CC BY
54
УДК 544.475
НОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КАСПАЗЫ-7 НАЙДЕНЫ С ПОМОЩЬЮ
РАСЧЕТА
© 2013 А. Ю. Лизунов1, И. Е. Ясный2
^ст. преподаватель каф. высшей математики e-mail: al hio amail. ru
Московский физико-технический институт
2 канд. хим. наук, научный эксперт e-mail: yasny@ihcgenerium. ru
ООО «Международный биотехнологический центр "Генериум"»
С помощью программы докинга проведен виртуальный скрининг 24700 веществ, содержащих карбоксильную группу (COOH), по отношению к белку каспаза-7. Для 29 веществ, выбранных на основании виртуального скрининга, была проведена экспериментальная проверка ингибирующей активности в отношении целевого белка в тест-системе на основе флуоресцентного субстрата. Для 5 веществ экспериментально показана не известная ранее ингибирующая активность в отношении каспазы-7.
Ключевые слова: ингибиторы каспазы, каспаза-7, виртуальный скрининг, компьютерное моделирование.
Введение
Белок каспаза-7 - один из участников финальной стадии процесса апоптоза -является перспективной лекарственной мишенью для лечения таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, гибель лимфоцитов при сепсисе, атеросклероз, последствия ишемии [Lamkanfi 2010; Женодарова 2010].
На данный момент известно около 350 ингибиторов каспазы-7, которые можно разбить приблизительно на 10 классов схожих веществ [Женодарова 2010; www.bindingdb.org]. Однако задача поиска принципиально новых ингибиторов каспазы-7 остается актуальной, так как к лекарственным средствам, помимо ингибирования белка-мишени, предъявляется ряд других требований, связанных с метаболизмом веществ в организме (ADMET) [Женодарова 2010; Van de Waterbeemd 2003]. Так, согласно [Design of Caspase Inhibitors 2009], только 4 ингибитора каспаз были направлены на клинические испытания, и ни одно из веществ пока их не прошло. Кроме того, каждый качественно новый ингибитор может служить отправной точкой для поиска ряда схожих ингибиторов, обладающих более высокой активностью или другими необходимыми для лекарства свойствами.
Каспаза-7 является достаточно гибким белком, и большая часть известных ингибиторов связываются с ней ковалентно. Эти два фактора затрудняют поиск ингибиторов с помощью численного моделирования (in silico), но, несмотря на это, с помощью модифицированной программы «Алгокомб» [Ramensky 2007] удалось найти пять новых ингибиторов этого белка.
C точки зрения экспериментальной проверки активности ингибиторов каспаза-7 представляет собой удобный объект, так для нее существуют флуоресцентные и хромогенные субстраты, позволяющие измерить ингибирующую способность веществ-кандидатов.
После предварительного выбора трехмерной структуры белка и калибровки
программы докинга из баз данных коммерчески доступных в России веществ были выбраны 24700 веществ, содержащих карбоксильную группу (COOH). Для выбранных соединений был выполнен расчет оценки связывания с каспазой-7, отобраны 29 молекул с высокой оценкой связывания, удовлетворяющих дополнительным условиям жесткости и расположения в сайте связывания. Эти вещества были закуплены, для них проверена ингибирующая способность в отношении рекомбинантной каспазы-7, экспрессированной в клетках E.coli. 5 из 29 соединений продемонстрировали ингибирование с IC50 на уровне 10-500 мкМ в тестовой системе на основе
синтетического субстрата.
Компьютерный поиск ингибиторов каспазы-7
Для расчета активности веществ в отношении каспазы-7 использовалась модифицированная программа Алгокомб [Ramensky 2007]. В программе была модифицирована оценочная функция, благодаря внесенным изменениям программа стала лучше оценивать вклад взаимодействий лиганд-лиганд и лиганд-растворитель в полную энергию образования комплекса белок-лиганд. Подробное описание изменений в оценочной функции готовится к публикации.
На основе предварительных тестовых расчетов среди доступных в PDB [www.rcsb.org/pdb] структур каспазы-7 для докинга была выбрана структура с кодом 3ibc. Для выбранной структуры была показана возможность отличить по оценке связывания некоторые активные в отношении каспазы-7 вещества от неактивных и определено пороговое значение оценки связывания, равное 16 условным единицам [Лизунов 2010].
Анализ результатов докинга в процессе калибровки программы показал, что обязательным условием получения молекулой высокой оценки качества связывания при докинге в структуру 3ibc является наличие в молекуле карбоксильной группы (COOH). Из баз данных коммерчески доступных в России веществ (поставляемых фирмой «Интербиоскрин») были выбраны 24700 веществ, содержащих карбоксильную группу (COOH). Для выбранных веществ был выполнен расчет оценки активности в отношении каспазы-7. На основе расчетов были отобраны 29 веществ с оценкой активности выше 16 единиц, удовлетворяющих дополнительным условиям жесткости и расположения в сайте связывания. Эти вещества были закуплены для проведения экспериментальной проверки ингибирования каспазы-7.
Предварительная проверка наличия активности предложенных ингибиторов
Вещества растворяли в концентрации 0,1 мг/мкл в ДМСО, затем разбавляли до концентрации 1 мкг/мкл буфером PBS. 50 мкл такого раствора смешивали с 50 мкл каспазы, инкубировали 10 минут и проводили измерение остаточной активности фермента по сравнению с контрольным образцом, содержавшим только 1 % раствор ДМСО в буфере. В качестве субстрата использовали флуорогенный синтетический пептид Ac-DEVD-R110, который после расщепления каспазой-7 образует родамин-110 с максимумами возбуждения при 499 нм и испускания при 521 нм.
На стадии предварительной проверки 5 веществ проявили ингибирующую активность в отношении каспазы-7. Для вещества с кодом 809, проявившего наибольшую ингибирующую активность, было проведено измерение IC50 .
Протокол эксперимента по определению IC^q
для ингибитора 809
Подготовка растворов:
1) приготовлен раствор ингибитора 809 в буфере PBS с концентрацией 1,65 мМ из раствора в DMSO (Sigma, США, кат. № 472301) 0,165 М;
2) приготовлены растворы ингибитора в буфере PBS с концентрациями 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 мкМ в планшете, по 50 мкл каждого.
3) приготовлен раствор каспазы-7 1:10 в PBS (одна часть объемная раствора каспазы-7, полученной после очистки белка (1 мкг/мкл), к 10 частям объемным PBS);
4) приготовлен раствор субстрата 1:50 в буфере Apo-one (Promega, США, кат. № G7790).
Измерение IC50 :
1) добавлено 50 мкл раствора каспазы (0,1 мкг/мкл) к растворам ингибитора; инкубированы 10 мин при 37°C. В качестве контроля использовался 1 %-ный раствор DMSO в буфере PBS;
2) добавлено 50 мкл раствора субстрата к каждому раствору каспазы с ингибитором, измерена скорость роста флуоресценции при длине волны возбуждения 499 нм и длине волны испускания 521 нм;
3) обработаны результаты.
Измерения проводили группами по три образца, добавляя фермент к ингибитору и инкубируя 10 минут. После этого добавлением субстрата инициировали ферментативную реакцию.
Измерение флуоресценции проводили в течение 5 минут.
По линейному участку зависимости флуоресценции от времени определяли тангенс угла наклона прямой, пропорциональный активности фермента. На рисунке 1 приведены примеры таких зависимостей с их линейной аппроксимацией.
Рис. 1. Линейная аппроксимация зависимости флуоресценции от времени при трех разных концентрациях ингибитора (темно-синий - 20 мкМ, фиолетовый - 25 мкМ, желтый - 30 мкМ)
На рисунке 2 приведен график зависимости тангенсов угла наклона для разных концентраций ингибитора в одном из экспериментов по измерению ингибирующей активности вещества № 809.
С, мкМ
Рис. 2. Зависимость активности фермента от концентрации ингибитора. Красные линии проведены для определения 1С .
Из графика определяли 1С50 ингибитора как значение концентрации, при
которой активность фермента составляет 50 % от максимальной.
Экспериментальные результаты по ингибированию каспазы-7
Из 29 протестированных веществ ингибирующую активность в отношении каспазы-7 проявили 5 веществ: 809, 186, 830, 484 и 533. Наибольшую активность проявило вещество 809, для него был проведён ряд экспериментов по измерению 1С50,
показавших итоговый результат 20,8±8,0 мкМ. В таблице 1 приведены значения 1С50,
измеренные с различными препаратами каспазы-7.
Было показано, что условия получения каспазы-7 сильно влияют на сродство фермента к субстратам и ингибиторам. Вероятно, это связано с различным окислительным состоянием SH-групп на поверхности фермента, которое, в силу гибкости структуры данного белка, влияет на конформацию активного центра.
Таблица 1
ГС50 ингибитора
Препарат каспазы Значение 1С50, мкМ
№ 1 15,0
№ 2 20,0
№ 3 27,5
Среднее 20,8±8,0
Выводы
Несмотря на то что каспаза-7 является сложной мишенью для компьютерного поиска ингибиторов, с помощью модифицированной программы «Алгокомб» удалось найти 5 новых ингибиторов этого белка. Отсутствие ранее опубликованной активности обнаруженных ингибиторов в отношении каспазы-7 подтверждается отсутствием схожих ингибиторов в базе данных опубликованных активностей органических соединений в отношении белков BindingDB [www.bindingdb.org]. Для наилучшего ингибитора - 809 - было вычислено значение 1С50, для остальных в таблице 2
приводится примерная оценка ингибирующей активности.
Таблица 2
1С50 и структуры веществ, проявивших активность по отношению к каспазе-7
Шиф
р вещества
Значение 1С50 для ингибирования
каспазы-7 (мкМ)
Структурная формула
809
20,8±8,0
186
-50
830
100
533
-500
484
500
На рисунке 3 изображено положение ингибитора 809 в активном сайте каспазы-7, найденное с помощью докинга.
Рис. 3
Библиографический список
Женодарова С. М. Низкомолекулярные ингибиторы каспаз // Успехи химии. 2010. 79 (2). С. 135-161
Лизунов А. Ю. Влияние выбора трехмерной структуры белка на результаты виртуального скрининга на примере белка каспаза-7 // Молекулярные технологии. 2010. 4. 224-233 URL: http://www.niipa.ru/journal/articles/13.pdf (дата обращения: 13.04.2013)
Lamkanfi M., Kanneganti T.D. Caspase-7: A protease involved in apoptosis and inflammation //Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010. V. 42(1). P. 21-24.
Ramensky V., SobolA., Zaitseva N., Rubinov A., Zosimov V. A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results // Proteins. 2007. V. 69(2). P. 349-357.
Van de WaterbeemdH., GiffordE. ADMET in silico modelling: towards prediction paradise? // Nature Reviews Drug Discovery. 2003. V. 2. P. 192-204.
Design of Caspase Inhibitors as Potential Clinical Agents. CRC Press Taylor & Francis Group. 2009.
База данных опубликованных активностей органических соединений в отношении белков. URL: http://www.bindingdb.org. (дата обращения: 12.02.2013)
Электронная база данных расшифрованных трехмерных структур белковых комплексов Protein Data Bank (PDB). URL: http://www.rcsb.org/pdb/ (дата обращения: 15.06.2013)
