CC BY
103МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
DOI: 10.17725/rensit2019.11.369
Новые аддитивные технологии формирования сложных костных структур для медико-биологических применений 1Горшенёв В.Н., 2Зиангирова М.Ю., 3Колесов В.В., 2Краснопольская Л.М., 4Просвирин А.А., 5Телешев А.Т.
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, http://ibcp.chph.ras.ru/ Москва, 119334, Российская Федерация
2Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе, http:// www.gause-inst.ru/
Москва 119021, Российская Федерация
3Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН, http://www.cplire.ru/ Москва 125009, Российская Федерация
4Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова,
http://www.msmsu.ru
Москва 127473, Российская Федерация
5Московский педагогический государственный университет, Институт биологии и химии, http:// mpgu.su
Москва 119991, Российская Федерация
E-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Поступила 30.09.2019,рецензирована 14.10.2019, принята 21.10.2019
Аннотация. В работе разработан синтез наноразмерного гидроксиапатита реакцией обмена между диаммонийфосфатом и нитратом кальция в условиях механо-акустической обработки реакционной смеси. Предложены способы очистки гидроксиапатита от побочных продуктов. Диспергированием сырья животного происхождения получен белковый гидрозоль, в среде которого осуществлен синтез гидроксиапатита и получен коллаген-кальций-фосфатный композит. Рассмотрены способы формирования пористых коллаген-кальций-фосфатных композитов, среди которых отмечается действие микроволнового излучения. Показано, что на основе разработанных биокомпозиций: кальций-фосфатных паст, композиций из термопластичных биодеградируемых полимеров, нетканных волокнистых материалов можно изготавливать тканеинженерные конструкции с регулируемой архитектурой для решения различных медико-биологических задач. Создание трёхмерных структур, способных выполнять функции той или иной естественной ткани организма, на основе комбинации клеток и скаффолдов (трёхмерных структур, матрица, каркас), а также других факторов, оказывающих влияние на рост клеток, их дифференцировку и организацию внеклеточного матрикса является важной задачей тканевой инженерии.
Ключевые слова: наноразмерный гидроксиапатит, пористые коллаген-кальций-фосфатные соединения, биодеградируемые полимеры, нетканые волокнистые материалы, тканеинженерные конструкции, 3D технологии.
УДК 615.46
Благодарности: Работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ, проект 18-29-23042.
/Для цитирования: Горшенёв В.Н., Зиангирова М.Ю., Колесов В.В., Краснопольская Л.М., Просвирин А.А., Телешев А.Т. Новые аддитивные технологии формирования сложных костных структур для медико-биологических применений. РЭНСИТ, 2019, 11(3):369-390; DOI: 10.17725/ rensit.2019.11.369.
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
New additive technologies for forming complex bone structures for medical and biological applications
Vladimir N. Gorshenev
Emanuel Institute of Biochemical Physics of RAS, http://ibcp.chph.ras.ru/ Moscow 119334, Russian Federation Vladimir V. Kolesov
Kotelnikov Institute of Radioengineering and Electronics of RAS, http://cplire.ru/
Moscow 125009, Russian Federation
Mayya Yu. Ziangirova, Larisa M. Krasnopolskaya
Gause Institute of New Antibiotics, http://www.gause-inst.ru/
Moscow 119021, Russian Federation
Alexander A. Prosvirin
Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, http://www.msmsu.ru Moscow 127473, Russian Federation Andrei T. Teleshev
Moscow Pedagogical State University, http://mpgu.su Moscow 119001, Russian Federation
E-mail:[email protected],[email protected], [email protected], lmkrasmpolska@gmaiLcom, prosvirin@mail. ru, [email protected]
Received 30.09.2019, peer reviewed 14.10.2019, accepted 21.10.2019
Abstract. A synthesis of nanosized hydroxyapatite by the exchange reaction between diammonium phosphate and calcium nitrate under conditions of mechano-acoustic processing of the reaction mixture was developed. Methods are proposed for purifying hydroxyapatite from by-products. By dispersing raw materials of animal origin, a protein hydrosol was obtained in the medium of which hydroxyapatite was synthesized and a collagen-calcium-phosphate composite was obtained. Methods for the formation of porous collagen-calcium-phosphate composites, among which the effect of microwave radiation, are considered. It is shown that based on the developed biocompositions: calcium phosphate pastes, compositions from thermoplastic biodegradable polymers, non-woven fibrous materials, fabric-engineering constructions with an adjustable architecture can be made to solve various biomedical problems. The creation of three-dimensional structures capable of performing the functions of a particular natural tissue of the body, based on a combination of cells and scaffolds (three-dimensional structures, matrix, scaffold), as well as other factors affecting cell growth, their differentiation and organization of the extracellular matrix, is an important task of the tissue engineering.
Keywords: nanoscale hydroxyapatite, porous collagen-calcium-phosphate compounds, biodegradable polymers, non-woven fibrous materials, tissue engineering structures, 3D technologies UDC 615.46
Acknowledgments: The work was carried out with the financial support of the Russian Federal Property Fund, project 18-29-23042.
For citation: Vladimir N. Gorshenev, Mayya Yu. Ziangirova, Vladimir V. Kolesov, Larisa M. Krasnopolskaya, Alexander A. Prosvirin, Andrey T. Teleshev. New additive technologies for forming complex bone structures for medical and biological applications. RENSIT, 2019, 11(3):369-390; DOI: 10.17725/ rensit.2019.11.369._
Содержание соединений для совмещения с
1. Введение (371) коллагеновой матрицей (372)
2. Синтез кальций-фосфатных 2.1. Синтез «конденсационного»
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
ГИДРОКСИАПАТИТА (373)
2.2. СИНТЕЗ «ИОНООБМЕННОГО»
ГИДРОКСИАПАТИТА (374)
3. ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛАГЕН-КАЛЬЦИй-ФОСФАТНЫХ БИОКОМПОЗИТОВ (375)
4. ФОРМИРОВАНИЯ ПОРИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕН-КАЛЬЦИй-ФОСФАТНЫХ
композиций (376)
4.1. ФОРМИРОВАНИЕ ПОРИСТЫХ КОЛЛАГЕН-КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫХ БИОКОМПОЗИТОВ ЛИОФИЛЬНЫМ ВЫСУШИВАНИЕМ (377)
4.2. ФОРМИРОВАНИЕ ПОРИСТЫХ БИОКОМПОЗИТОВ ПУТЕМ ГРАНУЛИРОВАНИЯ И ВОЛОКНООБРАЗОВАНИЯ (377)
4.3. ФОРМИРОВАНИЕ ПОРИСТЫХ БИОКОМПОЗИТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ СПЕЦИАЛЬНЫХ ФОРМ И ПРИСПОСОБЛЕНИЙ
(378)
4.4. ФОРМИРОВАНИЕ ПОРИСТЫХ БИОКОМПОЗИТОВ ПУТЕМ МИКРОВОЛНОВОГО
НАГРЕВА (379)
5. ИЗГОТОВЛЕНИЕ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ
конструкций (380)
6. МЕТОДЫ ИМПЛАНТАЦИИ ПОЛИМЕРНЫХ ОБРАЗЦОВ В ДЕФЕКТ КОСТИ (383)
7. ИЗГОТОВЛЕНИЕ КОСТЕЗАМЕЩАЮЩИХ МАТЕРИАЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА
3Б-ПЕЧАТИ (385)
8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ (387) Литература (388)
1. ВВЕДЕНИЕ
Проблема восстановления целости костей после их повреждений и заболеваний характеризуется растущей актуальностью и высокой социально-экономической значимостью [1-3]. Мировой клинический опыт лечения патологии костной ткани и замещения дефектов костей постоянно доказывает, что применение костно-пластических материалов в реконструктивной хирургии является одним из решающих факторов достижения положительного результата операции [47]. Тканеинженерные задачи по разработке сложных конструкций костезамещающих материалов могут быть решены при совместном участии междисциплинарных коллективов
медиков, биологов, химиков, физиков и инженеров. Замещение дефектов костной ткани пористыми имплантатами с последующим восстановлением живой костной ткани организма следует рассматривать как процесс реализации генетической информации [8-10].
Для создания оптимальных условий регенерации повреждённой ткани
необходимы знания о механизмах регуляции ее роста и дифференциации. Знания о протекании процесса остеогенеза, процессов биодеструкции имплантатов в живых системах и процессов замещения дефектов костной ткани способствуют созданию новых видов костезамещающих биоматериалов при смешении природных и синтетических полимеров.
В современной имплантологии
принципиально можно выделить несколько уровней технологических разработок в изготовлении биопластических костных материалов [11]. Первый донорский уровень предусматривает использование донорских тканей без их глубокой переработки [12]. Второй донорский уровень характеризуется глубокой обработкой донорских тканей. Примером может служить процесс изготовления деминерализованных костных аллоимплантатов, где в костной ткани с помощью декальцинации растворами кислот меняют соотношение минерального и органического компонентов. В таких случаях материал приобретает дополнительные остеоиндуктивные свойства. При этом деминерализация кости может быть поверхностной, частичной или полной. В зависимости от степени декальцинации материал имеет разные механические и пластические характеристики, что дает хирургу возможность комбинировать материал в зависимости от конкретной клинической ситуации [13] Использование стерилизации, вирусной инактивации с применением низкочастотного ультразвука позволило полностью удалять клеточные элементы, жир, стромы костного мозга, спонгиозы [14]. Третий уровень предполагает создание биокомпозиционных материалов, содержащих
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
как основные компоненты костной ткани, так и биоактивные субстанции. К биоактивным субстанциям относятся факторы роста, морфогенетические белки и другие компоненты костного матрикса, играющие роль активаторов и регуляторов физиологической регенерации тканей. В настоящее время разработки подобных биокомпозиционных материалов в России приобретают приоритетный характер [15, 16]. Четвёртый технологический уровень, активно разрабатываемый в последнее время, предопределяет возможность создания синтетических биокомпозиционных
материалов на базе современных технологий таких как:
1. Стереолитографическое копирование тканей [17].
2. Технологии создания 3-х мерных имплантатов [18, 19].
3. Жидкостно-распределительное моделирование [20].
4. Фазовоизменяющее создание имплантатов [21].
Сочетание методов четвёртого
технологического уровня костной инженерии позволяет с высокой точностью копировать тканевые объекты и создавать материалы с четко определенными размерами, геометрией и распределением пор, а также полностью воспроизводить архитектонику органного участка и его внутренних каналов в создаваемом имплантате.
При выборе исходных материалов для создания биокомпозитов сегодня наиболее естественными являются коллаген и гидроксиапатит, которые в многочисленных экспериментах на животных показали не только превосходную биосовместимость, но и продемонстрировали свою способность в зависимости от состава, способа изготовления стимулировать костеобразование и служить матрицей для формирующейся новой костной ткани. Однако при создании искусственных коллаген-апатитовых
материалов технологические вопросы регулирования пористости материала, управления формированием его структурности
и механической прочности остаются далеко не решенными. В то время, как именно эти параметры являются принципиально важными для максимального проявления материалом свойства остеокондукции в ходе репаративной регенерации кости.
2. СИНТЕЗ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ СОВМЕЩЕНИЯ С КОЛЛАГЕНОВОЙ МАТРИЦЕЙ
В мировой медицинской практике активно разрабатываются разнообразные биосовместимые материалы для клинического использования в качестве костных имплантатов. При этом, кальций-фосфатные соединения с природными полимерами и биосовместимыми, биодеградируемыми
синтетическими полимерами являются основными составляющими при создании костных имплантатов. Работы в мировой практике по созданию костных имплантатов проводятся по следующим направлениям: 1) синтез кальций-фосфатных соединений; 2) совмещение кальций-фосфатных соединений с природными и/или синтетическими полимерами; 3) синтез кальций-фосфатных соединений в гелеобразных средах природных и синтетических полимеров. Все условно выделенные направления нацелены на создание биокомпозитов для замещении дефектов костной ткани.
Первое направление, связанное с синтезом кальций-фосфатных соединений при создании костных имплантатов, развитие нанотехнологии их получения по-прежнему является актуальной задачей. Это связано с тем, что соответствующие синтетические кальций-фосфатные соединения должны индуцировать иактивноучаствоватьвбиологическихреакциях, аналогичных протекающим в процессе остеогенеза. Синтез кальций-фосфатных частиц твёрдой фазы для медицинских приложений обычно осуществляют методом осаждения из растворов [22]: Например, из растворов 1) нитрата кальция и гидрофосфата аммония, 2) хлорида кальция и гидрофосфата натрия, 3) хлорида кальция и гидрофосфата
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
калия, 4) ацетата кальция и гидрофосфата калия. Так, при изготовлении керамических биокомпозитов кальций-фосфат получен из ацетата кальция и гидрофосфата натрия [23].
В работах [25, 26] для получения биокомпозитов применяли кальций-фосфатные порошки, имеющие наночастицы различных фазовых составов и форм, таких как пластинчатые толщиной 0.8-4.5 нм и иглоподобные диаметром 5-10 нм, длиной 40-50 нм. Установлено, что в зависимости от условий синтеза, фазового состава, структурных, морфологических характеристик частиц кальций-фосфата его биоактивность может проявляться по-разному. Установлена возможность модифицирования поверхности частиц гидроксиапатита излучением, химической активацией с образованием радикалов, модифицирование химическими реагентами, протеинами, что позволяет укреплять связь между биокомпозитом и костной тканью.
В настоящей работе рассматриваются основы энергосберегающей технологии получения кальций-фосфата на примере гидроксиапатита путем механо-акустической активации реакционных смесей, состоящих: 1) из водных суспензий монофосфата кальция и гидроксида кальция; 2) из водных растворов диаммонийфосфата, тетрагидрата нитрата кальция и гидроксида аммония. Механо-акустическая активация, в условиях саморазогревареакционной смеси,проводилась с помощью, роторно-пульсационного аппарата (РПА) «Дельта-ротор» (производство ООО НПП ««Авиатехника») [27], позволяющего быстро и полно сформировать в водной среде дисперсию гидроксиапатита.
Размеры частиц дисперсной фазы оценивались с помощью метода динамического светорассеяния на приборе Zetasizer Nano ZS Zen3600 «Malvern». Результаты распределения объемной (массовой) доли частиц в зависимости от их размеров свидетельствуют, что в контрольных синтезах, в стандартных лабораторных условиях, имеет место образование довольно крупных частиц со средним
гидродинамическим диаметром около 5.5 мкм. В отличие от этого, механо-акустическая активация позволяет сформировать
наноразмерные частицы гидроксиапатита, имеющие средний гидродинамический диаметр около 20 нм.
2.1. Синтез«конденсационного»гидроксиапатита
Синтез «конденсационного» гидроксиапатита (ГАП-к) проводился согласно уравнению реакции:
6СаНГО4ХН20 + 4Са(ОН)2 ^ Са10(РО4)6(ОН)2 + 12Н2О
Изменения в соотношении массы реагентов к массе реакционной среды, в синтезе ГАП-к конденсационным способом, незначительно влияют на размерность частиц получаемой дисперсной фазы. Однако следует отметить, что ширина распределения частиц по размерам безусловно меньше при низкой частичной концентрации образующегося ГАП-к. К особенностям синтеза ГАП-к, получаемого взаимодействием монофосфата кальция и гидроксида кальция, следует отнести трудности контроля за протеканием реакции. Это во многом связано с чистотой реагентов и точностью взятия навесок исходных реагентов. Экспресс-контроль в этом случае проводился по изменению рН реакционной среды или путем отбора проб с их последующим инструментальным анализом, например, с помощью ИК-спектроскопии.
Гидроксиапатит (ГАП-к) имеет выраженную кристаллическую структуру, что подтверждают данные электронной микроскопии. На микрофотографии (рис. 1) наблюдаются
Рис. 1. Микрофотография частиц (ГАП-к). Масштаб-200нм. Сканирующий электронный микроскоп Neon 40 EsB-35-09.
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
кристаллы пластинчатой формы с включениями порошка.
2.2.Синтез ««ионообменного»гидроксиапатита
Синтез гидроксиапатита реакцией ионного обмена (ГАП-и) проводился согласно уравнению реакции:
6(ЫН4)2НР04 + 10Са(Ы03)2х4Н20 + 8ЫН40Н^ ^ Са10(РО4)6(ОИ)2 + 20ЫН4Ы03 + 46Н20
Размеры частиц дисперсной фазы оценивались с помощью метода динамического светорассеяния. Результаты распределения объемной (массовой) доли частиц в зависимости от их размеров свидетельствуют, что в контрольном синтезе (без использования РПА), имеет место образование довольно крупных частиц со средним гидродинамическим диаметром около 5.5 мкм. В отличие от этого, механо-акустическая активация позволяет сформировать наноразмерные частицы гидроксиапатита, имеющие средний гидродинамический диаметр примерно 22 нм. Массовая доля таких частиц в реакционной среде составляет ~75%. Следует отметить, что уменьшение скорости подачи раствора диаммонийфосфата в реактор и увеличение скорости перемешивания реагентов приводит к увеличению дисперсности. Так, при скорости вращения ротора РПА 3100 мин-1 и скорости введения в реактор раствора диаммонийфосфата 0.5 л/мин получена дисперсия, характеризующаяся частицами, имеющими средний диаметр примерно 20 нм. Массовая доля таких частиц в реакционной среде составляет ~90%.
Наиболее энергоемкой частью синтеза ГАП-и реакцией обмена является очистка его золя от побочного продукта — нитрата аммония. Наноразмерные частицы ГАП-и лишь с большим трудом могут быть отделены от жидкой фазы и освобождены от примеси нитрата аммония. В связи с этим реализованы следующие варианты получения чистого ГАП-и:
1) декантацией,
2) с помощью центрифугирования,
3) термической обработкой.
Второй подход в отличие от седиментации
в гравитационном поле, позволяет увеличить скорость процесса очистки. Очистка ГАП-и путем декантации связано с большим расходом воды и не может быть признана эффективной. Интерес представляет термическая обработка технического ГАП-и, которая использовалась в работе [28]. Действительно, нами показано, что образец ГАП-и, загрязненный нитратом аммония, успешно может быть очищен термической обработке при 350°С в течение 30 мин.
Данные элементного анализа
очищенного ГАП-и подтверждают полное отсутствие азотсодержащих примесей в термообработанном образце (эталон
— нитрат аммония). Дополнительным подтверждением отсутствия нитрата аммония в очищенных образцах ГАП-и служат результаты калориметрического эксперимента. ГАП-и, полученный реакцией обмена и подвергнутый термообработке, переходит в ксерогель, имеющий характерную голубую люминесценцию.
Следует отметить, что кристаллическая фаза не является доминирующей в структуре очищенного ГАП-и. Это наблюдается как для образца его суспензии, так и для образца
— ксерогеля. На это указывают данные электронной сканирующей микроскопии.
Методом эталонной контактной
порометрии по изменению веса образца, обработанного под вакуумом октаном, найдено, что пористость термобработанного ГАП-и составляет величину около 75% при среднем радиусе поры 2.8'103 нм. ГАП-и, очищенный от примесей и диспергированный в воде, склонен во времени к изменению своих свойств. Эти изменения, в частности, направлены в сторону укрупнения частиц дисперсной фазы. Так, после выдержки дисперсии очищенного ГАП в водной среде в течение 30 дней средний диаметр частиц возрастает до 44 нм. Изменение во времени дисперсности ГАП-и, очищенного от побочных продуктов реакции, может быть связано с изменением природы дисперсионной среды. При этом меняются характеристика диффузного слоя противоионов. На это
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
указывает найденное падение дзета-потенциала с +30 мВ для водной дисперсии технического ГАП-и до значения около +5 мВ, характерного для дисперсии очищенного продукта.
3. ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛАГЕН-
КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫХ
БИОКОМПОЗИТОВ
На стадии изготовления биокомпозитов кальций-фосфатные соединения
обычно сочетаются как с природными, так и с искусственными полимерами, например, коллагеном, желатином,
альгинатами, хитозаном, полилактидом, полигидроэтиметакрилатом и другими [29-33]. Особый интерес к полимерным материалам обусловлен возможностью получения из них гидрогелей. Биосовместимость, клеточная адгезия, способность существовать в организме, не повреждая соседние клетки, являются необходимыми критериями при разработки гидрогелевых биоматериалов. В настоящее время при изготовлении костных имплантатов проявляется интерес к технологиям совмещения природных и искусственных полимеров. Это связано с тем, что такие материалы путем изменения свойств биокомпозита (сорбции, диффузии, соотношения гидрофобных и гидрофильных участков и др.) позволяют тонко регулировать протекание основных процессов восстановления костной ткани, таких, как воспаление, растворение, гидролиз, ферментативный гидролиз, клеточная биодеградация.
Установлено, что после введения полимерсодержащего биокомпозита в организм животных вокруг него группируются клетки различных типов. На первом этапе вокруг биокомпозита образуется рыхлая соединительная ткань, через которую проходят сосуды крови и нервные волокна. Из крови в формирующуюся ткань входят клеточные элементы соединительной ткани и клетки-фибробласты, вырабатывающие коллаген. При этом для крови, как одной из основных соединительных тканей организма, необходима эффективная циркуляция в объеме
биокомпозита, что может быть обеспечено его пористой структурой.
В упрощённом виде процесс регенерации состоит из следующих стадий:
1) в области дефекта костной ткани образуется тканекровяной сгусток из макрофагов и фибробластов;
2) на следующей стадии в области дефекта наблюдаются клетки (остеокласты) и клетки (остеобласты);
3) в результате участок заполняется фиброзной тканью и элементами костной ткани;
4) восстановление надкостницы, костного мозга и системы сосудов приводит, в конечном счёте, к созданию новой костной ткани.
В работе [34] отмечается, что в результате многочисленных экспериментальных
исследований установлена высокая
эффективность для замещения дефектов костной ткани и активизации репаративного остеогенеза биокомпозиционного препарата, совмещающего гидроксиапатит, коллаген с включением антибиотиков (Коллапан). При этом отмечается необходимость достижения величины макропор биокомпозита не менее 300 мкм, что способствует питанию, клеточному распространению по поверхности макропор и формированию капилляров.
В настоящей работе разработаны основы энергосберегающей технологии получения коллаген-кальций-фосфатных биокомпозитов путем совмещения гидроксиапатита и коллагена в условиях механо-акустической активации реакционных смесей. В отличие от известных способов совмещения кальций-фосфатных частиц твёрдой фазы с полимерным материалом, в продолжение работ [35, 36], были получены образцы биокомпозитов путём синтеза кальций-фосфатных соединений непосредственно в коллагеновой матрице.
Для получения пористых кальций-фосфатных биокомпозитов в качестве источника органических связующих служила свиная шкура (СШ), используемая в пищевой промышленности [37]. Известно [38], что при экстракции кожного покрова животных
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
получается раствор белковых фракций, образующих фибриллы. Цепи фибрилл закручены в форме «электрического кабеля», а боковые группы всех аминокислотных остатков находятся на внешней стороне молекулы. Диспергирование СШ проводили в водной среде с получением коллагенового золя. Для получения пористых кальций-фосфатных биокомпозитов использовался также желатин — один из лучших гелеобразователей белковой природы. Гидрозоль желатина как и коллаген концентрацией от 2% и более при охлаждении ниже 40° С образует устойчивые гели. Механизм образования геля желатина при переходе золь-гель связан с образованием трёхмерной сетчатой структуры за счёт водородных связей. При охлаждении раствора желатина хаотично расположенные спирали макромолекул изменяют конформацию полипептидных цепей, формируя трёхмерную структуру с потерей текучести. Установлено, что при ферментативной обработке коллагенсодержащего сырья образуются высокомолекулярные желатины, из которых формируются прочные гели.
В качестве исходного коллагенсодержащего сырья использовалась СШ, обезжиренная гексаном, подвергнутая криодроблению до размера частиц <5 мм и бланшировке при температуре 60°С. Синтез композиций гидроксиапатит-коллаген проводился в РПА в процессе последовательной загрузки компонентов согласно схемам: соотношение коллаген-гидроксиапатит 6:4 (ГАП-К-1) и соотношение коллаген-гидроксиапатит 4:6 (ГАП-К-2).
Иммобилизация гидроксиапатита на коллагеновой матрице приводит к укрупнению частиц дисперсной фазы. Так, в отличие от гидроксиапатита, сформированного в отсутствие коллагена, имеющего средний диаметр частиц примерно 20 нм, частицы композиции ГАП-К-1 имеют средний диаметр примерно 680 нм.
В ИК-спектре пульпы ГАП-К-1 имеется сильная полоса поглощения 1332 см-1, связанная с наличием в системе примеси нитрата аммония.
Очистка композиции ГАП-К-1 от нитрата аммония проводилась последовательным промыванием осадка дистиллированной водой. Многократная декантация приводит к композиции ГАП-К-1, согласно спектральным данным, исключающим присутствие в композиции нитрата аммония.
Очистка композиции ГАП-К-2 от нитрата аммония проводилась с помощью метода отстаивания со сливом жидкости и последовательным промыванием осадка дистиллированной водой. Многократная декантация приводит к композиции ГАП-К-2, согласно спектральным данным, исключающим присутствие в композиции нитрата аммония. Полученные композиции коллаген-гидроксиапатит (ГАП-К-1, ГАП-К-2) использовались для формирования пористых материалов медицинского назначения.
4. ФОРМИРОВАНИЯ ПОРИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕН-КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫХ КОМПОЗИЦИЙ
Пористые биоматериалы необходимы для эффективного взаимодействия имплантатов с тканями в живых системах. Для всех трёхмерных пористых биоматериалов (скаффолдов), участвующих в этапе роста клеток, важно, чтобы их поверхность способствовала адгезии, закреплению клеток и их миграции в пористой структуре. Развиваемые в работе новые подходы по формированию пористых биокомпозитов с применением техники 3D-печатн и микроволновых излучений позволили
сформировать пористые образцы биокомпозитов с различной структурой пор. Преимущества применений пористых материалов для медико-биологических целей на основе природных и синтетических полимеров связаны также с возможностями регулировать функциональные свойства синтезируемых материалов за счёт иммобилизации ферментов, белков, аминокислот и других природных веществ [39].
Введение в дефектные участки костной ткани биокомпозитов, в состав которых входят стволовые клетки, также может быть осуществлено
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
с применением пористых биокомпозитов.
При создании пористых костезамещающих материалов применяются биосовместимые и биодеградируемые полимеры, для которых разрабатываются различные способы формирования пористой структуры. Так, пористые биокомпозиты изготавливаются с применением следующих способов: 1) лиофильное высушивание; 2) микроволновое высушивание; 3) применение приспособлений с волокнами (полезные модели); 4) применение газовыделяющих добавок в составе композиций (порофоры); 5) формирование пористых биокомпозитов в сверхкритическом диоксиде углерода; 6) конструирование пористых биоматериалов методом 3D—печати.
В настоящей работе рассматривались некоторые способы формирования пористых коллаген-кальций-фосфатных композитов. При этом использовалась способность синтезированных ГАП и ГАП-К образовывать пластичные пастообразные композиции в результате центрифугирования и удаления избыточной воды. Центрифугирование, проводилось на центрифуге Allegro 64R, Beckman в режиме 6000 мин-1 по 15-20 мин при 10° С. После центрифугирования гидроксиапатитовые концентраты помещались в специальные формы для изготовления пористых биокомпозитов. Полученные по разработанным способам формирования объёмные пористые коллаген кальций-фосфатные биокомпозиты применялись в моделях ортопедии и травмотологии для замещения дефектов костной ткани в живых системах [40].
4.1. формирование пористых коллаген-кальций-фосфатных БиокомпозитоВ лиофильным высушиванием
Образцы пористых композитов (рис. 2) формировались путём лиофильного высушивания коллаген-кальций-фосфатных золей, полученных согласно разработанному методу. Дополнительная сшивка проводилась глутаровым альдегидом. Высушивание осуществлялось в лиофильной сушилке Martin Christ Gamma 1-16 LSCplus при температуре
а Ь
Рис. 2. Образцы коллаген-кальций-фосфатных биокомпозитов после лиофильного высушивания (а), микрофотография пор образца биокомпозита (Ь),
масштаб — 20 мкм. конденсора —55° С.
После лиофильного высушивания, в зависимости от содержания воды в коллагеновом компоненте, получены пористые образцы плотностью 0.15-0.2 г/см3. Методом эталонной контактной порометрии [41] по изменению веса образцов, обработанных под вакуумом органической жидкостью — октаном, определено, что основная доля пор для биокомпозита ГАП-К-1 приходится на размеры от 10 мкм до 100 мкм. При этом поры примерно 60 мкм являются доминирующими.
При сравнении коллаген-кальций-фосфатных биокомпозитов с чистым гидроксиапатитом (без связующей
органической компоненты), установлено, что величина поверхности пор зависит от соотношения минеральной и органической составляющих композита и заметно уменьшается при увеличении содержания органической компоненты. Так, ксерогель чистого ГАП-2 характеризуется площадью пор около 616 м2/г, а для композиции коллаген-кальций-фосфат эта величина уменьшается до 27 м2/г, что обусловлено блокированием пор органическим компонентом.
4.2. формирование пористых БиокомпозитоВ путем гранулирования и ВолокнооБрАзоВАния
Метод заполнения форм гранулами или волокном связан с перколяционными моделями. Между гранулами и волокнами происходит протекание физиологических жидкостей, обеспечивающих условия роста клеток. Изготовление гранул и волокон в работе осуществлялось из текучей
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
Рис. 3. Гранулы, изготовленные путём диспергирования суспензии ГАП-К-2 в вазелиновом масле (а), волокна ГАП-К-2, сформированные в растворе хлорида кальция (Ь). На фото поле размером 4x4 см.
коллаген-кальций-фосфатной пасты. При формировании волокон в композицию дополнительно вводился альгинат натрия. Выдавливание смесевой композиции при формировании волокон осуществлялось с помощью перистальтического насоса в раствор хлорида кальция. Полученные гранулы и волокно в дальнейшем подвергались лиофильному высушиванию и из них собиралась тканеинженерная конструкция с использованием растворов биодеградируемых полимеров.
На рис. 3 представлены изображения гранул и волокна, из которых собирается тканеинженерная конструкция.
4.3. Формирование пористых Биокомпозитов с применением специальных форм и приспособлений
Для формирования биокомпозитов с большим размером пор от 100 до 300 мкм были разработаны и изготовлены специальные формыиприспособления[42].Приспособление (рис. 4а) для формирования пористого костного композита состоит из полой кюветы (1), выполненной с возможностью заполнения биокомпозитной массой (2) и задающими
пористость закладными волокнами (3), которые фиксируются в сквозных отверстиях (4), проделанных в стенках кюветы. После заполнения биокомпозитной массой, сушки и удаления волокон получается композит с заданной сквозной пористостью и заданным распределением волокон. Волокна выбираются из группы, включающей текстильные, полимерные, металлические волокна, в том числе из биоразлагаемых материалов диаметром 100-500 мкм.
Кювета для заполнения
биокомпозитной массой изготавливается из полиметилметакрилата, тефлона или металла в случае необходимости нагрева связующего компонента или для инициирования процесса полимеризации. Кювета для заполнения биокомпозитной массой может быть выполнена также в форме трубки (рис. 4Ь) из эластичного полимера, преимущественно каучука, а введение закладных волокон (3) осуществляют через сквозные отверстия в ее стенках, образованные прокалыванием иглой с нитью. Фотографии участков поверхности коллаген кальций-фосфатного композита со сквозными порами приведены на рис. 5.
Такие методы могут применяться как для изготовления биокомпозиций из природных полимеров, так и смешанных композиций из природных и синтетических полимеров. Смешение водных пастообразных композиций с природными полимерами и пастообразных синтетических полимеров в органических растворителях в условиях ультразвукового диспергирования смесей позволило получить пастообразные смеси и выдавливанием из шприца сформировать биокомпозиты в виде решетки с окном порядка 0.3-0.3 мм (рис. 6Ь).
Д. Ж
.шяжж&Ь.
а Ь
Рис. 4. Приспособления для формирования биокомпозитов со сквозной пористостью.
Рис. 5. Участки поверхности композита со сквозными порами.
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
%
а Ь
Рис. 6. а — поры в образце полилактида с частицами гидроксиапатита формировались после совмещения компонентов и высушивании на роторном испарителе; Ь — образец из композиции альгинат натрия-ГАП-2 в
виде решётки, изготовленный в специальной форме. 4.4. формирование пористых БиокомпозитоВ путем микроволнового нагрева
Применение микроволнового излучения для удаления жидких фаз из биокомпозитных составов перспективно особенно в условиях формирования смешанных композиций из природных и синтетических полимеров. Биокомпозиты, содержащие воду, полярные растворители, электропроводящие частицы, при взаимодействии с микроволновым излучением (СВЧ-диапазона) интенсивно нагреваются. В результате происходит удаление из биокомпозита жидких веществ, переходящих в газовую фазу, и формирование пористой структуры материала [43].
Взаимодействие электромагнитного
излучения (ЭМИ) с образцами материалов характеризуется коэффициентами отражения (К), поглощения (О), прохождения (Т). Величины К, 2, Топределяются комплексными значениями диэлектрической, магнитной проницаемости образцов материалов, длиной волны излучения и толщиной облучаемого материала (й). Модельные эксперименты с материалами различной природы (интеркалированными графитами, саженаполненной бумагой, жидкостями) показали,чтодляэффективноговзаимодействия с электромагнитным излучением необходимо определенное отношение удельного объемного сопротивления материалов (ру), толщины материала (слоя й) и расположения материала на диэлектрической подложке (с величиной диэлектрической проницаемости
подложки ¿). Баланс всех частей энергии и определяет условия нагрева.
Для удаления жидких фаз из коллаген-гидроксиапатитового композита
использовалась СВЧ-печь (частота 2.45 ГГц, мощность 800 Вт). Образцы биокомпозитов изготавливались нанесением пастообразного комплекса исследуемых компонентов на диэлектрическую тефлоновую подложку с последующим высушиванием под действием излучения СВЧ-печи.
Установлено, что процесс высушивания в режиме последовательного нагрева коллаген-гидроксиапатитовой композиции по 15-20 сек не приводит к сильному нагреву образцов и развитию деструктивных процессов. Спектры комбинационного рассеивания (КР) образцов коллаген-гидроксиапатита лиофильно
высушенные и высушенные под действием СВЧ-излучения практически не отличаются. Сравнение порометрических параметров в области пор больше 10 мкм образцов биокомпозитов, высушенных лиофильно и под действием СВЧ-излучения также не выявили явных различий.
СВЧ-излучение использовалось также при приготовлении сложных композиций, включающих помимо коллаген-гидроксиапатита, дополнительные биодеградируемые полимеры. При этом водная суспензия коллаген-кальций-фосфата под действием ультразвукового воздействия с частотой 22 кГц и генерируемой мощностью излучателя 100 Вт смешивалась с биодеградируемым полимером в органическом растворителе. Формирование пористых биокомпозитов осуществлялось послойным нанесением композиций на диэлектрическую подложку и удалением жидких компонентов под действием микроволнового излучения. Оценку количества полимерного компонента М(г), необходимого для обеспечения оптимального плёнкообразования на частицах гидроксиапатита, проводили с учётом сухого ГАП (т, г), удельной поверхности порошка ГАП (^ см2/г), плотности полимера, (р , г/см3) и толщины слоя полимера на поверхности частиц порошка (Ь, см).
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
Заслуживает внимания биокомпозит, полученный на основе 2-гидроксиэтил-метакрилат (ГЭМА) и ГАП с использованием СВЧ-излучения. Для этого паста ГАП-2 с содержанием воды 12% в количестве 19.8 г смешивалась с помощью низкочастотного ультразвукового диспергатора УЗДН-1 (частота излучателя 15 кГц) с 5.1 г ГЭМА. Весовое соотношение ГЭМА-ГАП (в пересчете на сухой ГАП, 1:3.5). Паста ГЭМА-ГАП-2 подвергалась высушиванию с помощью микроволнового излучения. При введении в состав пасты персульфата калия с последующим СВЧ-нагреванием и высушиванием происходит процесс полимеризации и образуются твердые белые органоминеральные композиции.
В результате исследований установлено, что при введении в состав пастообразных композиций добавок, влияющих на электрическую проводимость композиций, можно регулировать скорость выделения газообразных компонентов, и тем самым влиять на пористую структуру биоматериалов. Введение волокнистых добавок также может существенно повлиять на распределение пористой структуры в биоматериале.
Результаты исследований по
формированию пористой структуры в образцах биополимеров показали, что применение теплового и микроволнового (СВЧ) методов удаления жидкой фазы наиболее эффективно для образцов, содержащих воду. Поэтому изготовление пористых биоматериалов через стадию создания водных эмульсий из плёнкообразующих биосовместимых полимеров с кальций-фосфатными соединениями перспективно для формирования пористых биоматериалов. Установлено, что при сочетании теплового и микроволнового нагрева в полимерной матрице возникает развитая структура пор. При термонагреве термопластичные полимеры переходят в вязкотекучее состояние, а выход газообразующих компонентов из жидкой фазы формирует сквозные поры в материале и поры больших размеров.
5. ИЗГОТОВЛЕНИЕ
ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ
КОНСТРУКЦИЙ
Для изготовления тканеинженерных конструкций в работе были подготовлены биокомпозиции из природных и синтетических полимеров в виде паст, термопластичных прутков и нетканных волокнистых материалов. Такой подход позволил провести построение тканеинженерных конструкций при различных сочетаниях исходных композиций, которые являются составляющими конструкций и сами являются образцами материалов для замещения дефектов костной ткани. Пастообразные кальций-фосфатные композиции были получены смешением синтезированных частиц гидроксиапатита с суспензиями коллагена, желатина, альгината натрия и синтезом частиц гидроксиапатита непосредственно в суспензиях полимеров. Методики получения паст включают стадии синтеза частиц гидроксиапатита, ультразвуковое диспергирование и стадию центрифугирования до получения пастообразной консистенции композиций.
Методами погружения индентора под нагрузкой в образцы кальций-фосфатных паст определено, что вязкость композиций является характеристикой пластичных свойств паст. Измерения кальций-фосфатных образцов — паст проводили по методике погружения в образец индентора под нагрузкой. В образце после приложения нагрузки развивается процесс ползучести, связанный с развитием необратимой деформации. Вязкость композиции 0.44 МПа. Увеличение концентрации частиц гидроксиапатита привело к увеличению упругих свойств композиции (при соотношении частиц гидроксиапатита и коллагена ГАП-К 6:4). При добавлении к коллаген-гидроксиапатитовому концентрату -5% раствора глутарового альдегида, а в композицию альгината натрия -5-15% раствора хлорида кальция, образцы материалов приобретают эластичные свойства и возрастает прочность образцов за счёт образования сшивок между макромолекулами
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
полимеров.
Пористые образцы коллаген кальций-фосфатных композиций изготовлены путём заполнения пастами форм и высушивания лиофильно и СВЧ-нагревом. В результате высушивания получены пористые образцы в виде пластин плотностью 0.15-0.2 г/см3. Методом эталонной контактной порометрии определено, что основная доля пор приходится на размеры от 10 мкм до 100 мкм. Пористые образцы в виде пластин также изготовлены смешением частиц гидроксиапатита с суспензиями альгината натрия.
После заполнения форм различных конструкций пастами и высушивания были получены пористые образцы различных видов. При смешении альгината натрия и частиц гидроксиапатита образуется однородная, необходимой консистенции паста 65% (2% раствор альгината Ыа) и 35% порошка гидроксиапатита (ГАП). Полученную смесь (ГАП и альгината Ыа) тщательно диспергировали с помощью ультразвукового воздействия низкочастотным генератором ультразвука с частотой 22 кГц в течение 5-10 минут.
Установлено, что можно совмещать коллаген кальций-фосфатные концентраты с растворами синтетических полимеров с получением паст из смеси природных и синтетических полимеров. Смешение коллаген кальций-фосфатной пасты с раствором полилактида (в соотношении 1:1, по массе) проводилось в условиях ультразвукового диспергирования в течение 5 минут. Создание смешанных пластичных композиций из природных и синтетических полимеров является перспективным направлением тканевой инженерии. С использованием различных способов формирования пористой структуры можно изготавливать тканеинженерные конструкции различной сложности для медико-биологических применений.
Результаты сравнительных испытаний прочностных свойств биокомпозитов на основе природных и синтетических полимеров
показали, что совмещение полимеров различной природы приводит к увеличению прочностных свойств биокомпозитов и изменению времени их биодеградации в живых системах.
При насыщении водой образцы приобретают эластичные свойства. Наибольшей прочностью (80 МПа) и наименьшей разрывной деформацией (25%) обладаютобразцынаосновеполиакриламидного геля (ПААГ). Композиции на основе коллагена имеют наибольшую разрывную деформацию (65%), но их прочность (2 МПа) мала. С увеличением толщины полимерного слоя из синтетических биодеградируемых полимеров на поверхности пористого коллаген кальций-фосфатного образца возрастают прочностные характеристики, также изменяется время биодеградации.
Синтетические биодеградируемые
полимеры: полилактид — ПЛА (марки 4032D Nature Works LLC (L-D,L)), поли-3-гидроксибутират — ПГБ, полученный микробиологическим синтезом (компанией BIOMER, Германия) и поликапролактон — ПКЛ (ООО "АДАЛИК"), относятся к классу термопластичных полимеров и применялись в работе для построения тканеинженерных конструкций. Для применения
термопластичных полимеров в технологиях 3D-печати необходимо изготавливать прутки заданной толщины и прочности. Из экспериментальных данных следует, что наибольшую прочность имеет образец из полилактида, а введение в синтетический полимер (ПГБ) частиц гидроксиапатита (20 масс.%) приводит к уменьшению прочностных характеристик.
Исследования теплофизических и прочностных свойств термопластичных биодеградируемых полимеров необходимы для построения тканеинженерных конструкций методом 3D-печати. Поэтому методами ТГА, ТМА, ДМА, ДСК были проведены сравнительные исследования образцов полимеров, смесей полимеров и образцов композиционных материалов.
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
Процессы нагрева и охлаждения при экструзионном выдавливании методом 3D-печати влияют на размеры волокон, на форму и размеры ячеек при построении ячеистых трёхмерных конструкций (рис. 7). Результаты измерений характеристик образцов полимеров методом ДСК показали, что в режиме нагревания-охлаждения образцы из ПГБ не обладает термостабильностью по сравнению с ПЛА. Для ПГБ характерно изменение кристаллических фаз с превращением в аморфное состояние. Растекание термопластичного материала приводит к увеличению толщины образцов при изготовлении прутков. Изменение термостабильности образцов ПГБ происходит при смешении полимера с частицами гидроксиапатита.
Технологический процесс изготовления прутков из термопластичных полимеров и их смесей с природными полимерами осуществлялся в два этапа. На первом этапе, с применением измерителя индекса текучести термопластов ИИРТ-АМ, порошки термопластов засыпали в ИИРТ-АМ, нагретый до температуры плавления, которая определялась методом ДСК. После выдержки в течение 1 минуты производили выдавливание материала из камеры через капилляр диаметром 2.08 мм. Первый этап применялся для оценки возможности изготовления полимерных прутков из новых полимерных комбинаций. Второй этап проводился при изготовлении калиброванных прутков в достаточном количестве для работы с 3D-принтером. Изготовление прутка на основе полилактида осуществлялось методом экструзии расплава на экструзионной линии фирмы '^ой^еП".
а Ь
Рис. 7. Образцы тканеинженерных конструкций из полилактида а) диск с ячейками из прутка полилактида, построенный по 3~0-технологии; Ь) образец в форме пенала, построенный из полилактида методом 3~0-печати.
Смесь полимеров была получена смешением 7% растворов полимеров ПЛА с ПГБ в соотношении 1:1 и высушиванием. Методом экструзии расплава на экструзионной линии изготовлен пруток заданного диаметра (1.75+0.05 мм) и длины.
На лабораторной установке ИИРТ-АМ были изготовлены прутки из смеси ПГБ с частицами гидроксиапатита (ГАП). Композиция для изготовления прутка состояла из отечественного полигидроксибутирата (ПГБ), полученного из хлороформного осветленного экстракта биомассы
МеАу1оЬа^епит ехШ^иеш G-10 (вес - 18 г), (г. Пущино, Институт микробиологии РАН) в виде частиц размера 0.5-2 мм и частиц гидроксиапатита в виде тонко дисперсного порошка.
Другой подход изготовления прутка состоял в смешении полимера с частицами гидроксиапатита. Изготовление прутка из композиции ПГБ-ГАП с содержанием частиц гидроксиапатита 20 масс% проводили после предварительного измельчения частиц ПГБ в мельнице ИП-30 и смешения с частицами ГАП. Наполнитель приводит к уменьшению текучести расплава полимера, а продавливание расплава композита проводилось при температуре 180° С.
Новый подход смешения ПГБ с частицами гидроксиапатита состоял в создании водной суспензии ПГБ путём механо-акустической обработки суспензии в РПА. Затем в суспензии ПГБ проводилась реакция образования частиц ГАП по реакции между гидрат-монофосфатом кальция и гидроксидом кальция (по аналогии синтеза коллаген кальций-фосфатных композиций). Механо-акустическая обработка композиции ПГБ-ГАП в воде привела к образованию продуктов синтеза в виде нижнего слоя — осадка, верхнего слоя в виде пены и промежуточного слоя — суспензии из наночастиц. В результате центрифугирования осадка был получен продукт пастообразной композиции ПГБ/ГАП. Методами ТГА и ДСК установлено, что соотношение органического и неорганического компонентов в осадке 80:20
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
масс.%, а зависимость ДСК подтверждает роль влияния частиц гидроксиапатита на термостабильность композиции.
В отличие от синтетических полимеров ПЛА, ПГБ, из которых изготовление прутков и прессованных плёнок проводили при температурах выше 170° С, изготовление прутка из поликапролактона (ПКЛ) осуществляли при температурах экструзии по зонам экструдера 60-80° С. На экструзионной линии был получен калиброванный пруток диаметром 1.7-1.8 мм. Показатель текучести расплава ПКЛ, измеренный на приборе ИИРТ-АМ при условиях 100° С, 2.16 кг составил: 15 г/10 мин; при 80°С — 7 г/10 мин и при 60°С — 2.5 г/10 мин. Для челюстно-лицевой хирургии интерес к поликапролактону обусловлен возможностью изготавливать образцы материалов профильных конструкций при температурах 60-80° С.
Результаты изготовления термопластичных прутков для техники 3D-печати показали необходимость разрабатывать полимерные композиции с необходимыми свойствами текучестирасплавов полимеров. Такимобразом, процесс построения тканеинженерных конструкций связан с совершенствованием техники 3D-печати. Создание терморегулируемой техники 3D-печати, привлечение техники УФ, ИК, СВЧ-излучений при формировании изделий сложной архитектуры методом 3D-печати можно изменять скорость полимеризации и формировать в образцах пористую структуру.
Представленные в работе способы формирования пористых полимерных композитов позволяют создавать пористые биокомпозиты с различной архитектурой. Создание смесевых композиций из природных и синтетических полимеров с неорганическими и органическими соединениями позволяет конструировать широкий спектр биоматериалов различной сложности. Новый подход смешения полимеров различной природы реализован в условиях ультразвукового диспергирования растворов биодеградируемых полимеров
Рис. 8. Фотография электронной микроскопии нетканых образцов, полученных методом (ЭФВ) из растворов а) ПГБ и Ь) ПЛА. Масштаб - 100 мкм.
в хлороформе с коллоидными водными суспензиями и термостимулированного СВЧ-нагрева.
Нетканые пористые плёнки изготовлялись методом электроформования волокон (ЭФВ) из растворов биодеградируемых полимеров (ПГБ, ПЛА, ПКЛ).
На рис. 8 приведены фотоэлектронной микроскопии нетканых образцов, полученных методом ЭФВ из растворов ПГБ и ПЛА. Синтез нетканых образцов материалов из растворов полимеров с неорганическими и органическими компонентами проводился в условиях ультразвукового и механо-акустического диспергирования. Создание многослойных образцов нетканых материалов с различной комбинацией слоёв и построение конструкций на образцах нетканых материалов методом 3D-печати позволило создать пористые конструкции с регулируемой пористостью и временем биорезорбции.
Развиваемые в работе способы формирования пористой структуры в полимерных композитах свидетельствуют о необходимости совмещать различные способы для достижения разветвлённой пористой структуры и требуемых размеров пор в биоматериалах. Совмещение образцов материалов, полученных методом 3D-печати и ЭФВ, является перспективным направлением при изготовлении пористых трёхмерных каркасных конструкций.
6. МЕТОДЫ ИМПЛАНТАЦИИ ПОЛИМЕРНЫХ ОБРАЗЦОВ В ДЕФЕКТ КОСТИ
Исследования эффективности кальций-фосфатных биоматериалов на основе
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
природных и синтетических полимеров в травмотологии и ортопедии проводились с применением методики имплантации образцов в дефект кости черепа in vivo. Методика имплантации включала в себя разрез подготовленного кожного покрова до 2 см и атравматичное разведение мягких тканей до теменных костей, затем формировали два отверстия в костях черепа круглой фрезой диаметром 3.5мм (рис. 9).
Дефект закрывался подготовленным коллаген кальций-фосфатным образцом (КГА-матрица) в данной модели и изучались реакции на границе трансплантата и костной ткани. Также оценивался процесс минерализации трансплантатов. С этой целью использовалась компьютерная томография и гистологические препараты костей черепа.
В препаратах опытной группы на 60-е сутки наблюдалось заполнение области дефекта волокнистой соединительной тканью разной степенью плотности. Изучение токсичности КГА-матрицы проводилось на культуре фибробластов. Поверхность образца способствовала хорошему распластыванию и фиксации клеток. Прикреплённые фибробласты на материале были живыми. Окраска флуоресцентными ядерными зондами Hoechst 33342 через 48 часов после посева клеток на материал показала их полную выживаемость. Причём среди них выявлены клетки в состоянии анафазы и метафазы, что прямо указывает на клеточный рост на образце материала.
Разработанная пористая тканеинженерная конструкция — КГА-матрица, состоящая из биологически естественных для костной ткани
Рис. 9. Схема нанесения дефектов (3.5 мм) в теменных костях крысы круглой фрезой.
материалов коллагена и гидроксиапатита, по процентному содержанию приближена к нативной кости. Технология производства таких конструкций позволяет включать в ее состав лекарственные препараты в зависимости от конкретной клинической задачи. Структура и физико-химические свойства разработанного костного имплантата обеспечивают ему высокие адгезионные свойства для фибробластических клеток. Это способствует активации репаративных процессов в костных дефектах, не препятствуя естественному остеогистогенезу.
Применение разработанной конструкции с включением в её состав антибиотика позволяет ликвидировать гнойно-
деструктивный воспалительный процесс в модели посттравматического остеомиелита с восстановлением костной ткани. Разработанные методики исследования пористых коллаген-кальций-фосфатных
матриц так же применялись при исследовании пористых кальций-фосфатных композиций на основе других природных и синтетических полимеров при замещении костных дефектов.
В результате синтеза гидроксиапатита в суспензии ПГБ получены пасты ПГБ/ГАП с 20% содержанием частиц гидроксиапатита. Из этих композиций изготовлены пленки толщиной 100-200 мкм, прутки для ЗЮ-печати и 2-х слойная тканеинженерная конструкция на основе пористого нетканого материала ПГБ получаемого методом ЭФВ и пасты — ПГБ/ ГАП. Пасты наносилась на нетканый образец материала из ПГБ и высушивались под действием СВЧ-излучения. При подкожной имплантации изготовленных образцов материала отмечена их биосовместимость и отсутствие воспалительных реакций в тканях. Полученные результаты позволили перейти к конструированию сложных тканеинженерных конструкций методом ЗЮ-печати в виде объемный ячеистых структур и заполнению их кальций фосфатными пастами. Методом ЗЮ-печати изготовлены пористые ячеистые образцы, запланировано заполнение ячеек кальций-фосфатными
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
пастами, содержащими морфогенетический белок и другими биоактивными материалами. Медико-биологические испытания образцов биокомпозитов в живых системах позволяют скорректировать способы, состав и условия изготовления конструкций сложной архитектуры. Изготовление биокомпозитов с введением в их состав биологических компонентов из живых организмов позволит стимулировать процесс остеогенеза и восстанавливать процесс замещения дефекта костной ткани.
7. ИЗГОТОВЛЕНИЕ КОСТЕЗАМЕЩАЮЩИХ МАТЕРИАЛОВ C ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА 3D-ПЕЧАТИ
Разработка имплантатов каркасного типа в настоящеевремяявляетсяважнымнаправлением тканевой инженерии. При таком построении, каркас, изготовленный из термопластичного полимера, выполняет роль механической поддержки, и заполняется биоматериалом, выполняющим роль внеклеточного матрикса.
Разработка новых методов и подходов SD-печати костных имплантатов, способных после введения в организм перестраиваться в живую костную ткань, для челюстно-лицевой хирургии и стоматологии являются наиболее востребованными и могут быть реализованы в первую очередь. Дефекты челюстей, образовавшиеся в результате воспалительных и опухолевых процессов, травматических повреждений, удаления зубов, затрудняют реабилитацию больных и протезирование зубов.
В настоящее время для замещения дефектов челюстей используются биоматериалы в виде крошки, блоков и гелей, которые, однако, не способны восстанавливать форму и структуру утраченной кости. Указанные ограничения можно преодолеть с помощью новых подходов компьютерного моделирования и комбинированных методов SD-печати, позволяющих создать костные имплантаты, близкие по своей структуре и биологическим свойствам к живой костной ткани.
В качестве макета в работе по данным компьютерной томографии строили 3D-модель кости с дефектом, на примере нижней челюсти. Для этого использовалась программа ViSurgery. Программными средствами формировалась модель костного имплантата, повторяющего контуры дефекта и восполняющего его объём с формированием внутренней структуры имплантата в виде балочной трёхмерной структуры. На рис. 10 приведен внешний вид 3D-модели нижней челюсти после её разбиения на регулярные ячейки. Печать кортикального (наружного) каркаса имплантата осуществлялась
прутком полилактида. Формирование губчатого (внутреннего) строения модели костного имплантата и челюсти проводили гидроксиапатитовой пастой.
Создание решетчатой структуры позволит разбивать 3D-модель имплантата на решётки (рис. 10), которые в свою очередь повторяют индивидуальную геометрию имплантата для восстановления костного дефекта у пациента и позволяют сохранить прочностные характеристики имплантата после трансплантации. В тоже время пространство между балками сообщается на всём протяжении имплантата, что не будет препятствовать прорастанию сосудов вглубь
Рис. 10. Решётчатая структура нижней челюсти, смоделированная в программном комплексе Inspire.
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
имплантата и ограничивать регенерацию, имитируя естественное строение костной ткани.
Разработка ЗВ-принтера для
комбинированной печати биосовместимыми полимерами (полилактид, полиоксибутират, полигликолид) методом послойного наплавления (FFM) и пастами на основе природных и синтетических компонентов, методом прямой экструзии является инновационным и высоко востребованным подходом к решению проблемы сроков и «качества» восстановления костных дефектов.
В работе в качестве биоматериалов, заполняющих каркас из термопластичного полимера, использовались пасты на основе гидроксиапатита и альгината натрия (ГАП-АН). Паста ГАП-АН была задействована в приготовлении композиций, содержащих биополимеры, обладающие вязко-текучими свойствами, и пригодные для конструирования имплантатов с помощью метода ЗВ-печати. Конструирование имплантатов проводилось послойным нанесением слоёв. Применялись различныекомбинации смешениякомпонентов композиций и построения слоёв изделий. При этом в работе осуществлён новый подход, связанный с применением, в качестве подложки для построения полимерного каркаса, нетканых полимерных материалов. Нетканые полимерных материалы получены методом электроволокнистого формования (ЭВФ). Формование осуществлялось на подложку из нетканого полипропиленового материала с использованием 7%-ного хлороформного раствора полигидроксибутирата (ПГБ). Электропроводность раствора составляла около 9 мкСм/см. Диаметр капилляра 0.1 мм.
Электроформование нетканых волокнистых материалов из ПГБ проводилось с целью изготовления
—подложек для дальнейшего наслоения кальций-фосфатных композиций и построения конструкций имплантатов с применением ЗВ-принтера;
—для электроформования нетканых волокнистых материалов с лекарственными
формами.
Так, на нетканом материале из ПГБ методом ЗВ-печати осуществлялось построение каркаса из полилактида (ПЛА), который затем заполнялся пастообразной водной композицией ГАП-АН. Для исследований поведения биоматериалов в живых системах были изготовлены образцы различной архитектуры:
На рис. 11 представлены расположенные на мембране ПГБ диски из ПЛА, построенные по технологии ЗВ-печати. Создание таких конструкций из двух полимеров, один из которых мембранного типа, открывает новые возможности в производстве искусственных костезамещающих материалов.
Образцы сетчатой (решётчатой)
архитектуры представляются наиболее перспективными для замещения дефектов костной ткани, так как обеспечивается больший доступ клеткам к трёхмерным пористым структурам при формировании новой ткани.
В работе были разработаны композиции, включающие ГАП и биодеградируемые полимеры, пригодные для конструирования имплантатов по технологии ЗВ-печати. Совмещение ГАП с полимерами осуществлялось в условиях ультразвукового диспергирования смесей, с использованием хлороформных растворов ПГБ, ПЛА, и водных суспензий ГАП. Из композиций, включающих ГАП и биодеградируемые полимеры, электроформованием получались соответствующие волокнистые нетканные материалы. Условия электростатического формования волокнистых нетканных материалов не оказывают заметного влияния на
а Ь
Рис. 11. Диски из ПЛА на ПГБ (а,Ь), построенные по 3&-технологии.
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
химическую природу исходных биополимеров. На это, в частности, указывают результаты ИК-спектроскопии — спектры отражения (не обнаруживающих существенных различий между собой) пленок ПЛА, полученных прессованием и электроформованием.
Часть полимерсодержащих композиций перед электроформованием была допирована лекарственной формой — эндоксаном. Идея создания волокнистых нетканных материалов с лекарственными формами связана с необходимостью получения имплантатов, обладающих пролонгированной способностью к подавлению новообразований костной ткани.
Методом 3D-печати образцы из синтетических полимеров послойно конструировали на нетканых образцах из соответствующих полимеров тканеинженерные конструкции. На нетканом волкнистом материале, полученном методом ЭФВ из растворов биодеградируемых полимеров, формируется методом 3D-печати тканеинженерная ячеистая конструкция с заданным размером пор (100-500 мкм), которые заполняются кальций-фосфатными пастами, содержащими природные полимеры и необходимые компоненты. После сборки конструкция высушивается под действием термостимулированного СВЧ-нагрева.
Дляопределенияизмененийбиокомпозитов, происходящих в живых организмах с течением времени, были изготовлены серии образцов на основе биодеградируемых полимеров и кальций-фосфатных паст.
Методами электронной, атомно-силовой и акустической микроскопии установлено, что пластины из полилактида, выдержанные в течение 1-3 месяцев в живых организмах претерпевают изменения. В результате биодеградации происходит уменьшение средней высоты микрорельефа.
При гистологическом исследовании образцов костной ткани, содержащих полимерную трехмерную конструкцию, было выявлено, что среди костного регенерата отчетливо конструируются перемычки и наружная мембрана конструкции, вокруг
которой располагается соединительная и костная ткань регенерата.
Контакт биоимпланта с костной тканью происходил без прослойки соединительной ткани. Соединительная ткань регенераторного типа с признаками очагового остеогенеза соприкасалась с биоимплантом без видимых клеточных реакций, характерных для воспаления. Ретикулофиброзная костная ткань опиралась на биоимплант и распространялась вдоль него. Выселяющиеся из незрелой соединительной ткани клетки предшественники остеобластов формировали остеоид в непосредственной близости от конструкции без существенных признаков угнетения репаративного остеогенеза. Прицельное изучение области контакта соединительной ткани регенеративного типа и материала трехмерной конструкции не выявило выраженной макрофагальной и воспалительной инфильтрации ее. Волокна соединительной ткани проникали в щели материала, что свидетельствует в пользу его гидролитического растворения.
Гистологическое исследование образцов тканей, содержащих трехмерную пластиковую конструкцию, созданную способом трехмерной печати, выявило что биоимплант, из которого произведена конструкция, обладает хорошими опорными функциями для соединительной, костной, грануляционной ткани. Биоимплант не вызывает выраженной воспалительной инфильтрации лимфоцитами, нейтрофилами и гигантскими клетками инородных тел. Резорбция биоимпланта вероятно происходит путем гидролиза, метаболиты, выделяющиеся при этом не оказывают негативного влияния на репаративный остеогенез.
8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в работе разработан синтез наноразмерного гидроксиапатита реакцией обменамежду диаммонийфосфатом и нитратом кальция в условиях механо-акустической обработки реакционной смеси. Предложены способы очистки гидроксиапатита от побочных продуктов. Диспергированием сырья
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
животного происхождения получен белковый гидрозоль, в среде которого осуществлен синтез гидроксиапатита и получен коллаген-кальций-фосфатный композит. Рассмотрены способы формирования пористых коллаген-кальций-фосфатных композитов, среди которых отмечается действие микроволнового излучения.
Показано, что на основе разработанных биокомпозиций: кальций-фосфатных
паст, композиций из термопластичных биодеградируемых полимеров, нетканных волокнистых материалов можно изготавливать тканеинженерные конструкции с регулируемой архитектурой для решения различных медико-биологических задач. Изготовление биокомпозитов с введением в их состав биологических компонентов из живых организмов и лекарственных препаратов позволит стимулировать процесс остеогенеза и восстанавливать процесс замещения дефекта костной ткани.
Создание трёхмерных структур, способных выполнять функции той или иной естественной ткани организма, на основе комбинации клеток и скаффолдов (трёхмерных структур, матрица, каркас), а также других факторов, оказывающих влияние на рост клеток, их дифференцировку и организацию внеклеточного матрикса является важной задачей тканевой инженерии [44-46]. Благодарности
Работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ, проект 18-29-23042.
ЛИТЕРАТУРА
1. Joint European Commission/ETN nanomedicine: roadmaps in nanomedicine towards 2020. Expert Report, 2009, p. 33.
2. Попков АВ. Биосовместимые имплантаты в травматологии и ортопедии (обзор литературы). Тений ортопедии, 2014, 3:94-99.
3. Некачалов ВВ. Патология костей и суставов. Руководство. СПб., Сотис, 2000, 288 с.
4. Авдонин ПВ, Ткачук ВА. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М., Наука, 1994, 288 с.
5. Ткачук ВА. Стволовые клетки и регенеративная медицина. М., Изд. Московского
университета, 2014, 220 с.
6. Мураев АА, Дымников АБ, Короткова НЛ, Кобец КК, Иванов СЮ. Оптимизация метода планирования пластических операций в челюстно-лицевой области. Современные технологии в медицине, 2013, 5(3):57-62.
7. Конышев ВА. Стимуляторы и ингибиторы роста органов и тканей животных. М., Медицина, 1974, 191 с.
8. Терци М. Тенетика и животная клетка. М., Мир, 1977, 291 с.
9. Нейфах АА, Лозовская ЕР. Тены и развитие организма. М., Наука, 1984, 192 с.
10. Свешников АА, Смотрова ЛА, Овчинников ЕН. Механизмы деминерализации костной ткани. Гений ортопедии, 2005, 2:95-99.
11. Лекишвили МВ, Панасюк АФ. Новые биопластические материалы в реконструктивной хирургии. Вестник РАМН, 2008, 9:33-36.
12. Salai M, Brosh T, Keller N, Perelman M, Dudkiewitzet I. The effects of prolonged cryopreservation on the biomechanical properties of bone allografts: A microbiological, histological and mechanical study. Cell and Tissue Banking, 2000, 1(1):69-73.
13. Лекишвили МВ. Технологии изготовления костного пластического материала для применения в восстановительной хирургии: Дисс....докт. мед. наук. М., 2005.
14. Волова ЛТ, Кириленко АГ, Уваровский ББ. Способ стерилизации лиофилизированных костных трансплантатов. Патент РФ 2156139, 1999.
15. Щепкина ЕА, Кругляков ПВ, Соломин ЛН и др. Трансплантация аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на деминерализованном костном матриксе при пластике ложных суставов и костных дефектов. Материалы III Всероссийского симпозиума с международным участием. Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», М., 2007, с. 113.
16. Ершов ЮА, Горшенёв ВН, Косенко НВ. Способ формирования костного имплантата. Патент РФ 2206341, 2002.
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
17. Ершов ЮА, Горшенёв ВН. Коллаген-гидроксиапатитовые имплантаты для ортопедии. Материалы Шеероссийской конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии-2008», М., 2008, с. 127.
18. Hull C. Method for production of three-dimensional objects by stereolithography. US Patent: 4929402, 1990.
19. Bredt JF, Sach E, Brancazio D, Cima M, Curodeau A, Fan T. Three dimensional printing system. US Patent: 5807437, 1998.
20. Landers R, Pfister A, Hubner U, John H, Schmelzeisen R, Mulhaupt R. Fabrication of soft tissue engineering scaffolds by means of rapid prototyping techniques. J. Mater. Sci., 2002, 37(15):3107-3116.
21. Taboas JM, Maddox RD, Krebsbach PH, Hollister SJ. Indirect solid free form fabrication of local and global porous, biomimetic and composite 3D polymer-ceramic scaffolds. Biomaterials, 2003, 24(1):181-194.
22. Sachlos E, Czernuszka JT. Making tissue engineering scaffolds work. Review on the application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineering scaffolds. European Cells Materials, - 2003, 5:29-40.
23. Сафронова ТВ, Шехирев МА, Путляев ВИ, Третьяков ЮД. Керамические материалы на основе гидроксиапатита, синтезированного из растворов различной концентрации. Неорганические материалы, 2007, 43(8):1005-1014.
24. Сафронова ТВ, Кузнецов АВ, Путляев ВИ, Вересов АГ, Иванов ВК. Керамика на основе гидроксиапатита, синтезированного из ацетата кальция и гидрофосфата натрия. Перспективные материалы, 2008, 6:96-99.
25. Синицына ОВ, Вересов АГ, Ковалёва ЕС, Коленко ЮВ, Путляев ВИ, Третьяков ЮД. Получение гидроксиапатита гидролизом a-Ca3(PO4)2. Известия Академии наук. Серия химическая, 2005, 1:78-85.
26. Stevens MM. Biomaterials for bone tissue engineering. Materials Today, 2008, 11(5):18-25.
27. Sun JS, Tsuang YH, Liao CJ, Hang YS, Lin FH. The effect of sintered — dicalcium phosphate particale size on newbom wistar ratosteoblasts.
Atifinal Organs, 1999, 23(4):331-338.
28. Кесель БА, Федоров АД, Гимушин ИФ, Волков ГА, Гатауллин РШ, Воскобойников ДВ, Весельев ДА. Роторно-пульсационный аппарат (РПА). Патент РФ 2166986, 2006.
29. Ковалева ЕС, Филиппо ЯЮ, Путляев ВИ, Третьяков ЮД, Иванов ВК, Силкин НИ, Галиуллина ЛФ, Родионов АА, Мамин ГВ, Орлинский СБ, Салахов МХ. Биорезорбируемые порошковые материалы на основе Ca Na^O^ ^O^ x(OH)2. Ученые записки Казанского униврситета. Серия Естественные науки, 2010, 152(1):79-98.
30. Saenger AT, Kuhs WF. Golden Book of Phase Transitions. Wroclaw, 2002, 1:1-123.
31. Nair LS, Laurencin CT. Polymers as Biomaterials for Tissue Engineering and Controlled Drug Delivery. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol, 2006, 102:47-90.
32. Holland TA, Mikos AG. Biodegradable Polymeric Scaffolds. Improvements in Bone Tissue Engineering through Controlled Drug Delivery. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol, 2006, 102:161-185.
33. Varghese S, Elisseeff JH. Hydrogels for Musculoskeletal Tissue Engineering. Adv Polym. Sci, 2006, 203:95-144.
34. Штильман МИ. Полимеры медико-биологического назначения. М., Академкнига, 2006, 400 с.
35. Берченко ГН. Синтетические кальций-фосфатные материалы в травматологии и ортопедии. Сборник работ Всесоюзной научно-практической конфренции. «Применение искуственных кальциево-фосфатных биоматериалов в травматологии и ортопедии». М., 2010, с. 3-5.
36. Горшенев ВН, Телешев АТ, Ершов ЮА, Казиев ГЗ, Колесов ВВ, Склянчук ЕД. Способ получения пористого костного биокомпозита. Патент РФ 2482880, 2013.
37. Горшенев ВН, Ершов ЮА, Телешев АТ, Склянчук ЕД, Просвирин АА, Григорьев СА. Гидроксиапатитовые биокомпозиты медицинского назначения. Медицинская техника, 2014, 1:30-32.
38. ГОСТ 32244-2013 Субпродукты мясные
МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
обработанные. Технические условия. URL http:// docs.cntd.ru/document/1200107178.
39. Неклюдов АД, Иванкин АН. Коллаген: получение, свойства и применение. М., ГОУ ВПО МГУЛ, 2007, 336 с.
40. Штильман МИ. Полимеры медико-биологического назначения. М., Академкнига, 2006, 400 с.
41. Просвирин АА, Склянчук ЕД, Гурьев ВВ, Горшенев ВН, Телешев АТ, Акатов ВС, Фадеева ИС, Фадеев РС, Шушкевич АМ. Физико-химические свойства и биосовместимость наноструктурированного пористого костного имплантата. Технологии живых систем, 2013, 8:68-73.
42. Вольфкович ЮМ, Сосенкин ВЕ, Школьников ЕИ, Багоцкий ВС. Метод контактной эталонной порометрии. Докл. АН СССР, 1977, 232(3):603-606.
43. Горшенёв ВН, Горшенёва ТД. Приспособление для формирования костных биокомпозитов с открытой пористостью. Патент РФ №143634, 2014.
44. Горшенев ВН, Мураев АА, Телешев АТ, Иванов СЮ. Новые аддитивные технологии формирования сложных костных структур. Материалы IV Междисциплинарного конгресса по заболеваниям органов головы и шеи, Москва, 2016, с. 80.
45. Tortelli F, Cancedda R. Three-dimensional cultures of osteogenic and chondrogenic cells: a-tissue engineering«approach to mimic bone and cartilage in vitro. Eur. Cell Mater., 2009, 17:1-14.
46. Devyatkov ND, Kislov VYa, Kolesov VV, Grachev VI. Diagnostics and correction of the functional state of the human organism with the "Charm"-diagnostic complex, RENSIT, 2018, 10(2):257-268; DOI: 10.17725/ rensit.2018.10.257.
Горшенёв Владимир Николаевич
к.ф.-м.н., с н с.
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
4, ул Косыгина, Москва 119334, Россия
Колесов Владимир Владимирович
к.ф.-м.н, с.н.с.
Институт радиотехники и электроники им.
В.А. Котельникова РАН
11/7 ул. Моховая, Москва 125009, Россия
Краснопольская Лариса Михайловна
д.б.н., с.н.с.
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе
11/1, ул. Б.Пироговская, Москва 119021, Россия
Зиангирова Майя Юрьевна
к.б.н.
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе
11/1, ул. Б.Пироговская, Москва 119021, Россия
Телешев Андрей Терентьевич
д.х.н., проф.,
Московский педагогический государственный университет, Институт Биологии и Химии, 1/1, ул. М.Пироговская, Москва 119991, Россия [email protected]
Просвирин Александр Александрович к.м.н.
Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
20, ул. Делегатская, Москва 127473, Россия [email protected].
Сдано в набор 20.12.2019. Подписано к печати 26.12.2019. Формат 60x88%. Бумага офсетная. Печать цифровая. Печ.л. 15,6. Тираж 10001 экз. Зак.12З Компьютерный набор, верстка, графика, фотоработы — Редакция журнала РЭНСИТ.
