CC BY
64
УДК 612.398.1:547.964.4 Вестник СПбГу Сер 3> 20()4> вып 4
А. Л. Мальцева, Г М. Алешина, В. Н. Кокряков, Е. Г. Краснодембский, Т. В. Овчинникова НОВЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ
*ИЗ ЦЕЛОМОЦИТОВ МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ ASTERIAS RUBENS L.
Введение. Все многоклеточные животные имеют более или менее сложно устроенные общие для организма межклеточные структуры, через которые, в частности, идет диффузный транспорт кислорода, минеральных и питательных веществ. Данные структуры могли бы представлять собой удобный субстрат для бактериального роста (в случае преодоления инвазионным началом эпителиального барьера). Проникновение во внутреннюю среду организма тем легче, чем меньше размеры потенциальных патогенов. Оно тем опаснее для организма-хозяина, чем активнее проникающие патогены способны расти и размножаться в его внутренней среде, не подчиняясь регуляторным сигналам, в нее поступающим, исчерпывая ее питательные возможности, меняя минеральный баланс в ней, нарушая регуляторную целостность и интегральность управления в организме.
Живые системы - это системы открытые. В силу разных причин, в том числе и функциональной необходимости, внутренняя среда не может быть абсолютно изолирована от среды, окружающей организм: должны осуществляться потоки вещества и энергии. Кроме того, изолирующие свойства эпителиев могут нарушаться в результате травмирующего воздействия из внешней среды, т. е. организм не всегда оказывается компетентным в предотвращении соприкосновения патогенного начала с резервами своей внутренней среды, . .,
Способность быстро (желательно, за время одного клеточного цикла) сопротивляться активно развивающейся микробной агрессии является жизненной необходимостью для лю--бого многоклеточного организма.
Для морских животных проблема регулирования своих взаимоотношений с окружающей микробиотой стоит более остро, чем для наземных: морская вода в гораздо большей степени насыщена микроорганизмами, чем воздух (в среднем 1 мл морской воды содержит 10 вирусных частиц, 106 клеток бактерий, 103 клеток низших грибов [52]). Кроме того, организму необходимо контролировать численность микроорганизмов, находящихся с ним в постоянном контакте, - микробных симбионтов, населяющих пищеварительный тракт и поверхность покровов. Присутствие и первых, и вторых симбионтов было показано для иглокожих: кишечные эндосимбионты исследовались, главным образом, у морских ежей 118, 26, 51 и др.]. Субкутикулярные бактерии, обитающие в толще кутикулы были описаны у представителей всех классов иглокожих [32, 37, 45, 59 и др.], в частности' такие описания были сделаны и для Asterias rubens [7].
Систему антимикробной защиты могут составлять факторы как быстрого так и медленного реагирования, присутствующие постоянно или появляющиеся индуцибельно эф-фекторного или регуляторного действия [24, 27, 55, 64]. В зависимости от степени сложности организации такой системы она способна принимать на себя целый ряд дополнительных функций, которые могут касаться не только непосредственной защиты организма но и общего его регулирования. Одна из важнейших молекулярных составляющих защитной системы немедленного реагирования - это антимикробные пептиды (АП), которые являются предметом настоящего исследования. Пептидов с антимикробной активностью известно довольно много (более 800 различных молекул), выделенных из самых различных живых
*Ра^"0ДДержана INTAS ^ант 03-51-4984), Министерством образования РФ (гоант «Унивепситетм России» 07.01.030) и РФИИ (фант№ 03-04-49349). Н 1фант «Университеты
О А. Л. Мальцева, Г М. Алешина, В. Н. Кокряков, Е. Г. Краснодембский, Т. В. Овчинникова, 2004 .
г
организмов: одноклеточных и многоклеточных, растений и животных, позвоночных и беспозвоночных (см.: http://www.bbcm.univ.trestie.it/~tossi/antimic.html).
Наличие антимикробной активности у иглокожих было показано в связи с различными тканями и органами, в том числе и целомической жидкостью [14, 30, 62 и др.]. Антимикробная активность была описана и в целомической жидкости морской звезды Asterias rubens [1, 30, 35]. Из факторов, ее обусловливающих, были идентифицированы лишь лизо-цим (в плазме целомической жидкости и целомоцитах, масса 15,5±1 кДа) [35] и антимикробный пептид (в целомоцитах, масса 4±1 кДа) [1]. Однако, согласно многим наблюдениям, обычным является присутствие в одном организме 15-40 различных антимикробных пептидов [10]. Поэтому нами и было предпринято более подробное исследование присутствия антимикробных пептидов в целомоцитах морской звезды Asterias rubens.
Материалы и методы. Морские звезды Asterias rubens были собраны в августе 2002 и 2003 гг. в окрестностях МБС СПбГУ (губа Лебяжья). Животные содержались в садках на глубине 1,5 м до момента использования.
Сбор целомической жидкости (ЦЖ) проводился путем удаления кончика луча. ЦЖ сцеживалась в сосуды, содержащие 30 мМ ЭДТА (для предотвращения коагуляции). Непосредственно после сцеживания ЦЖ центрифугировалась (1,5 тыс. об. / мин, 15 мин), после чего надосадочная жидкость удалялась, осажденные целомоциты заливались !5%-ной уксусной кислотой для экстракции. Экстракт отделялся от клетпк центрифугированием (20 ООО g, 40 мин) и был фракционирован в камере для ультрафильтрации (объем 50 мл) «Amicon» через фильтры с фиксированным диаметром пор (последовательно 10 и 1 кДа) под давлением 4 атм.
Часть экстракта, содержания молекулы массой от 1 до 10 кДа, была подвергнута препаративному электрофорезу в кислой буферной системе (5%-ная уксусная кислота) в присутствии мочевины [29]. Электрофорез проводился на установке «BioRad» (модель «AG501-X8») в 12,5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ).
Компоненты активных фракций разделялись с помощью обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на установке «Beckman Gold HPLC System» в градиенте ацетонитрила (подкисленного 0,1%-ной трифторуксусной кислотой) 0-60% или 15-45% за 60 мин. Для хроматографии использовались колонки С 8 и С 18 «Altech», С 18 «Vydac».
Состав фракций анализировался методом электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины (КФ) [48] в 12,5%-ном ПААГ и методом диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия [53] в ПААГ (3%-ный концентрирующий гель, 10%-ный разделяющий гель). Электрофорез проводился на приборе фирмы «Hoefer P.B. Inc.» (USA).
Определение массы пептидов в пробах производилось с использованием время пролетного масс-спектрометра (MALDI-TOF: matrix assisted laser desorption/ionization - time of flight, прибор «Voyager-DE, Perseptive Biosystem Inc.» (Framingham AM, USA)). Ионизация тестируемых молекул осуществляется посредством лазерной десорбции с матрицы (а-циано-4-гидрокси-циннамовая кислота (Sigma)) с источником ионов замедленной экстракции в линейном режиме.
Изучение антимикробной активности проводилось методом наложения геля или методом радиальной диффузии [42]. Для антимикробного теста использовались два вида бактерий: Escherichia coli, штамм D31 (грамм-отрицательная бактерия); Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамм-положительная бактерия).
• Для определения первичной структуры пептиды переносились из ПААГ на PVDF-мембрану. Перенос осуществлялся на приборе «Pharmacia Biotech», модель «TEG2» («Hoefer P.B. Inc., USA»), в буфере pH 8,23 (12,5 мМ Трис (Sigma), 9,6 мМ трицин (Sigma), 10%-ный метанол). Частичное секвенирование пептидов, нанесенных на PVDF-мембрану, осуществлялось в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (г. Москва) на секвенаторе «491 Precise» (Applied Biosystem, USA).
Результаты исследований и их обсуждение. Целомоциты иглокожих - это клетки, на которые возложена функция реализации защитных реакций, таких как фагоцитоз, инкапсуляция, гемостаз, продукция регуляторных и эффекторных молекул. Разнообразие клеток, объединяемых термином целомоциты, может довольно сильно варьировать у различных представителей иглокожих и по-разному классифицироваться авторами [12, 13, 43, 63 и др.]. Однако для абсолютно всех описанных случаев постоянным является присутствие такого типа клеток, как амебоциты. У морских звезд этот клеточный тип явно доминирует по численности, маскируя присутствие клеток других типов (клеток других типов не более 15% от общего числа целомоцитов) [3]. Наши собственные наблюдения за свежими и фикси- ' рованными мазками целомической жидкости морской звезды Asterias rubens полностью согласуются с этими данными. Таким образом, экстракты, которые исследовались на предмет присутствия антимикробных веществ, были получены, главным образом, из амебоци-
тов. Важно отметить, что представители этого клеточного типа являются основными исполнителями всех защитных реакций. Именно амебоциты (и только они из всех целомоци-тов) способны к фагоцитозу, вовлекаясь также в процессы инкапсуляции и гемостаза [ 12,
Экстракт, полученный из целомоцитов, был. разделен на высоко- и низкомолекуляр-
3 ГТН°СТаВШИеСЯ НаД Ф,ИЛЬТР°М ШкДа ИЛИ над Фетром 1 кДа соответственно (Иг ' антимикР°бной активности выявлялось в обеих полученных фракциях
нГ™ ^ °6ШИ?Н0СТЬ зон лизиса Убывает на присутствие нескольких активных компонентов и в первой и во второй частях экстракта. Активность части экстракта, оставшейся над фильтром 10 кДа в процессе ультрафильтрации, может быть объяснена, во-первых неполнотой разделения т е. присутствием оставшихся низкомолекулярных компонентов,'что
ГимиНкпп^ТФ0РеГРаММе (РИС- И' BO"BTOpbIX' пРисУтствием высокомолекулярных антимикробных компонентов, в частности лизоцима. Лизоцим A. rubens был. описан его
молекулярная масса составляет 15,5±1 кДа [35]. Массе 15,5 кДа на электрофореграмме высокомолекулярной части экстракта соответствует четкая полоса (рис. 1, А),
©О -у-V . ■ '* . "г 0 €>
Л,»/ f ' ' X . i, ?• К KA . : . -
•w^fcifík; щт;?.-
■^mméi
Рис.■ / Высокомолекулярная (Пи низкомолекулярная (2) части экстракта и дефенсин кролика NP2 (3) А - электрофореграмма в ПААГ в присутствии додецилсульфага натрия Пообы 1 Г?ТГ к -таны меркаптоэтанолом. Стрелкой обозначена полоса, соо^^ствующГмасГ?5 5 кЛа Б Í7JZ7 Р ма в ПААГ в кислой буферной си^ме; В - результатЛнтимикроб^Ге'а прой f «¿одТн^ния' геля после электрофореза в кислой буферной системе Р методом наложения
Г •
1П Ппос;ле Руления низкомолекулярной части экстракта (содержащей молекулы от 1 до ЮкДа) путем препаративного электрофореза антибактери^ьная ак^внос^ь наблюла лась в широком спектре фракций (рис. 2). Это, как и результаты исследования^ антиба^еои альной активности исходной части экстракта, указывает на присуг^Тз^^' скольких молекул с антимикробной активностью. Для идентификации антибаЗ^ьных начал активные фракции подверглись нескольким последоват1ь„Г(с пони^ие™
тизны градиента) ОФ ВЭЖХ разделениям до получения гомогенных по составу фракций. В результате анализа полученных данных о массах молекулярных компонентов активных фракций как действующие антибактериальные начала были идентифицированы следующие пептиды: 2020, 2237,2367,2602,2728,4159 Да. Важно отметить, что эти молекулы не могут объяснить всей наблюдающейся активности, а это дает возможность предполагать, что разнообразие антимикробных молекул в экстрактах несколько выше.
Рис. 2. Результат антимикробного теста против Е. coli методом радиальной диффузии после препаративного электрофореза низкомолекулярных частей экстрактов, полученных в 2002 (А) и 2003 (Б) гг.
Присутствие нескольких различных АП в клетках, вовлеченных в защитные реакции, является обычным и для позвоночных, и для беспозвоночных животных. Так, в нейтрофи-лах кролика было описано 6 различных дефенсинов, человека - 4, кур - 3, крупного рогатого скота - 13 [2, 55]. В гемоцитах мидии (Mytilus galloprovincialis) идентифицировано 8 различных АП (MGD 1,2; mytilins В, С, D, Gl; myticins А, В) [46, 47], в гемоцитах мечехвоста (Tachypleus tridentatus) - 5 (big defensin, tachystatins А, В, С; tachycitin) [33], в гемоцитах асцидии (Styela clava) - 8 (styelins А, В, Су D, Е, F; clavanins А, В) [54, 60]. Для объяснения такого многообразия существует несколько предположений. Во-первых, присутствие многих АП может компенсировать ограниченность спектра активности каждой конкретной молекулы. Во-вторых, между разными молекулами при проявлении антимикробной активности возможна синергия [55].
Из идентифицированных пептидов практически все выделены впервые. Исключением является-пептид 4159 Да. Он может представлять собой описанный ранее антимикробный пептид массой 4000± 1000 Да [ 1 ].
Для пептида 2237 Да была получена частичная аминокислотная последовательность. Такой массе соответствует молекула приблизительно из 20 аминокислот, из них определены были только первые 11. Сравнительный анализ последовательности указанных 11 аминокислот выявил 100%-ную гомологию этой молекулы с частью молекулы актина морской-звезды Pisaster ochraceous. На основании 100%-ного сходства была восстановлена полная аминокислотная последовательность пептида с массой 2237±20 Да (по базе данных: http://www.ncbi.nlm.nih.gov):, .
Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro Ser lie Val Gly Arg Pro Arg His Glm Gly Val Met Val Gly.
В составе молекулы 21 аминокислота, теоретическая масса такой молекулы составляет 2232 Да (что близко к полученной с помощью масс-спектрометра). В молекуле содержатся 3 аргинина и 1 гистидин, это значит, что суммарный заряд молекулы при физиологических значениях рН составляет приблизительно +4. Катионность - одно из определяющих свойств молекул с антимикробной активностью, играющее важную роль в избирательности действия на бактериальные мембраны. 12 других аминокислот являются гидрофобными (это приблизительно 55% от общего числа аминокислот). Высокое содержание гидрофобных аминокислот - еще одна важная характеристика всех АП (обычно их более 50%), определяющая возможность взаимодействия этих молекул с клеточной мембраной [5, 28, 56].
Согласно последовательности актина, следующей после глицина (последней аминокислоты в пептиде 2232 Да) является метионин'. При добавлении его к молекуле пептида 2232 Да получается молекула массой 2363 Да, которая напоминает массу одного из выделенных пептидов с антимикробной активностью 2367 Да, что предполагает и для этого пептида возможность происхождения от актина.
Наличие антимикробной активности у появляющихся в результате протеолитическо-го расщепления частей более крупных молекул было многократно описано [8, 9, 55, 61, 64]. Функции, которым служат исходные крупные молекулы, могут быть самыми разнообразными, в том числе и защитными. Например, лактоферрины (масса около 80 кДа) сами обладают сильной антимикробной активностью [44]. Было показано, что в желудке человека под действием пептидаз от лактоферрина могут отщепляться участки молекулы, также обладающие антимикробной активностью, названные лактоферрицинами [40]. Аналогичным образом могут появляться АП при расщеплении в желудке а-казеина (из коровьего молока) - казоцидины [65]. В желудке клещей АП могут образовываться из гемоглобина бычьей крови [22]. Наибольшее число производных с антимикробной активностью известно для гистонов. Гистоны и сами по себе (без протеолитического расщепления) обладают антимикробной активностью, описанной еще в начале XX в. [50]. В частности, целый гистон Н2А был выделен из кожных секретов радужной форели Oncorhynchus mykiis [21]. Также и низкомолекулярные производные гистонов, проявляющие антимикробную активность, были выделены из различных животных. Под действием пепсина из гистона Н2А образуется АП в пищеварительной системе азиатской жабы (род Bufo, поэтому получающийся пептид был назван буфорином) [38]. Помимо упомянутого буфорина, известны другие фрагменты N-конца гистона Н2А с антимикробной активностью: паразин из покровных эпителиальных слоев амурского сома Parasilurus asotus [49] или гиппозин из покровной слизи обыкновенного палтуса Hippoglossus hippoglossus [8]. Во всех упомянутых случаях АП образуются в то время и в том месте, где проявляется их активность. Появление обладающих антимикробной активностью производных гистонов в поверхностной слизи может быть объяснено разрушением эпителиальных клеток. Однако известны два производных гистона Н1А (6,2 и 7,5 кДа), проявляющие сильную антимикробную активность, которые были выделены' из активированных гранулоцитов человека [61]. Вопросы о том, почему эти производные появляются в активированных гранулоцитах, в каком клеточном компартменте они располагаются, какие функции выполняют в данных клетках или каким образом эти молекулы могут быть вовлечены в реализацию защитных функций данных клеток, до сих пор не имеют ответа.
Подобным же образом довольно сложно объяснить функционирование фрагмента актина в целомоцитах морской звезды. Легче предположить, как мог бы этот фрагмент появиться в клетках. Для амебоцитов иглокожих выделяют два основных физиологических состояния: петалоидное и филоподиальное, которые четко различаются морфологически [6, 23, 31, 34, 63 и др.]. Амебоциты в петалоидном состоянии называются активной формой фагоцитов [39], так как именно в таком состоянии эти клетки способны наиболее активно
фагоцитировать инородные частицы [3, 63]. Филоподиальные амебоциты способны к активной агрегации, что при нарушении гомеостаза обеспечивает реакции гемостаза и изоляции [11, 36 и др.]. Трансформация амебоцитов из одного состояния в другое сопровождается быстрой перестройкой актинового цитоскелета [19, 20].
Было показано, что даже на небольшое раздражение (такое, как укол иглой в пери-стомальное поле) целомоциты морского ежа Strongylocentrotus purpuratus могут отвечать активацией экспрессии гена SpCoell. Этот ген кодирует белок, обладающий высокой структурной гомологией с профилином позвоночных [57]. Профилины - это группа актин-связывающих белков, участвующих в проведении сигнала и трансформации цитоскелета [41]. Также было описано, что ген SpCoell активируется при введении в целом LPS [58]. Таким образом, в активацию амебоцитов иглокожих - клеток, участвующих во всех защитных реакциях организма (которые развиваются в ответ на нарушение целостности стенки тела и/или проникновение инфекционного начала в полость целома), - вовлечена трансформация актинового цитоскелета.
Сцеживание целомической жидкости из животного приводит к инициации гемоста-тической реакции (сворачивание целомической жидкости - стереотипный защитный ответ, наблюдающийся при контакте ее с внешней средой [4]). Гемостаз иглокожих начинается переходом амебоцитов в филоподиальную стадию [4, 16]. При этом в клетках в ходе трансформации актинового цитоскелета, вероятно, могут появляться продукты протеолитическо-го расщепления актина. Однако дальнейшая судьба образовавшихся фрагментов остается неясной. Самый простой путь соприкосновения подобных молеку i, образующихся в цитоплазме, с микробным началом - разрушение клеток, например, на поверхности образовавшегося в ходе гемостатической реакции клеточного сгустка. Для того, чтобы предполагать возможность вовлечения таких, молекул в процессы фагоцитоза или экзоцитоза, пока нет фактических оснований,. Также и вопрос об использовании организмом таких молекул (фрагмента актина, в частности) остается открытым и требует дальнейших исследований.
Авторы выражают глубокую благодарность В, А.Поповой и И. А. Тверьяновичу, сотрудникам ООО ЦКП «Аналитическая спектрометрия», за предоставленную возможность использования времяпролетного масс-спектрометра в ходе нашего исследования.
Summary
MaltsevaA. L„ AleshinaC. M., Kokryakov V. N.. Krasnodembskiy E. G., Ovchinnikova T. V. New antimicrobial peptides from coelomocytes of sea star Asterias rubens L.
The extracts from coelomocytes of sea star Asterias rubens were shown to contain a greater variety of antimicrobial peptides than it had been known before. Several new peptides were described: 2020, 2237, 2367, 2602, 2728 Da Amino acid sequence allows drawing a conclusion that one of the identified peptides (mass 2231 Da) originates from N-term of cytoplasmic actin after proteolytic cleavage.
Литература
1. Алешина Г. M, Мирончик E. В.. Мальцева А. Л.. Клушевская Е. С., Краснодембский Е. Г., Кокряков В. Н. Антимикробные пептиды из морской звезды Asterias rubens II Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 4. С. 135137. 2. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 3. Коренбаум Е. С., Воробьев В. А. Клетки целомической жидкости морской звезды // Биология моря. 1988. № 1. С. 27-33. 4. Подгорная О. И., Исаева В. В. Защитные функции целомоцитов и иммунитет иглокожих // Биология моря. 1989. №6. С. 3-14.
5. Anderson M, ZasloffM. Antimicrobial peptides: complementing classical inflammatory mechanisms of defense «Inflammation: basic principles and clinical correlates» / Ed. by J. I. Gallin and ' R. Snyderman. 3rt ed. 1999.
6. Andrew W. Cells of the blood and coelomic fluid of Tunicates and Echinoderms // Americ. Zoologist. 1962. Vol. 2, N 2. P. 285-297. 7. Bargmann W., von HarnackM., Jacob K. Uber den Feibau des Nervensistems des Seesternes {Asterias rubens L.). 1. Mitteilung. Ein Beitrag zur vergleichenden Morphologie der Glia IIZ. Zellforsch. 1962. Vol. 56. S. 573-594. 8. Birkemo G. A., Luders T., Andersen O., Ingolfl. F., Nissen-Meyer J. Hipposin, a histone-derived antimicribial peptide in Atlantic halibut (Hippoglossus hippiglossus L.) // Biochim. Biophys. Acta. 2003. N 1646. P. 207-215. 9. BomanH. G.
Innate immunity and normal microflora // Immunological Rev. 2000. Vol. 173. P. 5-16. 10.BomanH. G. Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts // J. Internal. Med. 2003. Vol. 254. P. 197-215.11. Boolotian R. A., Gies A. C. Coelomic corpuscles of chinoderms II Biol. Bull. 1958. Vol. 115. P. 53-63. 12.Brown A. C. The elimination of foreign particles injected into the coelom of holothurian Cucumaria stefensoni II Zool. Afr. 1967. Vol. 3, N 1. P. 1-3. 13. Burton M. P. M. Echinoid coelomic cells // Nature. 1966. Vol. 211. P. 1095-1096. 14. Canicatt C. Lysosomal enzyme pattern in Holothuria polii II J. Inv. Pathol. 1990. Vol. 56. P. 70-74. 15. Canicatti C„ D'AnconaG. Cellular aspects of Holothuria polii immune response//J. Inv. Pathol. 1989. Vol. 53. P. 152-158. 16. Canicatti C., Farina-Lipar E. Dynamic and morphological aspects of coelomocytes clotting in Holothuria polii II J. Inv. Pathol. 1990. Vol.56. P. 63-69. 17. Canicatti C., Quaglia A. Ultrastructure of Holothuria polii encapsulating body // J. Zool. Lond. 1991. Vol. 224. P. 419— 429. 18. DeRidderC., Jangoux M. Description and significance of a peculiar intradigestive symbiosis between bacteria and a deposit-feeding echinoid II J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1985. Vol. 91. P. 65-76. 19. Edds K. T. Filopodia in sea urchin coelomocytes: formation by reorganisation of actin filaments // J. Cell. Biol. 1975. Vol. 67. P. 103a. 20. Edds K. T. Cell biology of Echinoid coelomocytes. I Diversity and characterization of cell types // J. Inv. Pathol. 1993. Vol. 61. P. 173— 178. 21. FernandesJ. M., Kem G. D.. MolleG. D. G„ Smith V.J. Antimicrobial properties of histone H2A from skin secretions of rainbow trout, Onchorynchus mykiss II Biochem. 2002. Vol. 368. P. 611-620. 22. FogacaA. C., da Silva P.. Miranda M. T:, BianchiA. G., Miranda A., Ribolla P. £., Daffr S. Antimicrobial activity of a bovine hemoglobin fragment in the tick Boophilus microplus II J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 25 330-25 334. 23. Fontain A. /?.. Lambert P. The fine structure of the leucocytes of holothurian Cucumaria miniata II Can. J. Zool. 1975. Vol. 55. P. 1530-1544. 24. Ganz T„ LehrerR.J. Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications // Mol. Med. Today. 1999. Vol.5. P 292-297. 25. Gross P. S„ Al-SharifW. Z, Clow L. A., Smith L.C. Echinoderm immunity and evolution of the complement system // Deveiop. Comp. immunoi. 1999. Vol.23, r 429-442. 26. Guerino M. L„ PatriquinD. G. The association of N2-fixing bacteria with sea urchins // Mar. Biol. 1981. Vol.62. P. 197-207. 27. HancockR. E. W„ Diamond G. The Role of cationic antimicrobial peptides in innate host defenses // TRENDS in Microbiology. 2000. Vol. 8, N9. P. 402-410. 28. Hancock R. E. W.\ Scott M. G. The Role of cationic antimicrobial peptides in animal defenses // PNAS 2000. Vol. 97, N 16. P. 8856-8861 29. HarwigS. S., Chen N. P., Park A. S. K., Lehrer R. I. Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leukocytes by continuous acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol. 208. P. 382-386. 30. Haug T., KjuulA. K, StyrvoldO. B., Sandsdale E, Olsen O. M, StenvagK. Antibacterial activity in Strongelocentrotus droebachiensis (Echinoidea), Cucumaria frondosa (Holothuroidea) and Asterias rubens (Asteroidea) // J. Inv. Pathol. 2002. Vol. 81 P. 94-102. 31. Hetzel H. R. Studies on holothurian coelomocytes. 1. A survey of coelomocytes types // Biol. Bull. 1963. Vol. 125, N 2. ?'. 289-301. 32. Holland N. D., Nealson K. H. The fine structure of the echinoderm cuticle and the subcuticular bacteria of echinoderms // Acta Zool. 1978. Vol.59. P. 169-185.
33. Iwanaga S. The molecular basis of innate immunity in the horseshoe crab // Curr Opin. Immunol. 2002. Vol. 14. P. 87-95.
34. Johnson P. T. The coelomic elements of sea urchin {Strongelocentrotus). 1. The normal coelomocytes; their morphology and dynamics in hanging drops // J. Inv. Pathol. 1969. Vol. 13. P. 24-41. 35. JollesJ., Jolles P. The lys'ozyme from Asterias rubens II Eur. J. Biochem. 1975. Vol.54. P. 19-23. 36. Kanungo K. The coelomocytes of asteroid echinoderms // Comp. Pathobiol. 1984. Vol. 6. P. 7-39. 37. Kelly M. S., McKenzieJ. D. Survey of the occurrence and morphology of sub-cuticular bacteria in shelf echinoderms from the north-east Atlanyic Ocean // Mar. Biol. 1995. Vol 123. P 741-756. 38. Kim H. S., Yoon H., Minn!., ParkC. B.. Lee W. T., ZasloffM., Kim S. C. Pepsin-mediated processing of the cytoplasmic histone H2A to strong antimicrobial peptide buforin I // J. Immunol. 2000. Vol. 165. P. 32 668-32 674. 39 .Kindred J. E. The cellular elements in the perivisceral fluid of echinoderms // Biol. Bull. 1924. Vol. 46. P. 228-251. 40. Kuwata H., Yip T. T., Tomita M„ Hutchens T. W. Direct evidence of the degranulation in human stomach of an antimicribial peptide domain (lactoferricin) from ingested lactoferrin // Biochim. Biophys. Acta 1998. Vol. 1429 P. 129141 41. LassingL, Lindberg U. Specificity of interaction between phosphatidylinositol 4,5-biphosphate and the profilin: actin complex / J. Cell Bioch. 1988. Vol. 37. P 255-267. 42. Lehrer R. /., Rosenman M., HarwigS. S. e. a. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides// J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173. 43. Liebmann E. The leucocytes of Arbacia punctulata // Biol. Bull. 1950. Vol. 98, N 1. P. 46-59. 44. Masson P. L. La lactoferrine. Proteine des secretions externes et des leucocyte neutriphiles. Bruxelles, 1970. 45. McKenzieJ. D„ KellyM. S. Comparative study of sub-cuticular bacteria in brittlestars (Echinodermata: Ophiuroidea) // Mar. Biol. 1994. Vol. 120. P. 65-80. 46. Mitta G., Vandenbulcke F, Roch P. Original involvement of antimicrobial peptides in mussel innate immunity // FEBS Lett. 2000. Vol.486. P. 185-190. 47. Mitta G., Vandenbulcke F„ Noel 71, RomestandB., Beauvillain J. C., SalzetM., Roch. P. Differential distribution and defense involvement of antimicrobial peptides in mussel // J. Cell Sci. 2000. Vol. 133. P. 2759-2769. 48. Panyim S„ Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch Biochem and Biophys. 1969. Vol. 130, N2. P. 337-346. 49. Park I. Y„ ParkC. B„ Kim M.S., KimS. C. Parasin I, an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the catfish, Pgrasilurus asotus II FEBS Lett. 1998. Vol.437. P. 258-262. 50. Petterson A. Ueber die bacterizeden leukocytens Stoffe und ihre Beziehungen // Immunitat und Bacteriol. 1905. Vol. 139. P. 423-437 51. Prim P., Lawrence J. M. Utilization of marine planys and their constituents by bacteria isolated from the gut of echinoids (Echinodermata) // Mar. Biol. 1975. Vol.33. P. 167-173. 52. ReinheimerG. Aquatic microbiology. 4th ed. New York, 1992. 53. Schagger H., vonJagowG. Tricine-sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis for separation of protein in the range from I to 100 kDa // Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. P. 368-379. 54. Schroder J.-M. Epithelial antimicrobial peptides: innate local host response elements // Cell. Moll. Life Sci. 1999. Vol. 56. P. 32-46. 55. Scott M. G., Hancock R. E. W. Cationic antimicrobial peptides and their multifunctional role in the
immune system // Critical reviews in immunology 2000. Vol.20. P 407-431. 56. ShaiY., OrenZ. From «carpet» mechanism to de-novo designed diastereometric cell-selective antimicrobial peptides // Peptides 2001. Vol. 22. P. 16291641. 57. Smith LC., Britten R. J., Davidson E. H. SpCoell: a sea urchin profillin gene expressed specifically in coelomocytes in response to injury // Mol. Biol. Cell 1992. Vol.3. P. 403-414. 58. Smith L.C., Britten R. J., Davidson E. H, Lipopolysaccharide activates sea urchin immune system // Dev. Сотр. Immunol. 1995. Vol. 19. P. 217— 224. 59. Strahl E. D„ Dodson W. £., Lundle L. L. Isolation and screening of brittlestar-associated bacteria for antibacterial activity // Cur. Microbiol. 2003. Vol. 44. P. 450-459. 60. Taylor S. W„ Craig A. G„ Fischer W. H., ParkM., LehrerR. I. Styelin D, an extensively modified antimicrobial peptide from ascidian hemocytes // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N 49. P 38 41-38 426. 61. WangY., Griffiths J., Jornval H., Agerberth В., JohansonnJ. Antibacterial peptides in stimulated human granulocytes. Characterization of ubiquitinated histone H1A ///Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 512-518. 62. Wardlaw A C., Unkles S. E. Bactericidal activity in coelomic fluid of sea urchin Echinus esculensis // J. Inv. Pathol.. Vol. 32. P. 25-34. 63. Vethamany V. G., Fun M. The fine structure of coelomocytes of the sea urchin Strongelocentrotus droebachiensis// Can. J. Zool. 1971. Vol. 50. P. 77-81. 64. ZasloffM. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. Vol.415. P. 389-395. 65. Zucht H. D., RaidaM., AdermannK., MagertH.D., ForssmannW.G. Casocidin-I: a casein-alpha s2 derived peptides exhibits antibacterial activity // FEBS Lett. 1995. Vol. 372. P. 185-188.
Статья поступила в редакцию 17 июня 2004 г.
\
