CC BY
65
М.Д. Уразов, младший научный сотрудник лаборатории по разработке методов нейропротекции Центра трансляционных технологий1; аспирант кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины1;
Т.А. Астраханова, младший научный сотрудник лаборатории по разработке методов нейропротекции Центра трансляционных технологий1; аспирант кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины1;
А.В. Усенко, лаборант лаборатории по разработке методов нейропротекции Центра трансляционных технологий1; магистр кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины1;
Т.А. Мищенко, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории по разработке методов нейропротекции Центра трансляционных технологий1; старший научный сотрудник отдела молекулярно-клеточных технологий ЦНИЛ2;
Н.А. Щелчкова, к.б.н., доцент кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины1;
зав. отделом молекулярно-клеточных технологий ЦНИЛ2;
Г.А. Кравченко, к.б.н., доцент кафедры молекулярной биологии и иммунологии
Института биологии и биомедицины1;
М.В. Ведунова, д.б.н., ведущий научный сотрудник Института биологии и биомедицины1; директор Института биологии и биомедицины1;
Е.В. Митрошина, к.б.н., доцент кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины1; старший научный сотрудник лаборатории по разработке методов нейропротекции Центра трансляционных технологий1; старший научный сотрудник отдела молекулярно-клеточных технологий ЦНИЛ2
Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, проспект Гагарина, 23, Н. Новгород, 603950;
2Приволжский исследовательский медицинский университет, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1, Н. Новгород, 603005
Цель исследования — изучить особенности влияния хронической и острой пренатальной гипоксии на показатели функциональной активности ЦНС и оценить роль митохондрий в защите ЦНС от гипоксических повреждений в эксперименте.
Материалы и методы. Эксперименты in vivo были выполнены на мышах линии C57BL/6. Для моделирования хронической пренатальной гипоксии беременные самки мышей ежедневно, начиная с 14-го дня гестации и до родов, помещались в гипобариче-скую барокамеру, в которой в течение 2 ч поддерживали давление 280-300 мм рт. ст., что соответствует высоте 8000 м над уровнем моря. Моделирование острой пренатальной гипоксии осуществлялось на 18-й день гестации. Беременные самки на 4-5 мин, до первого агонального вздоха, помещались в барокамеру, в которой создавалось давление 220-240 мм рт. ст., соответствующее высоте 10 000 м над уровнем моря. Оценивали скорость потребления кислорода митохондриями клеток головного мозга мышат на 1-е сутки постнатального развития с помощью респирометра высокого разрешения Oxygraph-2k (Oroboros Instruments, Австрия). Для определения общего состояния ЦНС в отдаленном постгипоксическом периоде животным в возрасте 4 нед проводили оценку неврологического статуса по шкале определения неврологического дефицита у мелких лабораторных животных и шкале Гарсии, а также оценку мнестических и когнитивных способностей путем тестирования в водном лабиринте Морриса.
Для контактов: Митрошина Елена Владимировна, e-mail: helenmitroshina@gmail.com
Результаты. Разработаны протоколы моделирования острой и хронической пренатальной гипоксии на мышах in vivo. Установлено, что острое гипоксическое повреждение приводит к значительному снижению базальной скорости потребления кислорода и интенсивности окислительного фосфорилирования митохондриями головного мозга новорожденных мышат, а также к активации II дыхательного комплекса. После перенесенной хронической пренатальной гипоксии базальная скорость потребления кислорода и интенсивность окислительного фосфорилирования достоверно увеличивались по сравнению с интактной группой.
Заключение. Разработанные протоколы экспериментального моделирования пренатальной гипоксии позволили выявить особенности адаптации митохондриального аппарата нервных клеток к разным типам гипоксического повреждения. Установлено, что хроническая гипоксия приводит к адаптации митохондриального аппарата, проявляющейся в интенсификации окислительного фосфорилирования.
Ключевые слова: пренатальная гипоксия; окислительное фосфорилирование; митохондрии; ЦНС.
Как цитировать: Urazov M.D., Astrakhanova Т.А., Usenko A.V., Mishchenko Т.А., Schelchkova N.A., Kravchenko G.A., Vedunova M.V., Mitroshina E.V. New aspects of central nervous system adaptation to prenatal hypoxia. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(4): 60-68, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.4.07
English
New Aspects of Central Nervous System Adaptation to Prenatal Hypoxia
WI.D. Urazov, Junior Researcher, Laboratory for Neuroprotection Methods Development, Center for Translational Technologies1; PhD Student, Department of Neurotechnologies, Institute of Biology and Biomedicine1;
Т.А. Astrakhanova, Junior Researcher, Laboratory for Neuroprotection Methods Development, Center for Translational Technologies1; PhD Student, Department of Neurotechnologies, Institute of Biology and Biomedicine1;
А.V. Usenko, Laboratory Assistant, Laboratory for Neuroprotection Methods Development, Center for Translational Technologies1; Master, Department of Neurotechnologies, Institute of Biology and Biomedicine1;
Т.А. Mishchenko, PhD, Senior Researcher, Laboratory for Neuroprotection Methods Development, Center for Translational Technologies1; Senior Researcher, Molecular and Cell Technologies Department, Central Scientific Research Laboratory2;
NA Schelchkova, PhD, Associate Professor, Department of Neurotechnologies, Institute of Biology and Biomedicine1; Head of Molecular and Cell Technologies Department, Central Scientific Research Laboratory2;
G.A. Kravchenko, PhD, Associate Professor, Department of Molecular Biology and Immunology; Institute of Biology and Biomedicine1;
WI.V. Vedunova, DSc, Leading Researcher, Institute of Biology and Biomedicine1; Director of Institute of Biology and Biomedicine1;
Е.V. Mitroshina, PhD, Associate Professor, Department of Neurotechnologies,
Institute of Biology and Biomedicine1; Senior Researcher, Laboratory for Neuroprotection Methods Development, Center for Translational Technologies1; Senior Researcher, Molecular and Cell Technologies Department, Central Scientific Research Laboratory2
1National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, 23 Prospekt Gagarina, Nizhny Novgorod, 603950, Russia;
2Privolzhsky Research Medical University, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russia
The aim of the investigation was to study the effect of chronic and acute prenatal hypoxia on the parameters of CNS functional activity and to assess the role of mitochondria in the protection of the CNS against experimental hypoxic influence in vivo.
Materials and Methods. The experiments in vivo were performed on C57BL/6 mice. In order to model chronic prenatal hypoxia, pregnant female mice were placed daily into a hypobaric chamber beginning with the fourteenth day of gestation up to delivery. 280-300 mm Hg pressure corresponding to the altitude of 8000 m above sea level was maintained in the chamber for 2 h. Acute prenatal hypoxia was modeled on the eighteenth day of gestation. Pregnant females were placed for 4-5 min (till the first agonal breath) in the hypobaric chamber under 220-240 mm Hg pressure corresponding to the altitude of 10,000 m above sea level.
Oxygen consumption rate by mice brain mitochondria was assessed on the first day of the post-natal period using a high-resolution Oxygraph-2k respirometer (Oroboros Instruments, Austria). To determine a general state of the CNS in the remote post-hypoxic period, a neurological status of the 4-week-old animals was evaluated according to the neurological deficit scale for small laboratory animals and Garcia's scale. Mnestic and cognitive abilities were also tested in Morris water maze.
Results. Protocols of acute and chronic prenatal hypoxia modeling for mice have been designed. Acute hypoxic damage has been shown to result in the significant decrease of the basal oxygen consumption rate and intensity of oxidative phosphorylation by the brain
mitochondria of the newborn mice, and in the activation of the respiratory complex II. After chronic prenatal hypoxia, the basal oxygen consumption rate and oxidative phosphorylation intensity significantly increased relative to the intact group.
Conclusion. The designed protocols of experimental prenatal hypoxia modeling allowed us to reveal a specific pattern of mitochondrial apparatus adaptation to various types of hypoxic damage. Chronic hypoxia leads to adaptation of the mitochondrial apparatus characterized by intensification of oxidative phosphorylation.
Key words: prenatal hypoxia; oxidative phosphorylation; mitochondria; CNS.
Введение
Пренатальная гипоксия представляет собой патологическое состояние, характеризующееся пониженным содержанием кислорода в тканях, и является одним из ключевых факторов, определяющих патогенез широкого спектра заболеваний, которые встречаются у плода. Тяжелые гипоксические поражения ЦНС в пренатальном периоде могут обусловливать повреждения развивающегося плода, способствуя возникновению энцефалопатии, детского церебрального паралича, асфиксии, гидроцефалии, вторичной микроцефалии, а также являться одной из основных причин грубой задержки психоэмоционального развития, судорожных симптомов и детской смертности [1].
Согласно статистике, 65% случаев повреждений ЦНС у новорожденных обусловлены гипоксически-ишемическими нарушениями и только 15% приходятся на различные постнатальные и генетические факторы [2]. Поражения нервной системы приводят к детской инвалидности в 20,6% случаев, при этом в 70-80% случаев они обусловлены перинатальными факторами [3].
Последствия пренатальной гипоксии не всегда соотносятся со степенью ее тяжести. Большое значение имеют сроки онтогенеза, в которые произошло нарушение поступления кислорода. В пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе выделяют несколько критических периодов, когда организм (и в особенности мозг) становится особенно восприимчивым к неблагоприятным воздействиям, а негативные последствия таких воздействий наиболее значимы [4].
Нарушения, обусловленные действием гипоксии во время раннего онтогенеза, могут приводить к возникновению не только грубых дефектов развития (врожденные аномалии — уродства), но и различных функциональных нарушений в деятельности клеток, органов и систем всего организма. При действии повреждающих факторов в ранние сроки, в период активного органогенеза, могут происходить гибель плода, увеличение частоты возникновения хромосомных аберраций в клетках тканей организма, а также появление таких пороков развития, как анэнцефалия, ацефалия, анофтальмия, заячья губа, фо-комелия, амелия, атрезия ротового отверстия и др. Функциональные нарушения связывают с более поздними сроками пренатального онтогенеза [5, 6].
В некоторых особо чувствительных структурах мозга, например коре больших полушарий, вследствие
воздействия гипоксии изменяется нормальный баланс нейромедиаторов (глутамата, дофамина, серотонина, ацетилхолина и др.) и продуктов их обмена [7], кроме того, происходят нарушения структурно-функциональных свойств клеточных мембран, что может вызывать гибель клеток [8]. Гипоксия также способна приводить к изменению активности транскрипции генов, ответственных за программируемую гибель клеток [9].
В то же время многие особенности адаптации ЦНС к воздействию гипоксии в пренатальном периоде, особенно компенсаторные реакции митохондриального аппарата нервных клеток, остаются неисследованными. Их изучение позволит решить одну из актуальных задач современной фундаментальной и практической медицины.
Большую роль в изучении пренатальной гипоксии и ее негативных последствий играют исследования на животных. Однако используемые в настоящее время экспериментальные модели не являются достаточно точными, поскольку зачастую не позволяют получить выраженное гипоксическое повреждение мозга плода, а также исследовать воздействие хронического гипоксического пренатального стресса. Подавляющее большинство авторов предлагают различные варианты однократного гипоксического воздействия на беременную самку [5, 7, 10, 11]. Поскольку адаптационный потенциал у экспериментальных животных значительно выше, чем у человека, подобные подходы не позволяют достичь выраженных нарушений функции ЦНС. Также следует учитывать, что аппроксимация экспериментальных данных, полученных при моделировании патологии на животных, к человеку требует знания соотношения основных поведенческих характеристик и критических периодов развития плода у человека и экспериментального животного. Вследствие этого разработка адекватной комплексной модели для тестирования состояния ЦНС при гипоксическом постнатальном стрессе является актуальной проблемой экспериментальной медицины.
При проведении исследований особое внимание необходимо уделять методам оценки когнитивных функций и общего состояния нервной системы. Важно учитывать время предъявления воздействия, критические сроки наибольшей уязвимости нервных клеток в течение беременности.
Беременность лабораторных животных так же, как и у человека, принято условно разделять на три периода. Так, начало третьего «триместра» беременности у мышей представляет собой этап, в течение которого
в мозге эмбрионов активно протекают процессы пролиферации и миграции клеток. Этот этап является наиболее значимым и для становления врожденных форм двигательного поведения. Для полноценного развития когнитивных процессов очень важны периоды пролиферации и миграции нейробластов и их созревания и дифференцировки. Нарушение эмбрионального развития в течение этих периодов может послужить причиной повреждения механизмов кратковременной и долговременной памяти [12].
С учетом этих данных моделирование хронической пренатальной гипоксии проводилось на животных с 14-го дня беременности ежедневно. Моделирование острой пренатальной гипоксии выполняли однократно на 18-й день гестации, когда уровень пролиферации клеток в мозге снижается и ускоряются процессы их созревания и дифференцировки.
Цель исследования — изучить особенности влияния хронической и острой пренатальной гипоксии на показатели функциональной активности ЦНС и оценить роль митохондрий в защите ЦНС от гипоксиче-ских повреждений в эксперименте.
Материалы и методы
Объект исследования. Эксперименты in vivo были выполнены на мышах линии C57BL/6. Содержание животных в сертифицированном виварии Национального исследовательского Нижегородского государственного университета соответствовало требованиям приказов №1179 МЗ СССР от 11.10.1983 и №267 МЗ РФ от 19.06.2003, а эксперименты выполнялись согласно международным правилам «Guide for the Care and Use of Laboratory Animais» (National Research Council, 2011), отвечали требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006), и были согласованы с Биоэтической комиссией ННГУ.
Для моделирования хронической пренатальной гипоксии беременных самок мышей ежедневно (начиная с 14-го дня гестации и до родов) помещали в гипоба-рическую барокамеру, в которой в течение 2 ч поддерживали давление 280-300 мм рт. ст., что соответствует высоте 8000 м над уровнем моря.
Моделирование острой пренатальной гипоксии осуществлялось на 18-й день гестации. Беременные самки на 4-5 мин, до первого агонального вздоха, помещались в барокамеру, в которой создавалось давление 220-240 мм рт. ст., соответствующее высоте 10 000 м над уровнем моря.
Оценка неврологического статуса. Для определения общего состояния ЦНС после воздействия гипоксии проводили оценку неврологического статуса животных по шкале определения неврологического дефицита у мелких лабораторных животных и шкале Гарсии. Обе шкалы представляют собой серию простых тестов на различные когнитивные способности
животных с балльной системой оценки. Для шкалы определения неврологического дефицита у мелких лабораторных животных проводится тест из 10 поведенческих реакций, каждую из которых оценивают от 0 до 2 баллов, где 2 балла — отсутствие реакции. Полученные баллы суммируют. Интерпретация результатов оценки неврологического статуса:
от 10 до 20 баллов — выраженное повреждение ЦНС;
от 6 до 9 баллов — умеренное повреждение ЦНС; от 1 до 5 баллов — легкое повреждение ЦНС. В шкале Гарсия используются 6 тестов для оценки асимметрии движений и реакций животного в баллах (от 1 — выраженные нарушения до 3 — отсутствие нарушений), которые также затем суммируются. Минимальный неврологический результат составляет 3 балла (максимальные нарушения), а максимальный — 18 баллов (отсутствие нарушений).
С целью оценки возможных отдаленных последствий пренатальной гипоксии и их влияния на метаболизм животных проводили оценку массы новорожденных мышат в динамике.
Для исследования процессов пространственного обучения и памяти было использовано тестирование в водном лабиринте Морриса [13], которое проводили с помощью модифицированного протокола K.M. Frick с соавт. [14]. Процесс обучения в лабиринте длился 5 дней и представлял собой 5 сеансов по 3 попытки поиска платформы для каждого животного. Перерыв между попытками составлял 30 с. При воспроизведении навыка на 7-й день платформа убиралась из бассейна и каждое животное тестировалось однократно в течение 60 с. Помимо регистрации отсроченного коэффициента сохранения (оКс) — доли времени пребывания животного в зоне, где находилась платформа, по отношению к общему времени пребывания животного в водном лабиринте Морриса — нами также оценивались:
характер поиска животными цели в лабиринте Морриса (прямой поиск — животное непосредственно направлялось к месту бывшего расположения платформы; активный поиск — животное осуществляло циркулярные и радиальные поисковые движения, прежде чем достигнуть цели; хаотический поиск — отсутствие выраженной стратегии достижения цели);
дистанция, пройденная животным до достижения цели (расстояние, пройденное с момента помещения в лабиринт Морриса до нахождения места бывшего расположения платформы) [13].
Оценка функционального состояния митохондрий. Для анализа влияния гипоксии на функциональное состояние митохондрий проводили оценку скорости потребления ими кислорода. Определение функциональной активности митохондрий выполняли у новорожденных мышат через 24 ч после родов. Все манипуляции осуществляли на льду. Оборудование и среды выделения были охлаждены. Митохондрии выделяли из ткани головного мозга мышей с помощью
экспериментальные исследования
дифференциального центрифугирования по методике М.В. Егоровой с соавт. [15, 16]. Определение содержания белка в изолированных митохондриях проводили по методу Брэдфорда. Потребление кислорода изолированными митохондриями регистрировали по-лярографически при помощи респирометра высокого разрешения Oxygraph-2k (Oroboros Instruments Австрия) в 2 мл среды инкубации (маннит — 210 мМ сахароза — 70 мМ; ЭГТА — 0,1 мМ; HEPES — 10 мМ рН=7,4) при постоянном перемешивании. Скорость потребления кислорода (О2) выражали в пикомолях (пмоль) за 1 с в расчете на 1 мг белка митохондрий.
Полученные результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M±SEM). Достоверность различий между экспериментальными группами определяли при помощи критерия Манна-Уитни в программе SigmaPlot 11.0 (США). Различия считали статистически значимыми при p<0,01.
Результаты
На первом этапе работы нами была выбрана и модифицирована методика моделирования хронической пренатальной гипоксии. Для нашего исследования была необходима методика, которая позволяла бы сохранять достаточную жизнеспособность беременных самок для проведения хронического эксперимента. При подборе протокола были протестированы варианты подъема на высоту 10 500, 9000 и 8000 м. На высоте 10 500 м время жизни колебалось от 2 до 10 мин, на высоте 9000 м — до 20 мин, на высоте 8000 м — около 120 мин. Поскольку для разработки релевантной модели гипоксическое воздействие должно быть максимально длительным, была выбрана высота, на которой самки сохраняли жизнеспособность в течение 2 ч.
Поскольку активное формирование синаптических контактов между нейронами начинается после формирования основных морфологических структур мозга в процессе эмбриогенеза, в качестве оптимального
1-я 2-я
неделя неделя
□□ интактные
I I хроническая гипоксия
Рис. 1. Динамика массы детенышей мышей линии C57BL/6, перенесших хроническую гипоксию, в течение первых 4 нед жизни
периода для начала моделирования хроническом гипоксии выбран 14-й день гестации, соответствующий третьему «триместру» беременности. Таким образом, протокол моделирования хронической пренатальной гипоксии предусматривал подъем беременных самок в вакуумной проточной барокамере на высоту 8000 м со скоростью 183 м/с на 2 ч ежедневно (начиная с 14-го дня гестации до наступления родов). Такая скорость подъема выбрана с целью получения выраженного гипоксического повреждения головного мозга. При подъеме с меньшей скоростью могут быть задействованы срочные адаптационные механизмы организма, чего в данной экспериментальной модели следовало избегать.
Для моделирования острой гипоксии выбран 18-й день гестации как один из критических периодов формирования головного мозга. Именно в этот период завершается процесс нейрогенеза и между зрелыми нейронами начинается активное формирование си-наптических контактов [17]. Поэтому для моделирования острой пренатальной гипоксии использовали режим подъема на 10 000 м со скоростью 175-183 м/с до первого агонального вздоха (4-5 мин) на 18-й день гестации.
Для оценки функционального состояния нервной системы животных в отдаленном периоде после хронической пренатальной гипоксии проводили определение неврологического статуса. При тестировании самок мышей, перенесших гипоксию, количество набранных ими баллов неврологического статуса полностью совпадало с баллами неврологического статуса интактных животных по обеим шкалам, следовательно, значимых нарушений состояния ЦНС не произошло.
В течение первых 4 нед жизни наблюдали динамику массы мышат (рис. 1). У детенышей, перенесших хроническую гипоксию, к 4-й неделе жизни наблюдается выраженная тенденция к увеличению их массы по сравнению с интактными животными. Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными о влиянии пренатальной гипоксии на склонность к метаболической дисрегуляции и ожирению [11, 18].
Для оценки когнитивных функций животных, перенесших хроническую пренатальную гипоксию, по достижении ими возраста одного месяца проводили тестирование в водном лабиринте Морриса. Анализ полученных данных показал формирование у мышей пространственной памяти. Установлено, что время нахождения платформы мышами обеих групп сокращалось с каждым последующим сеансом обучения, поиск цели становился направленным. При воспроизведении навыка на 7-й день отмечено, что более 50% животных интактной группы двигались непосредственно к цели (прямой поиск), в то время как в группе после «гипоксии» прямой поиск использовали лишь 33% животных, а 45% выбирали активный поиск цели. Таким образом, у животных, перенесших хроническую гипоксию, изменилась стратегия поиска цели (см. таблицу).
50
40
о4 30-
о 20-
10
0
Для оценки состояния долговременной памяти осуществлялся расчет отсроченного коэффициента сохранения (оКс) и дистанции, пройденной животными до достижения цели (рис. 2). По итогам теста наблюдалась тенденция к уменьшению этих показателей у группы животных с гипоксией, однако статистически значимых различий не выявлено. Коэффициент сохранения составил 37,5±7,5% у интактных животных и 31,8±5,4% — у животных, перенесших хроническую прена-тальную гипоксию. Длина трека животных составила от 8950 до 10200 см.
Таким образом, разработанные нами экспериментальные протоколы моделирования пренаталь-ной гипоксии прошли успешную верификацию, поскольку позволяют вызвать типичные для гипокси-ческого повреждения нарушения когнитивных функций в отдаленном периоде и метаболические изменения, ведущие к характерному для перенесших гипоксию детей ожирению, и тем самым исследовать различные аспекты нарушений, возникающих при прена-тальном гипоксическом стрессе, в том числе на клеточном и молекулярном уровнях.
Следующим этапом наших исследований явилась оценка функционального состояния дыхательной цепи митохондрий клеток головного мозга мышей на 1-е сутки постнатального развития, поскольку в последние годы показана особая роль митохондрий в адаптации организма к ги-поксическому повреждению [1921]. Установлено, что базальная скорость потребления кислорода при окислении субстратов глута-мата и малата у животных с пренатальной хронической гипоксией статистически значимо — на 45% — увеличивалась по сравнению с интактной группой (2796,4± 366,5 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка) и составила 4053,88± 582,10 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка (рис. 3, а). Интенсивность окислительного фосфорилирова-ния в экспериментальной группе (16 016,38±1196,90 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка) возрастала на 45% относительно интактных значений
Стратегия поиска цели у животных при тестировании в водном лабиринте Морриса, %
Животные Прямой Активный Хаотический
поиск поиск поиск
Интактные 55 27 18
Хроническая гипоксия 33 45 22
Интактные Хроническая гипоксия
15 000-,
s
о
к 10 000-1
и ^
н а т с
и ^
0
5000
Интактные Хроническая гипоксия
б
Рис. 2. Оценка показателей у мышей после тестирования в водном лабиринте Морриса:
а — отсроченный коэффициент сохранения (оКс); б — дистанция, пройденная животным до достижения цели
а 5000
* 4500
ю 4000
É 3500
^ 3000 а
^ 2500 1 2000 1500 1 1000 1 500 с_ 0
.с
о
Интактные Хроническая гипоксия
а к 14000
л е 12000
ю
О м 10000
е
и н а 8000
е н
лб л) 6000
е 5
тр о Г 4000
л о 2000
м
п 0
Интактные Хроническая гипоксия
g 20000 S 18000 ^ 16000 ^ 14000 го 12000 ~10000 ^ 8000 6000 4000 2000 0
g 1000
J 900 ^ 800
- 700
j) 600
I 500
400
300
200
100
0
Интактные Хроническая гипоксия
Интактные Хроническая гипоксия
Рис. 3. Состояние дыхательной цепи митохондрий клеток головного мозга новорожденных мышат линии C57BL/6 после хронической пренатальной гипоксии:
а — базальная скорость потребления кислорода митохондриями на фоне избытка субстратов глутамата и малата; б — окислительное фосфорилирование дыхательной цепи митохондрий; в — сукцинатзависимый путь окисления субстратов (активная работа II комплекса дыхательной цепи митохондрий при окислении сукцината); г — ротенонзависимое ингибирование I комплекса дыхательной цепи митохондрий; * — статистически значимые отличия от показателей интактной группы; р<0,01; критерий Манна-Уитни
а
б
а
в
г
2500
с; го
о ф
£ 2
о ^
со
2000
1500
1000
500
Интактные
ВЕ
Острая гипоксия
16000 14000
го 12000 6 1 10000
§ 2
8000 6000 4000 2000 0
--
*
Интактные
Острая гипоксия
2500
„-.ю 2000
О
1 го 1500
ф X
£ 1 1000 н 6
О
С | 500
шт
Интактные
Острая гипоксия
с; го
с -о .
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
Интактные
Острая гипоксия
0
б
а
0
в
г
Рис. 4. Показатели состояния дыхательной цепи митохондрий клеток головного мозга новорожденных мышат линии C57BL/6 после эпизода острой прена-тальной гипоксии: а — базальная скорость потребления кислорода митохондриями на фоне избытка субстратов глутама-та и малата; б — окислительное фосфорилирование дыхательной цепи митохондрий; в — ротенонза-висимое ингибирование I комплекса дыхательной цепи митохондрий; г — сукцинатзависимый путь окисления субстратов, острая гипоксия (активная работа II комплекса дыхательной цепи митохондрий при окислении сукцината); * — статистически значимые отличия от показателей интактной группы; р<0,01; критерий Манна-Уитни
(11 053,3±3112,0 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка) (рис. 3, б). Также отмечался рост активности II комплекса дыхательной цепи, при котором показатели у экспериментальных животных (10 907,80±884,67 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка) были в 1,4 раза выше, чем в интактной группе (7796,4±756,8 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка) (рис. 3, в). При ингибировании НАДН-дегидрогеназы ротеноном не получено статистически значимых отличий между интактной и экспериментальной группами (рис. 3, г).
При исследовании функционального состояния митохондрий головного мозга у новорожденных животных линии С57В^6 после моделирования острой пренатальной гипоксии зарегистрировано значительное (в 2 раза) снижение базальной скорости потребления кислорода митохондриями, при этом значения у экспериментальных животных составили 962,16±57,70 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка, а значения в интактной группе — 2225,6±80,2 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка (рис. 4, а). Активность окислительного фосфо-рилирования (рис. 4, б) после перенесенного эпизода острой пренатальной гипоксии снизилась в 5,1 раза по сравнению с интактными показателями (2514,6±433,4 и 12 872,8±708,7 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка соответственно).
Интересно отметить, что на фоне значительного снижения общей функциональной активности митохондрий после моделирования острой гипоксии наблюдалось значительное увеличение скорости при ротенонзависимом ингибировании I комплекса дыха-
тельной цепи митохондрий — значения у животных с гипоксией составили 2339,1±13,2 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка, что в 6,5 раз выше интактных значений — 361,3±37,0 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка (рис. 4, в). При стимулировании II комплекса дыхательной цепи митохондрий сукцинатом значения в экспериментальной группе составили 8860,7±221,9 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка, что в 1,6 раза выше интактных — 7609,5±230,1 пмоль/(с-мл) на 1 мг белка (рис. 4, г).
Обсуждение
Хроническая пренатальная гипоксия является наиболее тяжелой формой гипоксии, развивающейся в процессе беременности. В результате нее происходит активация анаэробного гликолиза. Недостаточное снабжение организма кислородом приводит к перераспределению кровообращения с преимущественным кровоснабжением жизненно важных органов. Вследствие централизации кровообращения происходит ацидоз, сопровождающийся резким повышением уровня лактата в крови, что приводит к увеличению проницаемости сосудистой стенки и далее — к образованию внутрисосудистых тромбов. В результате этих и иных патологических процессов возникает тяжелое поражение головного мозга, последствия которого могут проявляться и в отдаленном постги-поксическом периоде в виде различных нарушений физиологических, когнитивных функций, процессов обучения и памяти [10].
Исследование когнитивных функций животных с хронической пренатальной гипоксией в отдаленном периоде путем оценки долговременной памяти с помощью тестирования в водном лабиринте Морриса показало, что со временем изменяется стратегия поиска цели и доля времени пребывания животного в зоне, где находилась платформа, т.е. нарушаются процессы формирования и воспроизведения долговременной памяти.
Поскольку выраженных нарушений общего состояния ЦНС при определении неврологического статуса не выявлено, можно предположить, что нарушения в поведении животных, подвергавшихся хронической пренатальной гипоксии, не обусловлены грубыми структурными повреждениями головного мозга. Скорее всего, они могут быть связаны с разнообразными нейрохимическими нарушениями [22].
Большой интерес представляют данные, полученные при изучении митохондриального дыхания. Обращают на себя внимание разнонаправленные изменения скорости базального потребления кислорода митохондриями и окислительного фосфорилирования при моделировании острой и хронической гипоксии.
Известно, что ответ организма на гипоксию включает различные адаптивные реакции, способствующие устранению функционально-метаболических нарушений, типичных для этого состояния и направленных прежде всего на сохранение функции митохондрий. При этом используются 2 типа механизмов: а) срочный компенсаторный, цель которого — предотвращение последствий острой гипоксии и быстрое восстановление в постгипоксический период; б) долгосрочные механизмы адаптации к гипоксии, которые формируются в течение более длительного периода и способствуют увеличению неспецифической резистентности к дефициту кислорода [19].
Можно предположить, что процессы усиления ми-тохондриального дыхания при хронической гипоксии связаны с этими долгосрочными механизмами адаптации.
Острое гипоксическое повреждение приводит к активации II дыхательного комплекса, что согласуется с ранее полученными результатами при моделировании гипоксии в постнатальный период [23]. Особый интерес представляют данные по долговременной адаптации митохондриального аппарата, которые могут быть связаны с синтезом большего количества белков дыхательной цепи и ядерной регуляцией митохондри-ального генома [20].
Заключение
Исследование особенностей функционирования митохондрий головного мозга новорожденных мышат после перенесенной пренатальной гипоксии показало, что эпизод острой пренатальной гипоксии снижает базальную скорость потребления кислорода митохондриями и угнетает окислительное фосфорилирова-
ние, в то же время хроническая гипоксия приводит к адаптации митохондриального аппарата, проявляющейся в интенсификации окислительного фосфори-лирования. Таким образом, разработанные протоколы экспериментального моделирования пренатальной гипоксии позволили выявить особенности адаптации митохондриального аппарата нервных клеток к разным типам гипоксического повреждения.
Финансирование исследования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект 18-75-10071) в части разработки протоколов пренатальной гипоксии и при поддержке государственного задания (проекты 17.3335.2017/ПЧ и 6.6379.2017/БЧ) в части исследования функциональной активности митохондрий.
Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.
Литература/References
1. Ferriero D.M. Neonatal brain injury. N Engl J Med 2004; 351(19): 1985-1995.
2. Семина В.И., Степанова Ю.А. Перинатальная гипоксия: патогенетические аспекты и подходы к диагностике (обзор литературы). Часть I. Медицинская визуализация 2015; 2: 95-105. Semina V.I., Stepanova Y.A. Perinatal hypoxia: pathogenetic aspects and approaches to diagnostics (review of literature). Part I. Meditsinskaya vizualizatsiya 2015; 2: 95-105.
3. Козлова Е.М. Особенности позднего неонатального периода у новорожденных, перенесших тяжелую перинатальную гипоксию. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Н. Новгород; 2009. Kozlova E.M. Osobennosti pozdnego neonatal'nogo perioda u novorozhdennykh, perenesshikh tyazheluyu perinatal'nuyu gipoksiyu. Avtoref. dis. ... kand. med. nauk [Features of the late neonatal period in newborns suffered severe perinatal hypoxia. PhD Thesis]. Nizhny Novgorod; 2009.
4. Kassil' V.G., Otellin V.A., Khozhai L.I., Kostkin V.B. Critical phases of the brain development. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова 2000; 86(11): 1418-1425. Kassil' V.G., Otellin V.A., Khozhai L.I., Kostkin V.B. Critical phases of the brain development. Rossiiskii fiziologicheskii zhurnal im. I.M. Sechenova 2000; 86(11): 1418-1425.
5. Отеллин В.А., Хожай Л.И., Ватаева Л.А. Влияние гипоксии в раннем пренатальном онтогенезе на поведение и структурные характеристики головного мозга. Журнал эволюционной биохимии и физиологии 2012; 48(5): 467473. Otellin V.A., Khozhai L.I., Vataeva L.A. Effect of hypoxia in early perinatal ontogenesis on behavior and structural characteristics of the rat brain. Zhurnal evolyutsionnoy biokhimii i fiziologii 2012; 48(5): 467-473.
6. Golan H., Huleihel M. The effect of prenatal hypoxia on brain development: short- and long-term consequences demonstrated in rodent models. Dev Sci 2006; 9(4): 338-349, https://doi.org/10.1111/j.1467-7687.2006.00498.x.
7. Tyul'kova E.I., Semenov D.G., Vataeva L.A., Belyakov A.V., Samoilov M.O. Effect of prenatal hypobaric hypoxia on glutamatergic signal transduction in rat brain. Bull
экспериментальные исследования
Exp Biol Med 2011; 151(3): 275-277, https://doi.org/10.1007/ s10517-011-1307-y.
8. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons. Physiol Rev 1999; 79(4): 1431-1568, https://doi.org/10.1152/physrev. 1999.79.4.1431.
9. Rybnikova E., Gluschenko T., Tulkova E., Churilova A., Jaroshevich O., Baranova K., Samoilov M. Preconditioning induces prolonged expression of transcription factors pCREB and NF-kappa B in the neocortex of rats before and following severe hypobaric hypoxia. J Neurochem 2008; 106(3): 14501458, https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2008.05516.x.
10. Bourque S.L., Gragasin F.S., Quon A.L., Mansour Y., Morton J.S., Davidge S.T. Prenatal hypoxia causes long-term alterations in vascular endothelin-1 function in aged male, but not female, offspring. Hypertension 2014; 62(4): 753-758, https://doi.org/10.1161/hypertensionaha.113.01516.
11. Chen L., Zadi Z.H., Zhang J., Scharf S.M., Pae E.K. Intermittent hypoxia in utero damages postnatal growth and cardiovascular function in rats. J Appl Physiol 2018; 124(4): 821-830, https://doi.org/10.1152/japplphysiol.01066.2016.
12. Golan M.H., Mane R., Molczadzki G., Zuckerman M., Kaplan-Louson V., Huleihel M., Perez-Polo J.R. Impaired migration signaling in the hippocampus following prenatal hypoxia. Neuropharmacology 2009; 57(5-6): 511-522, https:// doi.org/10.1016/j.neuropharm.2009.07.028.
13. Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods 1984; 11(1): 47-60, https://doi.org/10.1016/0165-0270(84)90007-4.
14. Frick K.M., Stillner E.T., Berger-Sweeney J. Mice are not little rats. NeuroReport 2000; 11(16): 3461-3465, https:// doi.org/10.1097/00001756-200011090-00013.
15. Егорова М.В., Афанасьев С.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: современные методические приемы. Сибирский медицинский журнал 2011; 26(1-1): 22-28. Egorova M.V., Afanasyev S.A. Isolation of mitochondria from cells and tissues of animals and human: modern methodical approaches. Sibirskiy meditsinskiy zhurnal 2011; 26(1-1): 22-28.
16. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Миронов А.А., Са-харнова Т.А., Пимашкин А.С., Бобров М.Ю., Хаспеков Л.Г.,
Мухина И.В. Нейропротекторное действие каннабиноида N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипобарической гипоксии мозга. Неврологический вестник им. Бехтерева 2012; 44(1): 14-19. Mitroshina E.V., Vedunova M.V., Mironov A.A., Saharnova T.A., Pimashkin A.S., Bobrov M.Y., Khaspeckov L.G., Mukhin I.V. Neuroprotective effect of endacannabinoid N-arachidonoyldopamine in acute hypobaric hypoxia. Nevrologicheskiy vestnik im. Bekhtereva 2012; 44(1): 14-19.
17. Rueda-Clausen C.F., Stanley J.L., Thambiraj D.F., Poudel R., Davidge S.T., Baker P.N. Effect of prenatal hypoxia in transgenic mouse models of preeclampsia and fetal growth restriction. Reprod Sci 2014; 21(4): 492-502, https://doi. org/10.1177/1933719113503401.
18. Khalyfa A., Cortese R., Qiao Z., Ye H., Bao R., Andrade J., Gozal D. Late gestational intermittent hypoxia induces metabolic and epigenetic changes in male adult offspring mice. J Physiol 2017; 595(8): 2551-2568, https://doi. org/10.1113/jp273570.
19. Лукьянова Л.Д. Сигнальная роль митохондрий при адаптации к гипоксии. Фiзiологiчний журнал 2013; 59: 141-154. Luk'yanova L.D. Signaling role of mitochondria in adapting to hypoxia. Fiziologichniy zhurnal 2013; 59: 141-154.
20. Wheaton W.W., Chandel N.S. Hypoxia. 2. Hypoxia regulates cellular metabolism. Am J Physiol Cell Physiol 2011; 300(3): 385-393, https://doi.org/10.1152/ajpcell.00485.2010.
21. Kristian T. Metabolic stages, mitochondria and calcium in hypoxic/ischemic brain damage. Cell Calcium 2004; 36(3-4): 221-0233, https://doi.org/10.1016/j.ceca.2004.02.016.
22. Perrin D., Mamet J., Scarna H., Roux J.C., Berod A., Dalmaz Y. Long-term prenatal hypoxia alters maturation of brain catecholaminergic systems and motor behavior in rats. Synapse 2004; 54(2): 92-101, https://doi.org/10.1002/syn.20065.
23. Astrakhanova Т.А., Urazov МБ., Usenko A.V., Mitroshina E.V., Mishchenko Т.А., Schelchkova N.A., Vedunova М^. BDNF-mediated regulation of the brain mitochondria functional state in hypoxia. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(3): 88-94, https://doi.org/10. 17691/stm2018.10.3.10.
