменения от K/UW31/Cx гена ompl в позициях 503 и 628. Однако наибольшим числом нуклеотидных замен в данном исследовании характеризуется серотип
С, в отношении которого выявлены различия от C/TW-3/OT гена ompl по 4-м нуклеотидам в позициях 569, 571, 972 и 1003.
Сопоставительный анализ серологического варианта возбудителя с клиническими проявлениями показал, что более частыми причинами воспалительных процессов урогенитального тракта являются серотипы D и К C.trachomatis, вызывающие развитие уретрита, аднексита, эндоцервици-та и другой патологии. С серотипом С и К C.trachomatis прослеживается ассоциативная взаимосвязь развития осложненных форм УГХ в виде артропатических форм и бесплодия. Данные сероварианты чаще обладают высокой степенью антибиотикорезистентности, что может быть одной из причин формирования осложнений ХИ.
Литература
1. Адаскевич, В.П. Инфекции, передаваемые половым путем: руководство для врачей / В.П. Адаскевич.-М., 1999.-215 с.
2. Аковбян, В.А. Болезни, передаваемые половым путем: уроки прошлого и взгляд в будущее / В.А. Аковбян, В.И. Прохоренков // Вестник дерматологии и венерологии.-1995.-№3.- C.16-19.
3. Делекторский, В.В. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза / В.В. Делекторский, Г.Н. Яшкова, С.А. Мазурчук // Клиническая лабораторная диагностика. - 1995. - № 6. - С. 108-110.
4. Костюк, С.А. Новые аспекты клинического применения по-лимеразной цепной реакции / С.А. Костюк, О.К. Кулага, Д.Ф. Хворик // Медицинские новости. - 2006.- №5.-С. 14-18.
5. Лобзин, Ю.В. Хламидийные инфекции / Ю.В. Лобзин, Ю.И. Ляшенко, А.Л. Позняк. - СПб.: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2003.-400с.
6. Семенов, В.М. Хламидийная инфекция / В.М.Семенов, Д.М.Семенов, Д.Ф.Хворик.- Витебск, 2005. - 206 с.
7. Скрипкин, Ю.К. Проблема диагностики и лечения урогенитального хламидиоза в России / Ю.К. Скрипкин, А.А. Кубанова., В.А. Аковбян // Антибиотики и химиотерапия. - 1996. -№ 2. - С.5-8.
8. Шинский, Г.Э. Эпидемиологические аспекты хламидийной инфекции / Г.Э. Шинский, В.А. Мерзляков, С.Б. Тимофеева. // Вестник дерматологии и венерологии. -1999-№1.-C.11-13.
9. Dean, D. Recombination in the genome of Chlamydia trachomatis involving the polymorphic membrane protein C gene relative to omp A and evidence for horizontal gene transfer / D. Dean // J.Bacteriol., 2004.-Jul.-186 (13):4295-306.
10. Frost, S.D. Using sexual affiliation networks to describe the sexual structure of a population/ S.D. Frost // Sex. Transm. Infect., 2007.-Aug;83. - Suppl 1:137-42.
11. Lundemose, A.G. Characterization and identification of early proteins in Chlamydia trachomatis serovar L2 by two-dimensionalgel electrophoresis / A.G. Lundemose, S. Birkelund, P.M. Larsen // Infection. Immun. - 1990. -Vol. 58. - P. 2478.
12. Morre, S. A. Murine models of Chlamydia trachomatis genital tract infection: use of mouse pneumonitis strain versus human strains/ S.A. Morre, J.M. Lyons // Infect. Immun.- 2000.-Dec;68(12):7209-11.
13. Mon^, S.A. Genotyping of Chlamydia trachomatis in urine specimens will facilitate large epidemiological studies/ S.A. Morre, R. I. Moes, J.P. Van Valkengoed, J.T. Boeke, C.J. Van Eijk Meijer, A.J. Van den Brule// J. Clin. Microbiol.-1998.- 0ct;36(10):3077-8.
14. Persson, K. The role of serology, antibiotic susceptibility testing and serovar determination in genital chlamydial infections / K. Persson // Best Pract. Res. Clin. Obstet Gynaecol., 2002.-Dec;16 (6):801-14.
Поступила 08.05.08
