CC BY
43
УДК 577.213.3
НОВІ МЕТОДИКИ АНАЛІЗУ МУТАЦІЙ У ДЕЯКИХ ЕКЗОНАХ ГЕНІВ РАН ТА CFTR ЛЮДИНИ З ВИКОРИСТАННЯМ ДЕНАТУРУЮЧОГО ГРАДІЄНТНОГО ГЕЛЬ-ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ
О. О. Соловйов
Д. О. Голомідов Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ
Л. А. Лівшиць
E-mail: livshits@imbg.org.ua
Розроблено діагностичні методики для детекції мутантних варіантів деяких екзонів генів РАН (фенілкето-нурія) та CFTR (муковісцидоз) методом денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу (DGGE). Показано високу ефективність методу для використання у програмах скринінгу цих тяжких спадкових захворювань серед населення України.
Ключові слова: DGGE, ген, мутації, ДНК-діагностика, фенілкетонурія, муковісцидоз.
С. Фішером і Л. Лерманом [4,5]. Він ґрунтується на розділенні дволанцюгових фрагментів ДНК за допомогою електрофорезу в стандартному акриламідному гелі з лінійним градієнтом денатуруючих факторів -сечовини, формаміду або температури. Під час електрофорезу дволанцюгових ДНК у гелі з лінійно зростаючим градієнтом концентрацій денатуруючих агентів плавлення ланцюгів ДНК відбувається у строго специфічній для даної послідовності ділянці, при еквівалентній температурі плавлення. У результаті відбувається поділ фрагментів ДНК, що розрізняються за нуклеотидним складом.
Метою роботи було розробити діагностичні методики детекції мутантних варіантів 7-го та 12-го экзонів гена РАН та 20-го екзона гена CFTR методом DGGE.
Матеріали і методи
Матеріалом для досліджень слугували зразки периферичної крові хворих із різних регіонів України. Виділення та очищення ДНК зі зразків проводили шляхом гідролізу лізатів клітин протеїназою К з наступною фенольною екстракцією [6]. Для проведення ампліфікації in vitro послідовностей 7-го і 12-го екзонів гена РАН та 20-го екзона гена CFTR нами було розроблено дизайн олігонуклеотид-них праймерів. Аналіз послідовності праймерів на специфічність виконували з використанням комп’ютерної бази даних BLAST SEARCH
Генетичне тестування муковісцидозу (МВ, CFTR) і фенілкетонурії (ФКУ, РАН) є актуальною проблемою медичної генетики. В Україні на 8 300 новонароджених одна дитина хвора на ФКУ. Частота носіїв мутантного гена РАН серед населення України становить 1:43 [1]. На 2006 рік кількість ідентифікованих мутацій гена РАН досягла 513. В Україні й у багатьох країнах Європи аналіз мажорної мутації R408W [2], локалізованої в 12-му екзоні, є вкрай важливим для молекулярно-генетичної діагностики. Також дуже актуальним є аналіз мутацій 7-го екзона гена РАН, оскільки в ньому ідентифіковано близько 90 мутацій.
Частота захворювання на муковісцидоз у різних популяціях суттєво варіює і становить у середньому 1:2-2,5 тис. новонароджених серед представників білої раси та 1:9-10 тис. новонароджених серед представників африканської раси ^ооёсЫЫ, Dodge,1987). Виходячи із цих показників гетерозиготними носіями патологічного гена є близько 5% населення світу. В Україні частота МВ становила 1:2200 [3].
З огляду на це збільшується потреба в розробленні ефективних методик для масового та селективного скринінгу хворих і гетерозиготних носіїв мутантних алелів, що спричинюють дані захворювання.
Денатуруючий градієнтний гель-електро-форез (DGGE) вважається одним із найефективніших сучасних методів для детекції мутацій. Метод DGGE був розроблений
за умов сканування геномної послідовності ДНК генів РАН і CFTR. Для оптимізації роздільної здатності методу DGGE до 5'- або 3'-кінця одного з пари праймерів приєднували GC-багатий фрагмент (GC-clamp). Позицію для приєднання GC-фрагмента визначали за допомогою комп’ютерного алгоритму Melt В7 [7, В]. Аналіз термодинамічних параметрів праймерів здійснювали за програмою Vector NTI Suite б.
Праймери були синтезовані твердофазним фосфоамідитним методом на олігосинтеза-торі Biosset (Росія).
Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в автоматичному режимі на тер-моциклері Perkin Elmer (Cetus) за таких умов:
- 20-й екзон гена CFTR: ініціювальна денатурація — при 94 0С протягом 5 хв; 39 циклів: денатурація — 1хв, 94 0С, відпалювання праймерів — 1хв, 55 0С, елонгація — 1хв, 72 0С; фінальна елонгація при 72 0С протягом 3 хв; формування гетеродуплексів: денатурація при 94 0С упродовж 5 хв з наступним відпалюванням при температурі 55 0С та швидке охолодження;
- 7-й екзон гена РАН: pre PCR : денатурація при 94 0С — 4 хв, відпалювання праймерів — 59 0С, 2 хв, елонгація — 72 0С, 2 хв; 5 циклів: денатурація ДНК — 45 с, 94 0С, відпалювання праймерів — 45 с, 58 0С, елонгація — 45 с, 72 0С; 5 циклів: денатурація ДНК — 45 с, 94 0С, відпалювання праймерів — 45 с, 5б 0С, елонгація — 45 с, 72 0С; 25 циклів: денатурація ДНК — 45 с, 94 0С, відпалювання праймерів — 45 с, 55 0С, елонгація — 45 с, 72 0С; фінальна елонгація: 72 0С — 3 хв;
- 12-й екзон гена РАН: ініціювальна денатурація — 3 хв, 94 0С; 5 циклів: денатурація ДНК — 45 с, 94 0С, відпалювання праймерів — 45 с, 53 0С, елонгація — 45 с, 72 0С; 28 циклів: денатурація ДНК — 30 с, 94 0С, відпалювання праймерів — 30 с, 51 0С, елонгація — 45 с, 72 0С; фінальна елонгація: 72 0С — 2 хв.
Робоча суміш об’ємом 25 мкл містила: Тга-НСІ — б7 мМ (рН 8,8, 25 0С); (NH4)2SO4 — 1б,7 мМ; ЕДТА — б,7 мкМ; MgCl2 — 2,5-4 мМ; бичачий сироватковий альбумін — 170 мкг/мл; dNTP — 400 мкМ кожного типу; прайме-ри — 4,5 pмол/мл; ДНК — 1 мкг; Taq-полі-мераза — 0,5 од. активності на пробу.
Денатуруючий градієнтний гель-електро-форез (DGGE) проводили з використанням методик [9,10] за такими параметрами:
- 20-й екзон гена CFTR: 7%-й поліакри-ламідний гель, градієнт денатурантів 10-б0%
сечовини з формамідом, температура 55 0С, постійна напруга 240В, тривалість — 5 год;
- 7-й та 12-й екзони гена РАН: 7%-й полі-акриламідний гель, градієнт денатурантів 25-55% сечовини з формамідом, температура б0 0С, постійна напруга 180В, тривалість — 3 год.
Забарвлення гелів після DGGE здійснювали водним розчином броміду етидію та барвником Barva NA, синтезованим у відділі комбінаторної хімії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Для проведення рестрикційного аналізу продуктів ПЛР у зразки додавали 1 од.ак-тивності відповідної ендонуклеази рестрикції, 1 мкл специфічного для рестриктази стандартного буфера та інкубували при температурі 55 0С упродовж 2 год або при температурі 37 0С 12 год. Продукти гідролізу ампліфікованих послідовностей аналізували за допомогою електрофорезу в 10% -му поліакриламідному гелі (співвідношення акриламід:бісакриламід — 29:1). Як маркери молекулярної маси використовували 100 Base-Pair Ladder.
Візуалізацію гелів після фарбування проводили, застосовуючи УФ-трансілюмі-натор (X = 290 нм) та прилад Dark Reader, Clare Chemical Research, США (X = 470 нм).
Результати та обговорення
Під час проведення DGGE 12-го та 7-го екзонів гена РАН і 20-го екзона гена CFTR зразками слугували ДНК носіїв мутацій R408W, Y414C (12-й екзон гена РАН), P281L, R252W, R261Q (7-й екзон гена РАН), W1282X (20-й екзон гена CFTR) із колекції відділу геноміки людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Результати експерименту наведено на рис. 1. У разі присутності мутації R408W та Y414C у гетерозиготному стані DGGE-про-філь представлений двома гомодуплексами та двома гетеродуплексами, присутність яких збільшує інформативність розділення (рис. 1, А). На рис. 1, Б зображено DGGE-профіль мутацій P281L, R252W, R261Q у гетерозиготному стані. DGGE-профіль мутації W1282X у гетерозиготному стані подано на рис. 1, В.
З використанням розроблених методів аналізу мутацій 7-го і 12-го екзонів гена РАН та 20-го екзона гена CFTR нами було проведено пілотний скринінг цих послідовностей у групі дітей, хворих на фенілкетонурію і муковісцидоз, та їхніх батьків, кров яких надходила з усіх регіонів України. Методом
A
Б
В
Рис. 1. БООБ-електрофореграми послідовностей 12-го екзона гена РАН, 7-го екзона гена РАН та 20-го екзона
гена CFTR:
А — DGGE-еклектрофореграма мутацій 12-го екзона гена РАН (7%-й поліакриламідний гель, градієнт денату-рантів 25-60%): 1 — R408W/норма; 2 — норма/норма; 3 — Y414C / норма;
Б — DGGE-електрофореграма мутацій 7-го екзона гена РАН (7%-й поліакриламідний гель, градієнт денату-рантів 25-60%): 1 — норма/норма; 2—Р28И/ норма; 3 — R252W/норма; 4 — R261Q/ норма; 5 — норма/норма; В — DGGE-електрофореграма послідовностей 20-го екзона гена CFTR (7%-й поліакриламідний гель, градієнт денатурантів 10-60%, температура 55оС, напруга 230 В, тривалість 5 год): 1,2,4 — норма/норма, 3 — W1282X/норма
пацієнтів та контрольних зразків ДНК з мутаціями (електрофореграму наведено на рис. 3); виявлено 5 гетерозиготних носіїв мутації р28И, 3 носії R252W та 2 носії R261Q. Ці результати підтверджено за допомогою рестрикційного аналізу продуктів ПЛР ендонуклеазами рестрикції Мері, Eco88I, НіпД, відповідно [1, 2]. Було також виявлено 3 мутантні варіанти 7-го екзона гена РАН (рис. 3), які не вдалося ідентифікувати за допомогою рестрикційного аналізу. Планується проведення прямого секвену-вання послідовностей 7-го екзона з метою визначення знайденої мутації.
DGGE було досліджено 35 пацієнтів на фе-нілкетонурію та 25 пацієнтів — на муковіс-цидоз.
Під час аналізу електрофореграм 12-го екзона гена ФАГ виявлено 12 гетерозиготних носіїв мутації R408W та один носій цієї мутації у гомозиготному стані, 2 гетерозиготних носії мутації Y414C (рис. 2, А, Б). Ці результати підтверджено за допомогою рест-рикційного аналізу продуктів ПЛР із застосуванням ендонуклез рестрикції MnlI, RsaI, відповідно [1,2].
У результаті аналізу 7-го екзона гена РАН методом денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу було одержано DGGE-профілі
2
3
5
1
4
2
4
1
1
3
2
3
12 3 4 567 89 10 11 1 2 3 4 5 б
Рис. 2. БООБ-електрофореграма послідовностей 12-го екзона гена РАН хворих на фенілкетонурію
та членів їхніх родин:
А — Сім’я I: 1 — мати — носій мутації R408W у гетерозиготному стані; 2 — пробанд — носій мутації R408W у гетерозиготному стані; 3 — негативний контроль ампліфікації; 4 — здоровий індивід; 5 — маркер мутації R408W у гетерозиготному стані. Сім’я II: 5 — пробанд — носій мутації R408W у гомозиготному стані; 6, 7 — мати та батько — носії мутації R408W у гетерозиготному стані; 8, 9,10 — здорові індивіди;
Б — 1 — негативний контроль; 2 — носій мутації R408W у гетерозиготному стані; 3 — здоровий індивід; 4 — носій мутації Y414C у гетерозиготному стані; 5 — позитивний контроль на мутацію Y414C; 6 — позитивний контроль на мутацію R408W
Дослідивши 25 хворих на муковісцидоз пацієнтів методом DGGE, ми виявили трьох гетерозиготних носіїв мутації W1282Х (рис. 4). Одержані результати підтверджено за допомогою рестрикційного аналізу продуктів ПЛР ендонуклеазами рестрикції Мпіі [11].
Таким чином, нами було розроблено діагностичні методики детекції мутацій 7-го
і 12-го екзона гена PAH та 20-го екзона гена CFTR за допомогою методу денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу (DGGE).
Ці робочі методики можуть бути використані в тест-системах для ДНК-аналізу у програмах селективного та масового скри-нінгу з метою профілактики муковісцидозу та фенілкетонурії в Україні.
Рис. 3. БООБ-електрофореграма послідовностей 7-го екзона гена РАН хворих на фенілкетонурію
та членів їхніх родин:
1 — позитивний контроль на мутацію Р28И; 6 — носій мутації Р28И у гетерозиготному стані;
2 — неідентифікований мутантний варіант; 7 — здоровий індивід;
3 — носій мутації Р28И у гетерозиготному стані; 8 — неідентифікований мутантний варіант;
4 — неідентифікований мутантний варіант; 9 — позитивний контроль на мутацію R252W;
5 — носій мутації Р28И у гетерозиготному стані; 10 — позитивний контроль на мутацію R261Q
Рис. 4. DGGE - електрофореграма послідовностей 20-го екзона гена CFTR хворих на муковісцидоз та членів їхніх родин на носійство мутації W1282X 20-го екзона гена CFTR:
1 — негативний контроль; 4, 5,7,9,11 — здорові індивіди;
2 — здоровий індивід; 6, в, 10 — носій мутації W1282Х у гетерозиготному стані
3 — позитивний контроль на мутацію W1282Х;
ЛІТЕРАТУРА
1. Нечипоренко М. В., Кравченко С. А., Лів-шиць Л. А. Аналіз мутацій та VNTR-полі-морфізму гена фенілаланінгідроксилази // Укр. біохім. журн. — 2001. — Т. 73, №2. — С. 63-67.
2. Нечипоренко М. В., Лившиц Л. А. Анализ мутаций гена фенилаланингидроксилазы в семьях высокого риска фенилкетонурии в Украине // Цитология и генетика. — 2000. — Т. 34, №б. — С. 59-б3.
3. Резник Б. Я., Бабий И. Л., Лившиц Л. А. Муковисцидоз у детей и подростков. — К.: Здоров’я, 1994. — 144 с.
4. Fischer S. G., Lerman L. S. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory // Proc. Nat Acad. Sci. USA. — 1983. — V. 80. — Р. 1579-1583.
5. Fischer S. G., Lerman L. S. Separation of random fragments of DNA according to pro-peries of their sequences // Ibid. — 1980. — V. 77, N 8.- Р. 4420-4424.
6. Маниатис Т., Фрич E. E., Сэмбрук Ж. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1985. — 420 с.
7. Myers R. M., Fischer S. G., Maniatis T. et al. Nearly all single base substitutions In DNA fragnents joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis // Nuc. Acid. Res. — 1985. — V. 13, N9. — P. 3131-3145.
8. Lerman L. S., Silverstein K. Computational simulation of DNA melting and is application to DGGE // Meth. Enzymol. — V. 155. — Р. 482-501.
9. Guldberg P. Guttler F. A simple method for identification of point mutations using denaturing gradient gel electrophoresis // Nucl. Acid. Res. — 1993. — V. 21, N9. — P. 22б1-22б2.
10. Fanen P. Ghanem N. Vidaud M. et al. Molecular characterization of cystic fibrosis: 16 novel mutations identified by analysis of the whole cystic fibrosis conductance transmembrane regulator (CFTR) coding regions and splice site junctions // Genomics. — 1992. — V. 13, N 3. — P. 770-776.
11. Kadasі L., Polakova H., Zatkova A. et al. / INCO-BIOMED Workshop for Central and Eastern European Countries «DNA extraction and Cystic Fіbrosіs Mutation Detection Techrnques», Prague, September 13-16, 1997. — P. 15-17.
НОВЫЕ МЕТОДИКИ АНАЛИЗА МУТАЦИЙ В НЕКОТОРЫХ ЭКЗОНАХ ГЕНОВ РАН И CFTR ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕНАТУРИРУЮЩЕГО ГРАДИЕНТНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
А. А. Соловьев Д. А. Голомидов Л. А. Лившиц
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев
E-mail: livshits@imbg.org.ua
Разработаны диагностические методики для детекции мутантных вариантов некоторых экзонов генов РАН (фенилкетонурия) и CFTR (муковисцидоз) методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE). Показана высокая эффективность метода для применения в программах скрининга этих тяжелых наследственных заболеваний среди населения Украины.
Ключевые слова: DGGE, ген, мутации, ДНК-диаг-ностика, фенилкетонурия, муковисцидоз.
NEW TECHNIQUES FOR MUTATION ANALYSIS IN SOME EXONS OF PAH AND CFTR GENE OF MEN USING DENATURING GRADIENT GEL-ELECTROPHORESIS
O. O. Solovyov
D. O. Golomidov L. A. Livshyts
Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: livshits@imbg.org.ua
Diagnostic methods for mutant variants detection of some exons in PAH gene (phenylketonuria) and CFTR gene (cystic fibrosis) using denaturing gradient gel-electrophoresis (DGGE) were developed. High effectiveness method for the application in the screening programs of these severe hereditary diseases among the population of Ukraine was shown.
Key words: DGGE, gene, mutations, DNA diagnostics, phenylketonuria, cystic fibrosis.
