CC BY
76
Новые направления в реконструкции межпозвонковых дисков - клеточная трансплантация и тканевой инженерия
Деев Р.В.
Дегенеративно-дистрофические заболевания позвоночника сопряженные с поражением связочно-суставного аппарата остаются не только весьма актуальной медицинской, но и социальной проблемой. При применении синдромаль-ного подхода установлено, что 60-80% людей в течении жизни испытывают стойкую боль в спине; большинство из них имеет патологию позвоночника, ассоциированную с поражением межпозвонковых дисков. Связанные с этим государственные издержки только в США, несколько лет назад, составляли около 100 миллиардов долларов в год [4, 6].
Межпозвонковый диск является хрящевым соединением позвонков, с возрастом приобретающий признаки симфиза [рис. 1).
присутствуют цитокератины [8 и 19 типов) [16]. Однако, также для них характерны поверхностные рецепторы к проте-огликанам (С044), виментин, синтез коллагена II типа [как для гиалинового хряща) [13, 15-17], что роднит хорду со скелетными тканями, имеющими мезенхимальное происхождение.
Рис. 1. Схема строения позвоночного сегмента
Рис. 2. Строение межпозвонкового диска:
1— (А - субхондральная костная ткань позвонка; В - гиалиновая хрящевая пластника; С - волокнистая хрящевая ткань, образующая фиброзное кольцо; й - область студенистого ядра); 2 - ход коллагеновых волокон в периферической части фиброзного кольца; 3 - мощные пучки коллагеновых волокон в области студенистого ядра у взрослых особей. Окраска: гематоксилин и эозин Увеличение: 1,2Х100, 3*250
Собственно диск расположен между тонкими прослойками гиалиновой хрящевой ткани, плотно прилегающими к костным замыкательным пластинкам смежных позвонков [рис. 2, 1 -В). Диск образован студенистым ядром, окруженным и плотно фиксированным фиброзным кольцом, построенным из фиброзной хрящевой ткани [рис. 2, 2).
Особенностью фиброзного хряща является преобладание коллагена I типа в отличие от остальных типов хрящевой ткани, для которых характерен коллаген-II, собранного в мощные циркулярно расположенные пучки, между которыми находятся тела хондроцитов [рис. 3).
Основную функцию диска - амортизацию, осуществляет студенистое ядро. Взгляды на то, какой тканью оно образовано различны, что во многом связано с его эмбриогенезом и изменениями в ходе постнатального развития. Общепризнано, что ткань студенистого ядра является рудиментом хорды. В ходе эмбриогенеза скелетогенная мезенхима концентрируется вокруг сегментирующейся хорды. Из клеток мезенхимы дифференцируются хондроциты фиброзного кольца, которые окружают материал хорды и разделяют его на фрагменты. Сохранившиеся участки хорды и образуют материал студенистого ядра [2, 3]. Обособление материала хорды в эмбриогенезе происходит очень рано, поэтому какой материал является зачатком хорды, не вполне ясно. Экспериментами in vitro показано, что клетки хорды проявляют некоторые свойства эпителиальных тканей [5], в частности, в них
Рис. 3. Волокнистая хрящевая ткань межпозвонкового диска. Между пучками коллагеновых волокон (окрашены эозином) лежат тела хондроцитов. Гпикозоаминогликаны окрашены в голубой цвет. А - студенистое ядро. Окраска: альциановый синий и эозин. Увеличение: * 400
Недавно группа исследователей из Гейдельбергского университета [Германия) поставила цель сравнить клетки студенистого ядра и стромальные [мезенхимальные) клетки костного мозга (ССК/МСК) в монослойных культурах и трехмерных сфероидах для определения перспектив дальнейшего использования в тканевой инженерии дисков [14]. ССК культивировали в стандартной хондрогенной среде (TGF-beta, дексаметазон, аскорбат). Изучали экспрессию генов хондрогенной дифференцировки, включая гены аггрекана, декорина, фибромодулина и олигомерного матриксного протеина хряща. Установлено, что в трехмерных сфероидах экспрессия была существенно выше, чем в монослойных культурах. Кроме того, при культивировании материала студенистого ядра и типичных меха-ноцитов показаны различия в синтетической активности -клетки кольца синтезируют больше коллагена I, клетки ядра больше аггреканов. Ученые сделали вывод, что если студенистое ядро и фиброзное кольцо гистогенетически однородны, то обладают различной степенью экспрессии одних и тех же генов [14].
Благодаря повышенному содержанию воды студенистое ядро плохо сжимаемо, что обеспечивает гидравлическую амортизацию при прямохождении. Клеточный состав и физико-химические свойства межклеточного вещества у детей и взрослых существенно отличается. Вследствие трофического дефицита в клетках студенистого ядра постепенно происходят дегенеративно-дистрофические процессы и к 10 годам все клетки погибают, причем частью апоптозом [7]. Существует два предположения относительно функций клеток студенистого ядра. Согласно первому, клетки сами синтезируют компоненты межклеточного матрикса - коллаген II типа, аггрекан и другие гликозоаминогликаны. Согласно второму, они регулируют синтетическую деятельность окружающих ядро клеток [8]. В пользу последнего суждения свидетельствует тот факт, что после возрастной утраты клеток происходит постепенная дегидратация и фиброз ядер. В области бывшего студенистого ядра может формироваться полость объемом до 1,5 куб.см., что придает дискам сходство с симфизами [рис. 2, 3). Вследствие уменьшения высоты диска, нагрузка распространяется на фиброзное кольцо, что приводит к его разволокнению. При резком повышении давления в этом сигменте элементы пульпозного ядра выпячиваются либо в позвоночный канал [рис. 4), либо проламывают костную стенку позвонка и пролабируют внутрь [грыжа Шморля).
В первом случае большинству пациентов показано хирургическое лечение - дискэктомия. Хирургическим путем создается анкилоз двух позвонков [спондилодез) - костный блок. В этом сегменте позвоночник теряет подвижность, однако существенно на опорной функции позвоночника это не сказывается. Разработан консервативный метод лечения такой патологии - при помощи химопапаина, однако он малоэффективен [4]. Активно ведутся поиски биотехнологических подходов к решению этой проблемы.
Наиболее простым представляется выделение культуры клеток студенистого ядра, размножение их in vitro и последующее введение в поврежденный диск. В эксперименте показано, что при этом процесс дегенерации диска затормаживается, пересаженные клетки синтезируют элементы
Рис. 4. Схема формирования грыжи межпозвонкового диска
хрящевого матрикса [11, 12], что нельзя признать полноценным гистотипическим исходом регенерации в этом случае. Кроме того, проблемным является получение культуры клеток студенистого ядра, ведь у взрослых nucleus pulposus лишен клеток, следовательно, возникает вопрос об использовании аллогенных трупных фетальных клеток. Решением этой проблемы может стать использование клеток животных, тем более, что ткани межпозвонкового диска являются гиповас-кулярными [8].
Украинские коллеги исследовали эффективность клеточной трансплантации на модели травматического повреждения диска у крыс [1 ]. В качестве клеточного материала использовали скелетогенную мезенхиму из зачатков конечностей эмбрионов крыс на 12-13 сутки. После короткого этапа культивирования клетки вносили в дефект из расчета 10 млн/мл в дефект. При помощи гистохимического и электронномикроскопического анализа установлено, что пересаженные клетки дифференцировались преимущественно в пре- и хондробла-сты. Через 90 суток зона дефекта была заполнена хрящевым регенератом. В целом диск после трансплантации характеризовался неизмененной высотой [1].
Поскольку в условиях in vitro и после трансплантаций in vivo воссоздать ткань студенистого ядра не удается, ряд авторов предлагают замещать утраченное ядро различными субстанциями с интегрированными в них хондроцитами. В качестве таких носителей предложены альгинаты, препараты полигли-колевой кислоты, производные хитозана [9, 10].
Следует отметить, что технология клеточной реконструкции межпозвонкового диска только начинает разрабатываться. Принципиальным является гистогенетическая гетерогенность ткани студенистого ядра и фиброзного кольца межпозвонкового диска. Ключевыми проблемами являются выявление тканевой принадлежности клеток студенистого ядра. Очевидно, что если они являются производными хорды, имеющей особое эмбриональное происхождение, то трансплантация механоцитов не в состоянии привести к формированию полноценного по химическому составу матрикса студенистого ядра, способного к выполнению функции амортизации. Напротив, дифференциров-ка соединительнотканных предшественников в условиях сниженной трофики приведет к дополнительному склерозу диска, что и без трансплантаций наблюдают нейрохирурги-вертебро-логи при дискэктомиях. Приемлемые клинико-биологические подходы к решению этих сложностей еще предстоит найти.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Дедух В.Н., Малышкина С.В., Бадраинова И.В. Регенерация межпозвонкового диска при трансплантации культивируемых клеток хрящевого дифферона. В кн.: Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей. СПб., 2004: 102-3.
2. Мовшович И.А., Илларионов В.П., Маттис Э.Р. и др. Позвоночник. БМЭ, изд-е 3-е. М.: Сов. Энциклопедия, 1983: 107-24.
3. Ромер А., Парсонс Т. Анатомия позвоночных. Т. 1. М.: Мир, 1992. - 358 с.
4. Хинтон Р. Боль в спине. В кн.: Неврология / Под. ред. М. Самуэльса. М.: Практика, 1997: 121-33.
5. Хлопин H.Г. Общебиологические и экспериментальные основы гистологии. Л., изд-во АН СССР, 1946. - 492 с.
6. Frymoyer J.W. Magnitude of the problem. In: Wiesel S.W., Weinstein J.N., Herkowitz H.N. et al. The Lumbar Spine. Philadelphia, PA: W.B. Saunders, 1996: 8-15.
7. Horwitz T. The human notochord: A study of its development and regression, variations, and pathologic derivative, chordoma. Indianapolis, 1977.
8. Hunter C.J., Matyas J.R., Duncan N.A. The Notochordal cell in the nucleus pulposus: A review in the context of tissue engineering. Tissue. Eng. 2003; 9; 4: 667-77.
9. Mizuno M., Roy A.K., Vacanti J. et al. Tissue engineering of a composite intervertebral disc. Abstract presented at the 47th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, San Francisco, 2001. Abstract no. 78.
10. Mwale F., lordanova M., Demers C.N. et al. Biological evaluation of chitosan salts cross-linked to genipin as a cell scaffold for disk tissue engineering. Tissue. Eng. 2005; 11; 1/2: 130-40.
11. Nomura T., Mochida J., Okuma M. et al. Nucleus pulposus allograft retards intervertebral disc degeneration. Clin. Orthop. 2001; 389: 94-101.
12. Okuma M., Mochida J., Nishimura K. et al. Reinsertion of stimulated nucleus pulposus cells retards intervertebral disc degeneration: An in vitro and in vivo experimental study. J. Orthop. Res. 2000; 18; 6: 988-97.
13. Sandell L.J. In situ expression of collagen and proteoglycan genes in notochord and during skeletal development and growth. Microsc. Res. Tech. 1994; 28; 6: 470-82.
14. Steck E., Bertram H., Abel R. et al. Induction of intervertebral disc-like cells from adult mesenchymal stem cells. Stem Cells 2005; 23: 403-11.
15. Stevens J.W., Kurriger G.L., Carter A.S., Maynard J.A. CD44 expression in the developing and growing rat intervertebral disc. Dev. Dyn. 2000; 219; 3: 381-90.
16. Stosiek P., Kasper M., Karsten U. Expression of cytokeratin and vimentin in nucleus pulposus cells. Differentiation 1988; 39; 1: 78-81.
17.Takaishi H., Yamada H., Yabe Y. Preferential expression of alternatively spliced transcript of type II procollagen in the rabbit notochordal remnant and developing fibrocartilages. Biochim. Biophys. Acta 1997; 1350; 3: 253-8.
компания
Biosafe S.A. [ш
••••••••••••
вейцария)
Оборудование для сепарации пуповинной крови, лейкаферезной фракции периферической крови и костного мозга для получения стволовых клеток с последующим их применением в клеточной терапии и трансфузионной медицине.
Компактная, портативная и многопараметрическая система Эерах является идеальной платформой для обработки компонентов крови с высоким выходом и хорошим уровнем жизнеспособности клеток после процедуры.
Система Берах включает в себя:
• аппарат Эерах 0
• расходные материалы: центрифужную камеру, многоканальный стопорный кран и мешки для сбора
• компьютерные программы
Расходные материалы представляют собой закрытую стерильную одноразовую систему, представлены в различной конфигурации в зависимости от используемого протокола.
КОМПОНЕНТЫ!
Порт к мешку с кровью
і
I ^
комплект расходных материалов
Многоканальные стопорные краны
i ¡ і
и
Мешки для сбора
Криогенный мешок
Сепарационная камера
Эксклюзивный представитель ООО "ИМТ"
Москва, ул. И. Франко, д.4 тел (095) 380-3662 тел/факс (095) 146-0255
