CC BY
176
И оригинальные исследования. инфекционные болезни
© Коллектив авторов, 2008 УДК 579.834.115-004.58(470.63)
НОВЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ И ПРЕПАРАТЫ В МОНИТОРИНГЕ ЛЕПТОСПИРОЗА
И.В. Самарина1, И.В. Жарникова1, Е.Н.Чеботарева1, В.П. Надеина1, О.В. Малецкая1, И.В. Ковальчук2, О.Г. Кириллова3, М.В. Фоменко4,
И.А. Волохова4, Т.В. Жарникова1, А.С. Кочарян1, Б.И. Левченко1,
И.Н. Заикина1
'Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
2Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Ставропольскому краю
3Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае 4Ставропольская межобластная ветлаборатория
По данным Главного государственного санитарного врача Г.Г. Онищенко (2007), в стране сохраняется нестабильная эпизоотическая и эпидемическая обстановка по лептоспирозам. Ежегодно на протяжении последних пяти лет в Российской Федерации регистрируется от 650 до 2500 заболеваний людей лептоспирозами (показатель заболеваемости составляет от 0,45 до 1,7 на 100 тыс. населения). Последний подъем заболеваемости отмечался в 2004 г., когда в 53 субъектах заболело 2459 человек, показатель заболеваемости составил 1,7 на 100 тыс. населения [10].
Реальный уровень заболеваемости лептоспирозами значительно превышает регистрируемые показатели вследствие гиподиагностики, обусловленной низкой клинической выявляемостью больных и несовершенством методов и средств лабораторной диагностики [14].
Ставропольский край располагается в одном из трех самых неблагополучных по лептоспирозу районах - Северо-Кавказском.
Целью настоящего исследования явилась оценка заболеваемости лептоспирозом в Ставропольском крае на основе тщательного анализа, а также подбор новых лабораторных методов и создание новых диагностических препаратов для использования в мониторинге лептоспирозов.
Материал и методы. Для характеристики эпидемической ситуации использовали как абсолютные величины, т.е. зарегистрированные случаи лептоспи-розной инфекции среди людей на данной административной территории в конкретном календарном году, так и относительный показатель: заболеваемость на 100 тысяч населения.
Постановку реакции микроагглютинации (РМА) на лептоспироз осуществляли в соответствии с Методическими указаниями Минздрава России «Эпиде-
миология, диагностика, клиника и профилактика леп-тоспироза» (МУ 3.1.1128-02) [14].
Постановку реакции макроагглютинации на стекле (слайд-агглютинацию) проводили в соответствии с наставлением, прилагаемым к слайд-антигену Леп-тоБАСА, производимому ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва.
С целью создания латексного антигенного лептос-пирозного диагностикума нами были использованы окрашенные полиакролеиновые латексы, представляющие собой гомогенную суспензию монодисперсных сшитых микросфер розового цвета с диаметром 1,2 ± 0,1 мкм, полученные из института биоорганической химии им. М.М.Шемякина (г. Москва).
Латексы коньюгировали путем ковалентного соединения с полигрупповым водорастворимым лептоспи-розным антигеном и получали антигенные латексные коньюгаты путем инкубации в течение 3-4 часов. Для этого к 0,5 мл 2% латекса добавляли 1,25 мл лептос-пирозного водорастворимого комплексного антигена, приготовленного из смеси культур патогенных лептос-пир, обеззараженных формалином в концентрации до 0,5%. Для получения бакмассы патогенные леп-тоспиры выращивали на среде Терских при (28±1)°С в течение 10-12 суток. Для получения полноценных антигенных комплексов лептоспир использована смесь культур лептоспир 6 серогрупп: L. Pomona, L. Tarassovi, L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorrhagiae, L. Canicola, L. Sejroe, имеющих наибольшее эпидемиологическое и эпизоотологическое значение на территории Ставропольского края, с плотностью культур при просмотре в темном поле зрения 70-100 м.к., в поле зрения с исходной концентрацией белка 700 мкг/мл. Получение водорастворимых антигенов лептоспир осуществляли по методу В.В. Бинатовой, 1999 [1]. Качество полученных водорастворимых антигенов оценивали в реакции иммунодиффузии в 1% агаровом геле (Difco, USA) по
O.Ouchterlony (1949). Смесь выдерживали на магнит-
Таблица 1
Сравнительные результаты РМА и реакции слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБАСА
№№ сывороток Титр в РМА Результат слайд-агглютинации с антигеном Лепто БАСА Наблюдаемая картина в слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБАСА
1 6 1:400++ с L. Icterohaemorrhagiae 1:200++ с L. Icterohaemorrhagiae положительный положительный агглютинаты видимые, нежные, мелкозернистые, просветление реакционной смеси неполное, учет реакции затруднен
2 1: 1600++ с L. Icterohaemorrhagiae положительный агглютинаты четко видимые, полное просветление реакционной смеси
3 1: 400++ с L. Grippotyphosa отрицательный
4 1: 200++ с L. Grippotyphosa отрицательный агглютинаты и просветление реакционной
5 1: 100++ с отрицательный смеси отсутствуют
7 L. Grippotyphosa 1:100++ с L. Sejroe отрицательный
8 (контроль) отрицательная отрицательный агглютинаты и просветление реакционной смеси отсутствуют
ной мешалке при постоянном перемешивании в течение 3-х часов при температуре (20 ± 2) °С, затем 18
- 20 часов при температуре (4±2) °С, добавляли 0,25 мл белкового стабилизатора концентрированного, выдерживали при комнатной температуре 20 минут для стабилизации суспензии, затем 3 раза отмывали забу-ференным физиологическим раствором (ЗФР) путем центрифугирования при 5 тыс. об/мин. в течение 10 мин. для удаления избытка не прореагировавшего лиганда. После последнего центрифугирования осадок растворяли в 5 мл разводящей жидкости, состоящей из белкового стабилизатора в разведении 1:50 с добавлением твин-80 до концентрации 1:80000.
Для приготовления белкового стабилизатора использовали жидкий белок куриного яйца, который соединяли с 5% раствором бикарбоната натрия и перемешивали в течение 2 часов на магнитной мешалке до получения гомогенной взвеси. Полученный раствор стабилизировали на водяной бане в течение 20 мин. при температуре 560 С и фильтровали (через несколько слоев марли), после чего доводили рН до 7,0-7,2.
Реакцию агглютинации латекса (РАЛ) проводили следующим образом: во все лунки планшета вносили разводящую жидкость (белковый стабилизатор в разведении 1:50 и твин-80 в конечном разведении 1:80000) в количестве 50 мкл. В первую лунку планшета вносили сыворотку 50 мкл в разведении 1:50 и титровали по 50 мкл до 11-й лунки. 12-я лунка - контрольная. Во все лунки планшета вносили по 25 мкл антигенного лептоспироз-ного латексного диагностикума. Планшет встряхивали и оставляли при комнатной температуре. Предварительный учет результатов проводили через 1,5-2 часа, окончательный через 24 часа. При этом положительную реакцию учитывали в лунках, поверхность которых была сплошь покрыта агглютинатом в виде «зонтика», а при отрицательной - суспензия диагностикума выпадала в виде «пуговки».
Для постановки латексной слайд-агглютинации на стекле к одной капле испытуемой сыворотки крови, разведенной физиологическим раствором 1:4, добавляли одну каплю антигенного лептоспирозного латексного диагностикума, перемешивали стеклянной палочкой и выдерживали при медленном покачивании 3-7 минут при комнатной температуре. В качестве контролей использовали одну каплю физиологического раствора, смешанного с одной каплей антигенного лептоспиро-зного латексного диагностикума, и одну каплю разведенной 1:4 физиологическим раствором заведомо отрицательной на лептоспироз сыворотки крови.
Результаты и обсуждение. Заболеваемость людей лептоспирозом на территории Ставропольского края наблюдается постоянно, и с 1987 г до 2000 г носила спорадический характер, когда регистрировали от 8 до 29 больных ежегодно [13].
Подъем заболеваемости лептоспирозом в крае с 2001 г обусловлен водными вспышками инфекции в 2001, 2004 и 2005 гг. в Красногвардейском районе края [2, 3, 5, 6, 8].
Заболеваемость лептоспирозом за последние 20 лет (1987-2006 гг.) отмечена в 27 субъектах Ставропольского края, наиболее высокая - в Красногвардейском, Георгиевском, Кировском, Новоалександровском и Шпаковском районах, а также в городах Ставрополь, Невинномысск и Пятигорск. В Курском, Левокумском, Новоселицком, Степновском и Туркменском районах заболеваний лептоспирозом среди людей не выявлено. Не исключено, что высокий уровень заболеваемости в краевом центре и в городах краевого подчинения связан с возможностями более эффективной диагностики лептоспирозов на этих территориях, а низкая заболеваемость в некоторых районах не является свидетельством ее отсутствия [13].
Интенсивный показатель в период с 1987 по 2006 гг. колебался в относительно благополучные годы в пределах 0,28 - 0,87; подъем этого показателя до 1,28
- 3,2 наблюдался в 2001, 2003-2005 гг. и отражал повышение заболеваемости лептоспирозом населения на 100 тыс. в годы возникновения вспышек инфекции [13]. В 2006 г в Ставропольском крае зарегистрировано 18 больных, интенсивный показатель составил 0,66 на 100 тыс. населения [4].
Летальность от лептоспироза в Ставропольском крае в 2004-2006 гг. составила 4,05-5,56 % от количества заболевших [2, 3, 4].
Заболевание более чем у половины больных леп-тоспирозом в Ставропольском крае в 2004-2006 гг связано с рыбной ловлей и купанием в открытых водоемах. Уход за сельскохозяйственными животными или контакт с грызунами присутствовали у 27 - 44,4 % заболевших. Среди заболевших преобладает мужское население (73-88,9%). Дети до 14 лет составили 1119% от числа больных лептоспирозом. Этиологическая структура лептоспирозов в Ставропольском крае у людей в последние годы определяется серогруппа-ми лептоспир Canicola, Sejroe, Icterohaemorrhagiae и Pomona [2,3,4].
Заболеваемости людей способствуют наличие большого количества хозяйственных очагов, рост
и ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
Таблица 2
Сравнительные результаты РМА и реакции агглютинации латекса (РАЛ) с антигенным лептоспирозным латексным диагностикумом
№№ испытуемых сывороток Титр в РМА Титр в реакции агглютинации с антигенным лептоспирозным латексным диагностикумом
1 1 400++ с L. Icterohaemorrhagiae 1 СО О О + + +
2 1 1600++ с L. Icterohaemorrhagiae 1 3200+++
3 1 400++ с L. Grippolvphosa 1 800+++
4 1 200++ с L. Grippotуphosa 1 1600+++
5 1 100++ с L. Grippotуphosa 1 800+++
6 1 200++ с L. Icterohaemorrhagiae 1 СО о о + + +
7 1 100++ с L. Sejroe 1 + + + 0 0 4
8 1 200++ с L. Sejroe 1 3200+++
9 1 100++ с L. Tarassovi 1 3200+++
10 1 100++ с L. Sejroe 1 4^ о О + + +
11 1 100++ с L. Sejroe 1 + + + 0 0 4
12 1 100++ с L. Sejroe 1 1600+++
13 1 100++ с L. Grippotуphosa 1 СО О О + + +
14 1 200++ с L. Pomona 1 3200+++
15 1 100++ с L. Pomona 1 со О О + + +
16 (контроль) отрицательная отрицательная
числа животных-лептоспироносителей, наличие природных очагов на территории Ставропольского края. Эпизоотии лептоспироза среди мелких мышевидных грызунов и насекомоядных установлены в 2002, 2004 и 2005 гг в двух районах края - Изобильненском и Нефтекумском [12]. Положительно реагирующие на лептоспироз животные выявлены среди всех видов сельскохозяйственных животных. Доля положительно реагирующих на лептоспироз животных (от числа обследованных) составила 8,1% в 2005 г и 6,3% в 2006 г
Лептоспироносительство выявлено у всех видов сельскохозяйственных животных, причем в 2006 г наметилась четкая тенденция к резкому увеличению числа животных-лептоспироносителей, что представляет серьезную угрозу эпидемическому благополучию населения. В 2006 г в крае зарегистрировано 4 неблагополучных пункта по заболеваемости лептоспирозом среди сельскохозяйственных и домашних животных.
Несмотря на эффект от комплекса проводимых режимно-ограничительных и ветеринарно-санитарных мероприятий, прогноз по заболеваемости населения лептоспирозом на будущие годы в Ставропольском крае остается неблагоприятным, и обусловливает необходимость постоянного подбора и совершенствования методов лабораторной диагностики этой инфекции.
С этой целью нами проведена оценка диагностической ценности слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБАСА производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г Москва).
В реакции слайд-агглютинации на лептоспироз на стекле с антигеном ЛептоБАСА были испытаны 7 сывороток крови от больных лептоспирозом людей (№17) и 1 сыворотка здорового человека (№8), предварительно подвергнутые исследованию на лептоспироз в РМА.
Получены 3 варианта результатов слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБАСА в сравнении с традиционной РМА:
1. При положительной РМА отмечали четко положительный результат слайд-агглютинации. Результаты обеих реакций четко совпадали при высоких титрах РМА (1:1600).
2. При положительной реакции РМА регистрировали положительный результат слайд-агглютинции с антигеном ЛептоБАСА, но учет реакции был затруднен.
Этот результат отмечали при титрах РМА 1:200-1:400.
3. При положительной РМА наблюдали отрицательный результат слайд-агглютинации. Этот вариант регистрировал при невысоких диагностических титрах РМА (1:100-1:400).
Таким образом, чувствительность слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБАСА значительно ниже, чем РМА. Тест может использоваться для диагностики лептоспироза, и положительный результат служит бесспорным доказательством диагноза. Однако все отрицательные результаты теста требуют уточнения с помощью РМА, т.к. отрицательный результат слайд-агглютинации не всегда свидетельствует об отсутствии инфицирования. Тест может быть пригоден для ориентировочных исследований в условиях массовых заболеваний людей лептоспирозом при отсутствии или отдаленном расположении специализированной лаборатории, с обязательным последующим исследованием материала от больных в РМА.
Для проверки активности антигенного лептоспиро-зного латексного диагностикума, полученного нами, были использованы сыворотки лептоспирозные агглютинирующие кроличьи, сыворотки крови крупного рогатого скота, положительно реагирующего на леп-тоспироз, сыворотки крови больных лептоспирозом, подтвержденного лабораторно в РМА. В качестве контроля взята сыворотка крови здорового человека.
Полученный антигенный лептоспирозный латексный диагностикум выявляет лептоспирозные антитела в сыворотке крови больных лептоспирозом, подтвержденным в РМА, и положительно реагирующих на лептоспироз сельскохозяйственных животных. Реакция отличается высокой чувствительностью, превосходящей РМА в 2-32 раза.
Эти же сыворотки испытаны в реакции слайд-агглютинации на стекле.
Во всех исследуемых образцах сывороток крови (положительных в РМА) при постановке реакции латексной слайд-агглютинации наблюдали четко видимые агглютинаты при различной степени просветления реакционной смеси.
Заключение. В условиях сложившейся неблагоприятной эпидемической ситуации по лептоспирозам в Ставропольском крае оценка новых лабораторных методов и конструирование диагностических препаратов для использования в мониторинге лептоспиро-
зов в Ставропольском крае актуальны и целесообразны. В результате оценки диагностической ценности слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБAСA производства HИИЭM им. КФ. Гамалеи выявлено, что тест может быть пригоден для ориентировочных исследований в условиях массовых заболеваний людей лептоспирозом в связи с удобством его применения, но с обязательным последующим исследованием материала от больных в PMA в связи с его меньшей чувствительностью.
Конструирование латексных диагностикумов леп-тоспирозных антигенных полигрупповых принципиально возможно, тест обладает высокой чувствительностью, внедрение его для мониторинга лептоспирозов перспективно, однако требует более детального изучения специфичности, что и предусмотрено дальнейшими нашими исследованиями.
Литература
1. Бинатова, В.В. Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза: Aвтореф. дис. ... канд. биол. наук I В.В. Бинатова. - Ставрополь, 1999. - 29 с.
2. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Ставропольском крае в 2004 году».
- Ставрополь, 2005. - С. 100.
3. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Ставропольском крае в 2005 году».
- Ставрополь, 2006. - С . 112-115.
4. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Ставропольском крае в 2006 году».-Ставрополь, 2007. - С. 123-124.
5. Евченко, ЮЖ Лептоспироз в Ставропольском крае (проблемы и перспективы) I Ю^. Евченко, И.В. Самарина [и др.] II Сб. научн. тр. Aктуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. - Mосква, 2006.
- Вып. 8. - С. 306-309.
6. Ковалев, H.T О вспышке лептоспироза в Красногвардейском районе в 2005 г I H.R Ковалев, И.В. Ковальчук, ОА Ба-
НОВЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ И ПРЕПАРАТЫ В МОНИТОРИНГЕ ЛЕПТОСПИРОЗА
И.В.САМАРИНА, И.В. ЖАРНИКОВА, Е.Н.ЧЕБОТАРЕВА, В.П. НАДЕИНА, О.В. МАЛЕЦКАЯ, И.В. КОВАЛЬЧУК, О.Г. КИРИЛЛОВА, М.В. ФОМЕНКО, И.А. ВОЛОХОВА, Т.В. ЖАРНИКОВА, А.С. КОЧАРЯН,
Б.И. ЛЕВЧЕНКО, И.Н. ЗАИКИНА
В рамках проводимого мониторинга лептоспирозов на территории Ставропольского края изучена заболеваемость и этиологическая структура лептоспирозов, оценена эпидемическая и эпизоотологическая обстановка, природная очаговость инфекции. Сделан неблагоприятный эпидемиологический прогноз по лептоспирозам на ближайшие годы в Ставропольском крае. Изучена возможность конструирования латексных диагностикумов лептоспирозных антигенных полигрупповых, оценивалась чувствительность и практическая значимость предложенной НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБАСА.
В результате оценки диагностической ценности слайд-агглютинации с антигеном ЛептоБАСА выявлено, что тест пригоден для ориентировочных исследований в условиях массовых заболеваний людей лептоспирозом в связи с удобством его применения, но с обязательным последующим исследованием материала от больных в РМА в связи с его меньшей чувствительностью. Конструирование латексных диагностикумов лептоспирозных антигенных полигрупповых принципиально возможно, тест обладает высокой чувствительностью, но требует дальнейшего изучения специфичности.
Ключевые слова: лептоспироз, мониторинг, Ставропольский край, лабораторные методы, диагностические препараты
лабан [и др.] // Матер. науч.-практич. конф. Опыт работы органов и учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей. - Ставрополь, 2006. - С. 108-111.
7. Лептоспироз / В кн. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сборник санитарных и ветеринарных правил // Госкомсанэ-пиднадзор России, Минсельхозпрод России. - Москва, 1996. - С. 136-147.
8. Мезенцев, В.М. Вспышка лептоспироза в Красногвардейском районе Ставропольского края в 2001 г. / В.М. Мезенцев, Н.Г Ковалев, [и др.] // Матер. юбилейной на-учно-практич. конф. Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы / Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности. - Ставрополь, 2002. - С. 173-177.
9. Онищенко, ГГ Эпидемиология и профилактика лептоспирозов / ГГ. Онищенко, Н.М. Благовещенская, Ю.М. Ломов, В.В. Баташев, Ю.М. Федоров, Г.Т. Айдинов.
- Ростов-на-Дону, 2004. - 148 с.
10. Постановление главного государственного санитарного врача Российской Федерации №73 от 24.09.2007 г. «Об организации мероприятий по профилактике лептоспи-розов» - 6 с.
11. Попов, В.А. Лептоспироз / В.А. Попов, И.В. Самарина, В.В. Бинатова // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. - Саратов, 1998.
- Т. 2. - С. 44-79.
12. Самарина, И.В. К вопросу о природной очаговости леп-тоспирозов в Ставропольском крае / И.В. Самарина, Б.И. Левченко, И.Н. Емельянова [и др.] // Матер. конф. Диагностика, профилактика и лечение лептоспироза людей и животных. - Москва, 2007. - С. 54-55.
13. Самарина, И.В. Особенности эпидемиологии лептос-пироза в Ставропольском крае на современном этапе / И.В. Самарина, В.М. Мезенцев [и др.] // Сб. научных тр. Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. - Москва. - 2006. - Вып. 8. - С. 289-292.
14. Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами: Методические указания.
- М.:Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. - 44 с.
NEW LABORATORY METHODS AND PREPARATIONS IN MONITORING OF LEPTOSPIROSIS
SAMARINA I.V., ZHARNIROVA I.V., CHEBOTARYOVA E.N., NADEINA V.P., MALETSKAYA O.V., KOVALCHUK I.V., KIRILLOVA O.G., FOMENKO M.V., VOLOKHOVA I.A., ZHARNIKOVA T.V., KOCHARYAN A.S., LEVCHENKO B.I., ZAIKINA I.N.
Within the limits of carried out monitoring of leptospirosis in the Stavropol Region, morbidity and etiologic structure of leptospiroses were investigated, epidemic and epizootologic conditions, natural outbreak spot of infections were estimated. The adverse epidemiological forecast on leptospiroses for the nearest years in Stavropol Region was made. The opportunity of designing of latex diagnostics (leptospirous, antigenic, polygroup) was studied. Sensitivity and the practical importance of a slide-agglu-tination with antigen LeptoBASA, offered by SRIEM of N.F Gama-leya were estimated.
As a result of estimation of diagnostic value of a slide-agglu-tination with antigen LeptoBASA, it was revealed, that the test is suitable for preliminary researches in conditions of mass diseases of people with leptospirosis due to convenience of its application, but with obligatory subsequent research of a material from patients in RMA due to its lower sensitivity. Designing of latex diagnostics (leptospirous, antigenic, polygroup) is essentially possible, the test is of high sensitivity, but demands the further studying of specificity.
Key words: leptospirosis, monitoring, the Stavropol Region, laboratory methods, diagnostic preparations
