CC BY
63
ДОСТИЖЕНИЯ НАУКИ В ПРАКТИКУ
УДК 577.112.7:616-006 14.01.00 - Клиническая медицина
© С М. Деев, Е.Н. Лебеденко, 2015
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ*
Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, отдел иммунологии ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Россия, 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, ГСП-7, тел.: (8499) 724-71-88, e-mail: deyev@ibch.ru; профессор кафедры биофизики, ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», 603950, Нижний Новгород, просп. Гагарина, д. 23.
Лебеденко Екатерина Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии, отдел иммунологии ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Россия, 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, ГСП-7, тел.: (8926) 241-70-30, e-mail: elebedenko@mail.ru.
Сегодня в России в условиях резкого ухудшения экологии и постоянного роста стрессовых воздействий значительно увеличивается риск развития злокачественных новообразований. Необходимы новые подходы и лекарственные средства для лечения онкологических заболеваний как на ранних стадиях, когда лечение особенно эффективно, так и на поздних стадиях, когда из-за метастазирования применение хирургических методов уже не дает положительных результатов. Благодаря последним достижениям фундаментальной науки стало возможным определить молекулярный профиль заболевания и адресно воздействовать на конкретные молекулярные мишени. Значительный прогресс в области новых приборов и материалов обусловил возникновение новой медицинской дисциплины - тераностики, объединяющей точную диагностику молекулярной мишени и эффективное и направленное терапевтическое воздействие на нее. Рассмотрен ряд мультифункциональных соединений для тераностики опухолей с определенным молекулярным профилем, сконструированных в лаборатории молекулярной иммунологии (Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).
Ключевые слова: противоопухолевые антитела, онкомаркер HER2, тераностика.
NEW APPROACHES ТО DIAGNOSTICS AND THERAPY OF SOCIALLY SIGNIFICANT DISEASES
Deyev Sergey Mikhailovich, Dr. Sci. (Biol.), Professor, corresponding member of RAS, Head of Laboratory of molecular immunology, Department of immunology, the M.M. Shemyakin-Yu.A. Ovchin-nikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, 16/10 Miklukho-Maklaya St., GSP-7, Moscow, 117997, Russia; Professor of Department, N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, 23 Gagarin ave., Nizhny Novgorod, 603950, Russia, tel.: (499) 724-71-88, e-mail: deyev@ibch.ru.
Lebedenko Ekaterina Nikolaevna, Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate of Laboratory of molecular immunology, Department of immunology, the M.M. Shemyakin-Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, 16/10 Miklukho-Maklaya St., GSP-7, Moscow, 117997, Russia, tel.: (926) 241-70-30, e-mail: elebedenko@mail.ru.
Nowadays, in the conditions of sharp deterioration of the environment and constant growth of stress influences, more and more people in Russia are exposed to the risk of cancer. This necessitates the creation of new approaches and new drugs for the treatment of oncological diseases both at early stages, when the therapy is most efficient, and at later stages, when surgical methods are inefficient due to metastasizing. Recent advances of the fundamental science made it possible to determine the molecular profile of the disease and directionally affect specific molecular targets. Significant progress in designing new devices and materials preconditioned the development of a new branch of the medical science - theranostics, which combines a precise diagnostics of the molecular target with addressed and efficient action
* Работы по получению рекомбпнантных белков выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 14-24-00106); работы по конструированию биоконъюгатов с полупроводниковыми нанокристаллами выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (грант № 14.750.31.0022).
on it. The article surveys a number of multifunctional compounds designed in the laboratory of molecular immunology of The M.M. Shemyakin-Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences for the purpose of theranostics of tumors with a certain molecular profile.
Key words: anti-tumor antibodies, oncomarker HER2, theranostics.
Развитие молекулярной медицины диктует необходимость разработки новых способов, обеспечивающих высокочувствительную детекцию и высокоизбирательную терапию злокачественных новообразований. Значительная мутационная изменчивость опухолевых клеток, в том числе в ходе лечения, приводит к изменению молекулярного профиля опухоли и возникновению лекарственной резистентности. Поэтому крайне важной и актуальной задачей является введение в арсенал современной онкологии широкого набора соединений с разным механизмом воздействия на раковые клетки. Точная диагностика патогенных молекулярных мишеней и адресное воздействие на них должны обеспечивать высокую селективность противоопухолевой терапии. Этим практическим задачам отвечает новая дисциплина - тераностика (терапия + диагностика), которая объединяет диагностику заболевания и персонифицированное лечение пациента с улучшенной эффективностью и безопасностью [26].
Тераностика возникла в последнее десятилетие как новая стратегия в медицине благодаря техническому прогрессу в области разработки приборов и агентов для получения изображений и визуализации биологических объектов и в области технологий новых наноматериалов, а также благодаря достижениям фундаментальной науки в исследовании молекулярных механизмов заболеваний. Выяснение молекулярных механизмов заболеваний и поиск молекулярных мишеней для их диагностики и лечения - еще одна важнейшая область исследований, которая составной частью входит в терано-стику и делает ее именно медицинской стратегией [14].
Одними из наиболее изученных опухолевых молекулярных мишеней являются трансмембранные рецепторные тирозинкиназы семейства ERBB1-4. В норме ERBB-рецепторы участвуют в процессах роста, дифференцировки, миграции и апоптоза эпидермальных клеток. Сигнальная сеть, инициируемая взаимодействием рецепторов семейства ERBB с лигандами, и ее ключевые элементы, регулирующие направление и скорость передачи сигнала, играют важную роль в патогенезе опухолевых заболеваний [4]. Нарушение структуры и регуляции ERBB-рецепторов приводит к неконтролируемому росту клеток и характерно для целого ряда эпидермальных опухолей, а также для других заболеваний.
Ген ERBB2 - один из первых идентифицированных онкогенов человека [24]. Амплификация этого гена и суперэкспрессия соответствующего рецептора наблюдается в 20-30 % злокачественных опухолей молочной железы [21]. Статус онкогена HER2/neu {ERBB2) является одним из основных показателей для идентификации различных субтипов опухолей молочной железы, прогноза заболевания и выбора соответствующих методов лечения пациентов.
Амплификация гена ERBB1, сопряженная с суперэкспрессией рецептора и генетической нестабильностью опухолевых клеток, характерна для злокачественных опухолей головы и шеи, колорек-тального рака, карцином молочной железы и немелкоклеточного рака легких и составляет для произвольной выборки опухолей 0-14 %, для карцином - до 28 % [31]. До недавнего времени статус этого гена не использовался в качестве прогностического признака при раке молочной железы, однако увеличенная экспрессия этого гена, обнаруженная в 40 % опухолей этого вида, в большинстве случаев гормонозависимых, позволяет рассматривать его как важный маркер. Повышенная экспрессия ERBB1 отмечена также в 80 % случаев тройного негативного рака молочной железы [8], недавно выделенного класса агрессивных опухолей молочной железы, для которых характерно отсутствие гормональной зависимости и суперэкспресии онкогена ERBB2.
ERBB-рецепторы могут приобретать свойства онкогенов также вследствие спонтанных соматических мутаций, возникающих в опухолевых клетках. Активирующие мутации в киназном домене ERBB1 и ERBB2 вызывают лиганд-независимое увеличение сигнальной активности, резистентность к лечению тирозинкиназными ингибиторами, замедление интернализации и деградации интернализо-ванного рецептора [4, 23]. Небольшие делеции или вставки в Р-петле киназного домена ERBB1, не нарушающие рамку считывания, обнаруживают в 10-13 % случаев немелкоклеточного рака легкого. Аналогичные соматические мутации ERBB2 были выявлены в 5 % случаев немелкоклеточного рака легкого, в 3-5 % случаев карцином желудочно-кишечного тракта и в < 5 % случаев карцином молочной железы [25]. В клетках мультиформной глиобластомы, одной из самых агрессивных опухолей
мозга, была обнаружена дупликация киназного домена EGFR (ERBB1), ассоциированная с конститутивной активизацией киназы и злокачественным течением заболевания [20]. Экспрессия активирующих мутантов ERBB2 не только усиливает передачу сигнала, но и индуцирует ряд проопу-холевых ростовых факторов и меняет микроокружение опухоли [27]. Так, недавно было показано, что экспрессия мутантного ERBB2 в эпителиальных клетках молочной железы активирует аутокринный трансформирующий фактор роста TGFßl и лиганды рецептора ERBB1 TGF-a и амфирегулин, а также эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF) [27].
Нарушения регуляции сигнальной сети, опосредованной рецепторами ERBB, ведущие к опухолевому процессу, могут происходить на всех ее уровнях [4]. Рецепторы ERBB, а также многие компоненты этого каскада, в первую очередь, киназы (киназы BRAF, KRAS, HRAS, NRAS, Akt, МЕК1, PI3K, фосфатаза PTEN, шаперон HSP90), являются диагностическими маркерами и терапевтическими мишенями при злокачественных новообразованиях. Для их терапии разработан целый ряд ингибиторов киназ как широкого спектра действия, так и узкоспецифичных, воздействующих на белки сигнальной сети ERBB практически на всех уровнях передачи сигнала. К клиническому применению разрешены три ингибитора киназ, специфичных к ERBB-рецепторам: обратимые ингибиторы киназ-ной активности EGFR gefitinib (Iressa, AstroZeneca, Великобритания/Швеция) и erlotinib (Tarceva, La Roche, Швейцария) и препарат нового поколения - необратимый ингибитор EGFR и ERBB2 1а-patinib (Tykerb, GlaxoSmithKline, Великобритания) [30]. Кроме того, все большее внимание привлекают новые «мультитаргетные» ингибиторы киназ, блокирующие одновременно разные сигнальные пути. В качестве примера можно привести препарат vandetanib (Caprelsa, AstroZeneca, Великобритания/Швеция) [13], ингибирующий киназную активность VEGFR и EGFR.
Как правило, низкомолекулярные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ характеризуются невысокой специфичностью по отношению к раковым клеткам, высокой токсичностью и развитием лекарственной устойчивости при длительном применении, связанной с активацией нижележащих медиаторов передачи сигнала или активацией обходных сигнальных путей [13]. Кроме того, эффективность низкомолекулярных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ зависит от полиморфизма генов ERBB-рецепторов: например, мутация Т790М, на порядок повышающая аффинность EGFR к АТФ, ассоциирована с невосприимчивостью пациента к лечению конкурентными ингибиторами gefitinib и erlotinib [29].
Наряду с низкомолекулярными ингибиторами киназ наибольшие усилия исследователей были сконцентрированы на поиске путей блокирования сигнальной системы ERBB на входе сигнала, то есть на уровне рецепторов. Высокая концентрация рецепторов ERBB на поверхности ряда опухолевых клеток по сравнению с базовым уровнем на клетках здоровых тканей, а также их ключевая роль в передаче сигналов позволили использовать эти рецепторы как селективные мишени для монокло-нальных антител, специфичных к внеклеточным доменам ERBB. Избирательное воздействие моно-клональных антител на раковые клетки основано на нескольких различных механизмах, таких, как привлечение к опухоли клеток иммунной системы, прямое нарушение сигнала путем конкурентного связывания с рецептором, нарушение димеризации рецептора, направленная доставка токсинов или других действующих агентов [1].
В настоящее время для клинического применения в онкологии принято около 20 препаратов моноклональных антител (мкАТ), специфичных, в том числе, к таким распространенным опухолевым маркерам, как ERBB1, ERBB2 и PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen) [1, 2]. Для лечения больных с метастатической колоректальной карциномой, немелкоклеточным раком легкого и некоторыми другими опухолями применяют анти-ERBBl-антитела Cetuximab (Erbitux, Bristol-Myers Squibb, USA) и Panitumumab (Vectibix, Amgen, USA).
Гуманизированное моноклональное анти-ЕЯВВ2-антитсло Trastuzumab (Herceptin, Genentech, USA) [7] было первым препаратом мкАТ, разрешенным Food and Drug Administration (FDA (US)) для терапии рака. Применение Trastuzumab для лечения рака молочной железы оказывается эффективным в 20-30 % случаев при его использовании на ранних стадиях заболевания у больных, раковые клетки которых суперэкспрессируют ERBB2 [16]. При комбинированном лечении Trastuzumab и цитостатиче-скими химическими препаратами (в особенности при использовании таксанов и винорелбина) эффективность возрастает до 50-80 %. Однако при длительном применении Trastuzumab проявляет кардио-токсичность и некоторые другие побочные эффекты [17], у многих больных развивается невосприимчивость к лечению, в результате чего требуется прибегать к комбинированной терапии, либо изменять стратегию лечения [28].
В 2013 г. для клинического применения были разрешены еще два препарата на основе моно-клональных антител, специфичных к опухолевому маркеру ERBB2. Гуманизированное моноклональ-ное анти-ЕЯВВ2-антитсло Pertuzumab (Omnitarg, Genentech, USA) специфично к другому эпитопу, чем Trastuzumab, и, в отличие от Trastuzumab, стерически препятствует образованию гетеродимеров ERBB2/ERBB1 и ERBB2/ERBB3, ингибируя передачу сигнала в каскадных цепях [11].
Одной из основных проблем, выявленных при терапевтическом применении антител, оказалась их недостаточная эффективность. Для усиления воздействия на раковые клетки антитела конъюги-руют с токсинами различной природы [2]. Единственный принятый в настоящее время к клиническому применению иммунотоксин, специфичный к рецептору ERBB2, Trastuzumab emtansine (Kadcyla, La Roche, Швейцария) [6], имеет гетерогенный состав из-за различного соотношения молекул токсина и антитела. Таким образом, основным недостатком химической конъюгации антител с действующими агентами является гетерогенность, следствием которой может быть неоптимальная эффективность полученного препарата, а также невозможность стандартизации процесса его производства.
В отличие от низкомолекулярных ингибиторов киназ, терапевтические моноклональные антитела гораздо менее токсичны для организма. Кроме того, наряду с применением моноклональных антител в качестве действующих агентов они широко используются как нацеливающие модули для создания мультифункциональных противораковых соединений, в том числе агентов для тераностики [1,2].
Эффективный тераностический агент должен одновременно обеспечивать следующие возможности: 1) направленную доставку к молекулярной мишени, 2) визуализацию патологического очага и его прижизненный имиджинг в процессе лечения, 3) эффективное и селективное воздействие на молекулярную мишень [10].
Современные методы конструирования тераностических агентов основаны на присоединении адресной молекулы к визуализирующему и/или лекарственному компоненту. В случае, когда оба структурно-функциональных модуля представлены белковыми молекулами, они могут быть объединены в единую полипептидную цепь методами генной инженерии. Генно-инженерный подход к конструированию белковых мультифункциональных тераностических агентов позволяет преодолевать целый ряд существенных недостатков традиционных методов химической конъюгации белков: недостаточную воспроизводимость и непостоянство состава конъюгатов, возможное снижение аффинности антитела или эффективности действия токсина, а также наличие примесей неконъюгированных антител и токсина в конечном продукте. Еще одним преимуществом рекомбинантных тераностических агентов является возможность их применения либо в виде белка, который может быть наработан в препаративных масштабах в биотехнологических системах экспрессии, либо в виде генов для гено-терапии, доставляемых в опухоль, например, с помощью вирусных систем.
В рамках этого подхода для воздействия на опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие поверхностный маркер HER2/neu, в лаборатории молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН были сконструированы два полностью генетически кодируемых иммунофотосенсибилизатора 4D5scFv-KillerRed и 4D5scFv-mSOG [15, 22] (рис. 1а) [3]. В качестве адресного компонента, обеспечивающего направленную доставку иммунофотосенсибилизатора к клеткам-мишеням, использовали анти-ЕЯВВ2-миниантитсло 4D5. В качестве одновременно визуализирующих и токсичных компонентов использовали флуоресцентные фототоксичные белки KillerRed и miniSOG. В результате создания этих полностью генетически кодируемых иммунофотосенсибилизаторов впервые удалось объединить в единой полипептидной молекуле все три функции, необходимые для тераностического агента: адресную, диагностическую и терапевтическую. Было показано, что сконструированный иммунофотосенсибилизатор 4D5scFv-KillerRed при облучении специфически поражает клетки аденокарциномы яичника человека SKOV3, гиперэкспрессирующие онкомаркер ERBB2 [22]. Поскольку оказалось, что белок KillerRed обладает более низкой фотоиндуцируемой цитотоксичностью, чем химические фотосенсибилизаторы, была продолжена работа по созданию более эффективной конструкции. Второй полностью генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор 4D5scFv-miniSOG специфически связывается с клетками аденокарциномы молочной железы SKBR3, гиперэкспрессирующими онкомаркер ERBB2, и обладает в отношении них высокоспецифичной фотоиндуцированной цитотоксичностью (ICeo 160 нМ), в 10 раз превышающей цитотоксичность химических конъюгатов порфиринов с анти-НЕЯ2/пси-мини-антителами 4D5scFv [15]. Оба иммунофотосенсибилизатора являются, кроме того, флуоресцентными рекомбинантными белками и могут быть использованы для оптической визуализации опухолевых клеток [15, 22].
а)
Исходные компоненты
Адресные белки различной специфичности
Флуоресцентные белки
Фототоксичные белки
б)
Исходные компоненты
Адресные белки различной специфичности
Белки адаптерной системы барназа:барстар
Визуализирующие агенты
в)
Исходные компоненты
Адресные белки р \ различной специфичности СЫ
Белки адаптерной А системы барназа:барстар г
Наночастицы
Адресные флуоресцентные белки
Иммунотоксины
Адресные фототоксичные белки
Рекомбинантные белки
Конъюгаты исходных компонентов с белками АСББ
Супрамолекулярные производные на основе белков
Конъюгаты исходных компонентов с белками АСББ
Супрамолекулярные производные на основе белков и наночастиц
Рис. 1. Схема универсальном модульной платформы для конструирования адресных мультифункциональных гибридных структур для тераностики: мультифункциональных рекомбинантных белков (я), супрамолекулярных комплексов на основе адаптерной системы барназа:барстар (АСББ) (б) и гибридных супрамолекулярных комплексов на основе АСББ и наночастиц (в) |3|
При необходимости адресные и действующие компоненты в генетически кодируемом терано-стическом агенте можно варьировать путем замены соответствующего фрагмента гена, однако эта задача не является тривиальной и требует специальных усилий при конструировании и тщательной проверки конечного продукта. Таким образом, создание каждого белкового тераностического агента всегда представляет собой новое самостоятельное исследование. Одним из путей решения этой проблемы является создание универсальной модульной платформы, обеспечивающей простоту сборки мультифункциональных комплексов с заранее заданными свойствами из уже имеющегося (готового) набора модулей различной функциональности - направляющих, диагностических, терапевтических.
В лаборатории молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН была разработана универсальная модульная платформа для конструирования тераностических агентов на основе самосборки гетеромерных надмолекулярных структур с помощью белковой адаптерной системы барназа:барстар (рис. 16) [1, 9]. Эти белки, барназа и барстар, образуют прочный комплекс и характеризуются чрезвычайно быстрой кинетикой и высокой аффинностью связывания. С использованием генно-инженерных методов оба белка могут быть объединены с адресными одноцепочечными антителами, нацеливающими конструкцию на клетки-мишени, флуоресцентными белками, обеспечивающими визуализацию, и с белковыми противоопухолевыми агентами: токсинами, иммунофотосенсибилизаторами, ферментами. Теоретически предложенная стратегия применима для олигомеризации любых белков, которые без потери функциональности могут быть присоединены к белкам пары барназа:барстар, и является особенно привлекательной для получения гетероолигомерных конструкций благодаря строгому соотношению компонентов 1 : 1 в комплексе, отсутствию их неспецифической агрегации, а также исключительно
высокой специфичности взаимодействия барназы и барстара, практически исключающей проблемы образования неправильных пар.
Адаптерная система барназа:барстар хорошо себя зарекомендовала в качестве «молекулярного конструктора» для создания противоопухолевых мультивалентных и биспецифических миниантител и белковых бифункциональных агентов для визуализации опухолевых клеток человека in vitro и in vivo [1, 3, 9], а также была использована для решения некоторых других биомедицинских задач, например, для иммунохимического анализа [3].
Было показано, что силы взаимодействия двух белков, барназы и барстара, достаточно для объединения и удерживания как нано-, так и микрочастиц в единой суперструктуре. Это позволяет включать в состав конструируемых тераностических агентов эти материалы нового вида, представляющие собой частицы различной природы (квантовые точки, нанозолото, магнитные частицы, нано-алмазы, апконвертирующие нанофосфоры, полимерные наночастицы) с размерами 1-200 нм и обладающие уникальными физико-химическими характеристиками, не свойственными их аналогам большого размера. Уникальные физические свойства наночастиц (квантово-размерный эффект в полупроводниковых наночастицах-квантовых точках, суперпарамагнетизм в некоторых оксидных на-ночастицах, поверхностно усиленное Рамановское рассеяние металлических наночастиц - плазмон-ный резонанс) позволяют значительно расширить возможности молекулярного имиджинга и физического (теплового, оптического, электромагнитного, акустического) воздействия на клетки.
Важной особенностью наночастиц является их развитая поверхность с чрезвычайно большой удельной площадью, пригодная для связывания с различными молекулами. Для биомедицинского применения наночастицы, как правило, покрывают полимерами с различными реакционноспособны-ми группами, которые предоставляют широкую возможность интегрировать в наночастицы дополнительные функциональные модули, сообщая им новые свойства. Такая функциональная гибкость наночастиц позволяет использовать их в качестве диагностических или терапевтических агентов, а также одновременно в обоих качествах. Благодаря своим нанометровым размерам наночастицы способны проникать в микроциркуляторное русло в организме, а также преодолевать различные биологические барьеры для достижения тканей-мишеней. Размер, поверхностный заряд и гидрофобность наночастиц можно настраивать (регулировать) в процессе получения для минимизации клиренса в почках и печени, увеличения времени циркуляции в кровяном русле и уменьшения потенциальной иммуно-генности.
Возможности модульного подхода к конструированию мультифункциональных гибридных структур как универсальной платформы, применимой для микро- и наночастиц различной природы, были исследованы в лаборатории молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН на целом ряде наночастиц, обладающих характеристиками, привлекательными для целей тераностики и биоимиджинга, включая коллоидное золото, квантовые точки, магнитные наночастицы, люминесцентные наноалмазы и апконверсионные нанофосфоры (рис. 1в) [5, 12, 18, 19]. Так, например, самосборку надмолекулярных структур с использованием адаптерной пары барназа:барстар осуществили с использованием магнитных микрочастиц (ММЧ) и флуоресцентных полупроводниковых наночастиц, так называемых квантовых точек (КТ), в коллоидном растворе. Предварительно магнитные микрочастицы конъюгировали с барназой, а флуоресцентные наночастицы - с барстаром. При этом было показано, что при смешивании этих частиц происходит самосборка бифункциональных комплексов за счет взаимодействия барназы и барстара [18]. Добавление адресных мини-антител в составе рекомбинантного белка с барназой позволило получить трифункциональный надмолекулярный комплекс, третий слой которого также был присоединен в результате взаимодействия барназы и барстара. Благодаря адресным антителам полученный комплекс MM4-6apHa3a:(6apcTap-KT):6apHa3a-4D5scFv хорошо связывался с опухолевыми клетками, флуоресценция квантовых точек в составе комплекса позволяла проводить их оптическую детекцию, а ММЧ - манипулировать клетками с помощью магнитного поля [18].
Для визуализации новообразований непосредственно в организме модельных животных на основе разработанной универсальной стратегии молекулярных адаптеров был сконструирован надмолекулярный комплекс, состоящий из квантовых точек с максимумом флуоресценции в ближней ИК-области (КТ705), лежащим в «окне прозрачности» биоткани, и противоопухолевых антител 4D5scFv. С использованием сконструированного надмолекулярного комплекса 4D5scFv-6apHa3a:6apcTap-KT705 совместно с сотрудниками лаборатории оптической тераностики Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского показано, что такое специфическое мечение опухоли позволяет получить более контрастное изображение, а также увеличить интенсивность и длительность сигнала
в 1,5-2 раза по сравнению с использованием биоинертных КТ, не снабженных нацеливающими антителами [5]. Полученные данные подтверждены результатами исследования тканевого распределения квантовых точек путем конфокальной микроскопии postmortem.
Наноразмерные платформы для доставки диагностических и терапевтических соединений к патогенным клеткам и тканям имеют большие перспективы не только в онкологии, но и в других разделах медицины для диагностики и лечения социально значимых заболеваний благодаря уникальным физико-химическим свойствам, способности хорошо проникать в клетки и ткани организма, минуя различные барьеры, и универсальности, позволяющей создавать на их основе мультифункциональ-ные агенты. Становится возможным в одном мультифункциональном комплексе объединить функции детекции патологического очага, селективного воздействия на него терапевтического агента и мониторинга ответа на лечение, реализуя принцип, когда целое больше, чем сумма составляющих частей. Тераностика возникла как междисциплинарная область исследований и для дальнейшего развития требует объединения усилий специалистов из разных областей знания, синтеза достижений фундаментальной науки и клинической медицины.
Список литературы
1. Деев, С. М. Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения / С. М. Деев, Е. Н. Лебеденко // Acta Naturae. - 2009. - Т. 1, № 1. - С. 32-50.
2. Деев, С. М. Неприродные антитела и иммуноконъюгаты с заданными свойствами : оптимизация функций через направленное изменение структуры / С. М. Деев, Е. Н. Лебеденко, Л. Е. Петровская, Д. А. Долгих, А. Г. Габибов, М. П. Кирпичников // Успехи химии. - 2015. - Т. 84, вып. 1. - С. 1-26.
3. Деев, С. М. Супрамолекулярные агенты для тераностики / С. М. Деев, Е. Н. Лебеденко // Биоорганическая химия. - 2015. - Т. 41, № 5. - С. 539-552.
4. Поляновский, О. Л. ERBB-онкогены - мишени моноклональных антител / О. Л. Поляновский, Е. Н. Лебеденко, С. М. Деев // Биохимия. - 2012. - Т. 77, вып. 3. - С. 289-311.
5. Balalaeva, I. V. Passive and active targeting of quantum dots for whole-body fluorescence imaging of breast cancer xenografts /1. V. Balalaeva, T. A. Zdobnova, I. V. Krutova, A. A. Brilkina, E. N. Lebedenko, S. M. Deyev // J. Biophotonics. - 2012. - Vol. 5, № 11-12. - P. 860-867.
6. Barok, M. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance / M. Barok, H. Joensuu, J. Isola // Breast Cancer Res. - 2014. - Vol. 16, № 2. - P. 209.
7. Carter, P. Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy / P. Carter, L. Presta, С. M. Gorman, J. B. Ridgway, D. Henner, W. L. Wong, A. M. Rowland, C. Kotts, M. E. Carver, H. M. Shepard // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89, № 10. - P. 4285-4289.
8. Dawson, S. J. Triple negative breast cancers: clinical and prognostic implications / S. J. Dawson, E. Provenzano, C. Caldas // Eur. J. Cancer. - 2009. - Vol. 45. - P. 27-40.
9. Deyev, S. M. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module / S. M. Deyev, R. Waibel, E. N. Lebedenko, A. P. Schubiger, A. Pluckthun // Nat. Biotechnol. - 2003. - Vol. 21. - P. 1486-1492.
10. Fernandez-Fernandez, A. Theranostic applications of nanomaterials in cancer: Drug delivery, image-guided therapy, and multifunctional platforms // A. Fernandez-Fernandez, R. Manchanda, A. J. McGoron // Appl. Biochem. Biotechnol. -2011. - Vol. 165. -P. 1628-1651.
11. Franklin, M. C. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex / M. C. Franklin, K. D. Carey, F. F. Vajdos, D. J. Leahy, A. M. de Vos, M. X. Sliwkowski // Cancer Cell. - 2004. -Vol. 5.-P. 317-328.
12. Generalova, A. N. Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystalsCdSe/ZnS for bioassays / A. N. Generalova, S. V. Sizova, T. A. Zdobnova, M. M. Zarifullina, M. V. Artemyev, A. V. Baranov, V. A. Oleinikov, V. P. Zubov, S. M. Deyev // Nanomedicine (UK). - 2011. - Vol. 6. -P. 195-209.
13. Gossage, L. Targeting multiple kinase pathways: a change in paradigm / L. Gossage, T. Eisen // Clin. Cancer Res. -2010. - Vol. 16. - P. 1973-1978.
14. Kim, Т. H. Nanotheranostics for personalized medicine / S. Lee, X. Chen // Expert. Rev. Mol. Diagn. — 2013.-Vol. 13.-P. 257-269.
15. Mironova, К. E. Genetically encoded immunophotosensitizer 4D5scFV-miniSOG is a highly selective agent for targeted photokilling of tumor cells in vitro / К. E. Mironova, G. M. Proshkina, A. V. Ryabova, O. A. Stremovskiy, S. A. Lukyanov, R. V. Petrov, S. M. Deyev // Theranostics. - 2013. - Vol. 3, № 11. - P. 831-840.
16. Montemurro, F. Trastuzumab-based combination therapy for breast cancer / F. Montemurro, G. Valabrega, M. Aglietta // Expert Opin. Pharmacother. - 2004. - Vol. 5. - P. 81-96.
17. Nahta, R. Herceptin : mechanisms of action and resistance / R. Nahta, F. J. Esteva // Cancer Lett. - 2006. -Vol. 232, №2.-P. 123-138.
18. Nikitin, M. P. Protein-assisted self-assembly of multifunctional nanoparticles / M. P. Nikitin, T. A. Zdobnova, S. V. Lukash, O. A. Stremovskiy, S. M. Deyev // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2010. - Vol. 107, № 13.-P. 5827-5832.
19. Nikitin, M. P. Biocomputing based on particle disassembly / M. P. Nikitin, V. O. Shipunova, S. M. Deyev, P. I. Nikitin // Nat. Nanotechnol. - 2015. - Vol. 9, № 9. - P. 716-722.
20. Ozer, B. H. Activity and cellular localization of an oncogenic glioblastoma multiforme-associated EGF receptor mutant possessing a duplicated kinase domain // B. H. Ozer, G. J. Wiepz, P. J. Berries // Oncogene. - 2010. -Vol. 29. - P. 855-864.
21. Perou, C. M. Distinctive gene expression patterns in human mammary epithelial cells and breast cancers / C. M. Perou, S. S. Jeffrey, M. van de Rijn, C. A. Rees, M. B. Eisen, D. T. Ross, A. Pergamenschikov, C. F. Williams, S. X. Zhu, J. C. F. Lee, D. Lashkari, D. Shalon, P. O. Brown, D. Botstein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96, № 16.-P. 9212-9217.
22. Serebrovskaya, E. A. Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein / E. A. Serebrovskaya, E. F. Edelweiss, O. A. Stremovskiy, K. A. Lukyanov, D. M. Chudakov, S. M. Deyev // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. - Vol. 106. - P. 9221-9225.
23. Sharma, S. V. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer / S. V. Sharma, D. W. Bell, J. Settleman, D. A. Haber // Nat. Rev. Cancer. - 2007. - Vol. 8. - P. 169-181.
24. Slamon, D. J. Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer / D. J. Slamon, W. Godolphin, L. A. Jones, J. A. Holt, S. G. Wong, D. E. Keith, W. J. Levin, S. G. Stuart, J. Udove, A. Ullrich, M. F. Press // Science. - 1989. - Vol. 244. - P. 707-712.
25. Stephens, P. Lung cancer: intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours // P. Stephens, C. Hunter, G. Bignell, S. Edkins, H. Davies, J. Teague, C. Stevens, S. O'Meara, R. Smith, A. Parker, A. Barthorpe, M. Blow, L. Brackenbury, A. Butler, O. Clarke, J. Cole, E. Dicks, A. Dike, A. Drozd, K. Edwards, S. Forbes, R. Foster, K. Gray, C. Greenman, K. Halliday, K. Hills, V Kosmidou, R. Lugg, A. Menzies, J. Perry, R. Petty, K. Raine, L. Ratford, R. Shepherd, A. Small, Y. Stephens, C. Tofts, J. Varian, S. West, S. Widaa, A. Yates, F. Brasseur, C. S. Cooper, M. A. Flanagan, M. Knowles, S. Y. Leung, D. N. Louis, L. H. Looijenga, B. Malkowicz, M. A. Pierotti, B. Teh, G. Chenevix Trench, B. L. Weber, S. T. Yuen, G Harris, P. Goldstraw, A. G Nicholson, P. A. Futreal, R. Wooster, M. R. Stratton // Nature. - 2004. - Vol. 431. - P. 525-526.
26. Sumer, B. Theranostic nanomedicine for cancer / B. Sumer, J. Gao // Nanomedicine. (Lond). - 2008. -Vol. 3.-P. 137-140.
27. Wang, S. E. Oncogenic mutations regulate tumor microenvironment through induction of growth factors and angiogenic mediators / S. E. Wang, Y. Yu, T. L. Criswell, L. M. Debusk, P. C. Lin, R. Zent, D. H. Johnson, X. Ren, C. L. Arteaga // Oncogene. - 2010. - Vol. 29, № 23. - P. 3335-3348.
28. Wilken, J. A. Primary trastuzumab resistance: new tricks for an old drug / J. A. Wilken, N. J. Maihle // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2010. - Vol. 1210. - P. 53-65.
29. Yun, C. H. The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinity for ATP / C. H. Yun, K. E. Mengwasser, A. V. Toms, M. S. Woo, H. Greulich, K. K. Wong, M. Meyerson, M. J. Eck // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 12. - P. 2070-2075.
30. Zeineldin, R. Targeting the EGF receptor for ovarian cancer therapy / R. Zeineldin, C. Y. Muller, M. S. Stack, L. G Hudson // J. Oncol. - 2010. - Vol. 2010, Article ID 414676, 11 pages doi: 10.1155/2010/414676.
31. Zhang, Z. EGFR-mutated lung cancer: a paradigm of molecular oncology / Z. Zhang, A. L. Stiegler, T. J. Boggon, S. Kobayashi, B. Halmos // Oncotarget. - 2010. - Vol. 1. - P. 497-514.
References
1. Deev S. M., Lebedenko E. N. Sovremennye tekhnologii sozdaniya neprirodnykh antitel dlya klinicheskogo primeneniya [Modern technologies for creating synthetic antibodies for clinical application]. Acta naturae [Acta naturae], 2009, vol. 1, no. 1, pp. 32-50.
2. Deev S. M., Lebedenko E. N., Petrovskaya L. E., Dolgikh D. A., Gabibov A. G., Kirpichnikov M. P. Nepri-rodnye antitela i immunokon"yugaty s zadannymi svoystvami : optimizatsiya funktsiy cherez napravlennoe izmenenie struktury [Man-made antibodies and immunoconjugates with desired properties: function optimization using structural engineering], Uspekhi khimii [Russ. Chem. Rev.], 2015, vol. 84, no. 1, pp. 1-26.
3. Deev S. M., Lebedenko E. N. Supramolekulyarnye agenty dlya teranostiki [Supramolecular agents for ther-anostics], Bioorgan. Khimiya [Russ. J. Bioorg. Chem.], 2015, vol. 41, no. 5, pp. 539-552.
4. Polanovski O. L., Lebedenko E. N., Deyev S. M. ERBB-onkogeny - misheni monoklonal'nykh antitel [ERBB oncogene proteins as targets for monoclonal antibodies], Biokhimiya [Biochemistry (Moscow.)], 2012, vol. 77, no. 3, pp. 227-245. doi: 10.1135/S0006297912030029.
5. Balalaeva I. V, Zdobnova T. A., Krutova I. V, Brilkina A. A., Lebedenko E. N., Deyev S. M. Passive and active targeting of quantum dots for whole-body fluorescence imaging of breast cancer xenografts, J. Biophotonics, 2012, vol. 5, no. 11-12, pp. 860-867. doi: 10.1002/jbio.201200080.
6. Barok M., Joensuu H., Isola J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance, Breast Cancer Res., 2014, vol. 16, no. 2, pp. 209. doi: 10.1186/bcr3621.
7. Carter P., Presta L., Gorman C. M., Ridgway J. B., Henner D., Wong W. L., Rowland A. M., Kotts C., Carver M. E., Shepard H. M. Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, no. 10, pp. 4285-1289.
8. Dawson S. J., Provenzano E., Caldas C. Triple negative breast cancers: clinical and prognostic implications, Eur. J. Cancer, 2009, vol. 45, supplement 1, pp. 27-40. doi: 10.1016/S0959-8049(09)70013-9.
9. Deyev S. M., Waibel R., Lebedenko E. N., Schubiger A. P., Pliickthun A. Design of multivalent complexes using the barnase barstar module, Nat. Biotechnol., 2003, vol. 21, no. 12, pp. 1486-1492.
10. Fernandez-Fernandez A., Manchanda R., McGoron A. J. Theranostic applications of nanomaterials in cancer: drug delivery, image-guided therapy, and multifunctional platforms, Appl. Biochem. Biotechnol., 2011, vol. 165, no. 7-8, pp. 1628-1651. doi: 10.1007/sl2010-011-9383-z.
11. Franklin M. C., Carey K. D., Vajdos F. F., Leahy D. J., de Vos A. M., Sliwkowski M. X. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex, Cancer Cell, 2004, vol. 5, no. 4, pp. 317-328.
12. Generalova A. N, Sizova S. V., Zdobnova T. A., Zarifullina M. M., Artemyev M. V., Baranov A. V., Oleinikov V. A., Zubov V. P., Deyev S. M. Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays, Nanomedicine (UK), 2011, vol. 6, no. 2, pp. 195-209. doi: 10.2217/nnm.l0.162.
13. Gossage L., Eisen T. Targeting multiple kinase pathways: a change in paradigm, Clin. Cancer Res., 2010, vol. 16, no. 7, pp. 1973-1978. doi: 10.1158/1078-0532.CCR-09-3182.
14. Kim T. H., Lee S., Chen X. Nanotheranostics for personalized medicine, Expert. Rev. Mol. Diagn., 2013, vol. 13, no.3, pp. 257-269. doi: 10.1586/erm.l3.15.
15. Mironova K. E., Proshkina G. M., Ryabova A. V., Stremovskiy O. A., Lukyanov S. A., Petrov R. V., Deyev S. M. Genetically encoded immunophotosensitizer 4D5scFV-miniSOG is a highly selective agent for targeted photokilling of tumor cells in vitro, Theranostics, 2013, vol. 3, no. 11, pp. 831-840. doi: 10.7150/thno.6715.
16. Montemurro F., Valabrega G., Aglietta M. Trastuzumab-based combination therapy for breast cancer, Expert Opin. Pharmacother., 2004, vol. 5, no. 1, pp. 81-96.
17. Nahta R., Esteva F. J. Herceptin: mechanisms of action and resistance, Cancer Lett., 2006, vol. 232, no. 2, pp. 123-138.
18. Nikitin M. P., Zdobnova T. A., Lukash S. V., Stremovskiy O. A., Deyev S. M. Protein-assisted self-assembly of multifunctional nanoparticles, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2010, vol.107, no. 13, pp. 5827-5832. doi: 10.1073/pnas. 1001152107.
19. Nikitin M. P., Shipunova V. O., Deyev S. M., Nikitin P. I. Biocomputing based on particle disassembly, Nat. Nanotechnol., 2014, vol. 9, no. 9, pp. 716-722. doi: 10.1038/nnano.2015.156.
20. Ozer B. H., Wiepz G. J., Bertics P. J. Activity and cellular localization of an oncogenic glioblastoma multi-forme-associated EGF receptor mutant possessing a duplicated kinase domain, Oncogene, 2010, vol. 29, no. 6, pp. 855-864. doi: 10.1038/onc.2009.385.
21. Perou C. M., Jeffrey S. S., van de Rijn M., Rees C. A., Eisen M. B., Ross D. T., Pergamenschikov A., Williams C. F., Zhu S. X., Lee J. C. F., Lashkari D., Shalon D., Brown P. O., Botstein D. Distinctive gene expression patterns in human mammary epithelial cells and breast cancers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol. 96, no. 16, pp. 9212-9217.
22. Serebrovskaya E. A., Edelweiss E. F., Stremovskiy O. A., Lukyanov K. A., Chudakov D. M., Deyev S. M. Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2009, vol. 106, no. 23, pp. 9221-9225. doi: 10.1073/pnas.0905150106.
23. Sharma S. V, Bell D. W., Settleman J., Haber D. A. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer, Nat. Rev. Cancer, 2007, vol. 7, no. 3, pp. 169-181.
24. Slamon D. J., Godolphin W., Jones L. A., Holt J. A., Wong S. G., Keith D. E., Levin W. J., Stuart S. G., Udove J., Ullrich A., Press M. F. Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer, Science, 1989, vol. 244, pp. 707-712.
25. Stephens P., Hunter C., Bignell G., Edkins S., Davies H., Teague J., Stevens C., O'Meara S., Smith R., Parker A., Barthorpe A., Blow M., Brackenbury L., Butler A., Clarke O., Cole J., Dicks E., Dike A., Drozd A., Edwards K., Forbes S., Foster R., Gray K., Greenman C., Halliday K., Hills K., Kosmidou V., Lugg R., Menzies A., Perry J., Petty R., Raine K., Ratford L., Shepherd R., Small A., Stephens Y., Tofts C., Varian J., West S., Widaa S., Yates A., Brasseur F., Cooper C. S., Flanagan M. A., Knowles M., Leung S. Y., Louis D. N, Looijenga L. H., Malkowicz B., Pierotti M. A., The B., Chenevix-Trench G., Weber B. L., Yuen S. T., Harris G., Goldstraw P., Nicholson A. G, Futreal P. A., Wooster R., Stratton M. R. Lung cancer: intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours, Nature, 2004, vol. 431, pp. 525-526.
26. Sumer B., Gao J. Theranostic nanomedicine for cancer, Nanomedicine (Lond), 2008, vol. 3, no. 2, pp. 137-140. doi: 10.2217/17435889.3.2.137.
27. Wang S. E., Yu Y., Criswell T. L., Debusk L. M., Lin P. C., Zent R., Johnson D. H., Ren X., Arteaga C. L. Oncogenic mutations regulate tumor microenvironment through induction of growth factors and angiogenic mediators. Oncogene, 2010, vol. 29, no. 23, pp. 3335-3348. doi: 10.1038/onc.2010.112.
28. Wilken J. A., Maihle N. J. Primary trastuzumab resistance: new tricks for an old drug, Ann. N.Y. Acad. Sci.,
2010, vol. 1210, pp. 53-65. doi: 10.1111/j.l749-6632.2010.05782.x.
29. Yun C. H., Mengwasser K. E., Toms A. V., Woo M. S., Greulich H., Wong K. K., Meyerson M., Eck M. J. The T790M mutation in EGFR kinase causes drag resistance by increasing the affinity for ATP, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, vol. 105, no. 6, pp. 2070-2075. doi: 10.1073/pnas.0709662105.
30. Zeineldin R., Muller C. Y., Stack M. S., Hudson L. G Targeting the EGF receptor for ovarian cancer therapy, J. Oncol., 2010, vol. 2010, Article ID 414676, 11 pages doi: 10.1155/2010/414676.
31. Zhang Z., Stiegler A. L., Boggon T. J., Kobayashi S., Halmos B. EGFR-mutated lung cancer: a paradigm of molecular oncology, Oncotarget, 2010, vol. 1, no. 7, pp. 497-514.
