CC BY
27
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 615.32.011.5:616-006-092.9 Ю.А. Борисова1, Г.Б. Смирнова2, Н.В. Андронова3, Н.Т. Райхлин4, Е.М. Трещалина , З.С. Шпрах6 НОВОЫЙ ФИТОАНТИЭСТРОГЕН СЕКОИЗОЛАРИЦИРЕЗИНОЛ 1. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ НА ОПУХОЛЕВЫХ МОДЕЛЯХ IN VIVO
1 Младший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
2К. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
3К. б. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
4Заслуженный деятель науки РФ, д. м. н., профессор, ведущий научный сотрудник, отдел патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
5Д. м. н., профессор, заведующий, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
6К. фарм. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория готовых лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
Адрес для переписки: РФ, 115448, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, лаборатория комбинированной терапии опухолей, Борисова Юлия Александровна, e-mail: ulkabor@yandex.ru.
Представлены результаты экспериментального изучения субстанции нового фитоантиэстрогена секоизо-ларицирезинола на мышах с перевиваемыми опухолями. Секоизоларицирезинол вводили в желудок ежедневно в разовых дозах 250 или 500 мг/кг (суммарно 2,5 г/мг) в течение 5 или 10 дней. На модели эстрогензависимой аденокарциномы молочной железы мышей Са755 РЭ показаны двух-трехкратная задержка роста запущенной опухоли (p < 0,05), сравнимая эффективность с тамоксифеном при десятикратном курсе 50 мг/кг/сут, а также в комбинации с анастрозолом по 10 мг/кг/сут. На внутримышечно трансплантированной меланоме B16/F10 РЭ— секоизоларицирезинол был неэффективен и не стимулировал процесс метастазирования.
Ключевые слова: фитоантиэстроген секоизоларицирезинол, экспериментальное изучение, опухолевые модели.
СЕКО относится к лигнанам и представляет собой растительный антиэстроген полифенольной природы, состоящий из двух пропилбензольных (С3-С6) структурных фрагментов, соединенных между собой атомами С8 и С8' [1; 2].
Антиэстрогенное действие СЕКО, опосредованное активностью главного метаболита лигнанов энтеролактона, предотвращает связывание рецепторов эстрадиола (РЭ) и 17р-эстрадиола, а энтеро-лактон ингибирует передачу пролиферативного сигнала в клетках опухолей РЭ+ [3].
Возможным функциональным прототипом СЕКО является известный антиэстроген тамокси-фен, который используется при РЭ+ раке молочной железы у женщин в менопаузе самостоятельно, одновременно с ингибиторами ароматазы или в комбинации с ними для снижения относительного риска рецидива [4].
Значимое достоверное ингибирующее действие СЕКО выявлено нами при скрининге на модели эстрогензависимой аденокарциномы молочной железы мышей Са755 РЭ+ [5]. Показано, что субстанция СЕКО в разовых дозах 250-500 мг/кг при ежедневном десятикратном введении в желудок реализует воспроизводимый ингибирующий эффект на уровне ТРО 67-76% (р < 0,05) при удовлетворительной переносимости. В результате СЕКО оценен как перспективный для доклинического изучения в качестве отечественного аналога тамоксифена.
В настоящей работе выполнено изучение субстанции СЕКО на эстрогензависимой и эстроге-нотрицательной опухолевых моделях с оценкой
действия на рост запущенной опухоли, процесс метастазирования и сравнительной эффективности с тамоксифеном, в том числе в комбинации с анастрозолом. Соответственно сформулированы цель и задачи исследования.
Цель исследования: экспериментальное изучение основных характеристик фитоантиэстрогена СЕКО на опухолевых моделях у мышей.
Задачи исследования:
1) изучение ингибирующего действия СЕКО на рост запущенной Са755 РЭ+;
2) определение действия СЕКО на процесс метастазирования;
3) сравнительное изучение ингибирующего действия СЕКО и тамоксифена;
4) оценка эффективности комбинированной антиэстрогенной терапии ингибитором ароматазы при включении СЕКО.
Материалы и методы
Животные. Использованы 160 иммуноком-петентных мышей - самок, в том числе 20 особей линии C57Bl6j (доноры опухолевого материала) и 140 особей гибридов BDF1 [C57B16J х DBA2] массой тела 20-21 г. Мышей получали из питомника «Столбовая» ГУ НЦ БМТ и содержали в отделе лабораторных животных «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» при обычном световом дне, на экструзированном корме и постоянном доступе к воде.
Перед началом опытов всех мышей с перевитыми опухолями распределяли по группам
(n = 10), одну группу оставляли без специфического лечения и считали контрольной. Для оценки действия на процесс метастазирования по ЛК использованы ретроспективные данные от здоровых мышей без опухоли (n = 10).
Опухолевые модели. Использованы 2 штамма перевиваемых опухолей мышей (3-4 пассажи) из Банка РОНЦ: аденокарцинома молочной железы Ca755 РЭ+ и эстрогенотрицательная (РЭ) метаста-зирующая в легкие меланома B16/F10 [6-8].
В соответствии с рекомендованными методиками трансплантацию опухолей выполняли мышам-самкам гибридам BDF1 по 40 мг опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды 199 под кожу бока (Са755 РЭ+) или в мышцы правой задней лапки по 1 • 106 клеток на мышь в 0,1 мл питательной среды 199 (B16/F10 РЭ) [9; 10].
Секоизоларицирезинол. Субстанция 3 серий, 29.09.11, 24.10.11 и 24.08.12, получена в виде нерастворимого в воде кристаллического порошка белого цвета с кремовым оттенком при обычных условиях хранения.
Основные характеристики представлены в паспортах, составленных ЗАО "Биохиммак" СТ, Москва.
Для введения мышам к навеске субстанции добавляли приготовленный ex tempore 1 %-ный раствор крахмального клейстера с получением суспензии различных концентраций, которую в объеме 0,2 мл вводили мышам в желудок один раз в сутки ежедневно с помощью металлического зонда.
Проведение лечения. Для проведения монотерапии СЕКО вводили мышам в желудок ежедневно в течение 5 или 10 дней в разовой дозе 250 или 500 мг/кг с сохранением суммарной дозы 2,5 г/кг.
Сроки раннего лечения 3-12 сут, при запущенной опухоли 9-18 сут после трансплантации опухоли. При комбинированном лечении СЕКО вводили мышам первым. Мыши контрольных групп получали 1 %-ный раствор крахмального клейстера в адекватном объеме и режиме.
Препарат сравнения. Использован аптечный тамоксифен в таблетках по 10 мг («Эбеве», Швейцария). Таблетку предварительно растирали в фарфоровой ступке, а затем растворяли в питьевой воде. Мышам тамоксифен вводили в оптимальной разовой дозе 50 мг/кг в желудок ежедневно в течение 10 дней в сроки, адекватные терапии СЕКО [4].
Препарат для комбинации. Использован анастрозол в таблетках по 1 мг (Аримидекс, «Астра Зенека», Великобритания). Таблетки растирали в керамической ступке и разводили в питьевой воде, после чего вводили мышам в желудок в разовой дозе 10 мг/кг ежедневно в течение 10 дней после завершения курса СЕКО без интервала (13-22-е сутки) [4].
Оценка эффективности лечения. У всех мышей после окончания лечения трехкратно определяли размеры опухоли с помощью электронного измерителя и рассчитывали объем по формуле V=a х b х c.
После этого определяли ^р в каждой группе и стандартный показатель эффективности торможение роста опухоли
TPO =
(V 0 - Vk Vk
X 100, где
V0 и W - величина Vср в опыте и в контроле.
В качестве минимального критерия эффективности использовали скрининговое значение ТРО > 50% длительностью не менее 1 нед.
Для расчета показателя эффективности СЕКО в отношении запущенной опухоли использован коэффициент задержки роста опухоли (К), рассчитанный по соотношению относительных объе-
V
мов опухолей V в леченой и контрольной группах [9].
Оценка переносимости воздействия. Проведена по состоянию и поведению мышей в процессе эксперимента, следили за гибелью от токсичности. Павших или умерщвленных мышей подвергали аутопсии для выявления визуальных патологических изменений внутренних органов.
Оценка действия на метастазирование. Исследования выполнены на мышах с внутримышечно трансплантированной меланомой В1б/Р10 РЭ- при наличии или в отсутствие первичного узла, осуществляя введение СЕКО в сроки метастазиро-вания. Для оценки биологической адекватности роста метастазирующей меланомы при внутримышечной трансплантации мышам изучена гистологическая структура и состояние неоангиогенеза в опухоли с использованием моноклональных антител к УБвР, СБ31 и СБ34 («Дако», США). Окрашенные срезы опухоли просматривали в световом микроскопе «Поливар» (Австрия). Первичный узел удаляли под контролем зоны инвазии в пределах здоровых тканей вместе с лапкой на 8 сутки после трансплантации под золетиловым наркозом. Влияние на метастазирование оценивали в сравнении с контролем по выживаемости мышей, а также по ТРО при наличии первичного узла и по ЛК при удалении узла [10]. ЛК рассчитывали с использованием относительной массы легких с метастазами у леченых и контрольных мышей, умерщвленных после верифицированной гибели первой мыши в контроле от метастазов. Использовали ретроспективные данные от здоровых мышей.
Статистическая обработка данных. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считали различия при р < 0,05.
Завершение экспериментов на мышах. Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза, а трупы кремировали в специализированном подразделении РОНЦ с учетом международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных [7].
Результаты и обсуждение
Изучение ингибирующего действия СЕКО
на рост запущенной Са755 РЭ+
Показано, что при исходном объеме У0 = 574 [457^691] мм3 на 9-е сутки после трансплантации СЕКО в разных режимах и дозах существенно замедляет скорость роста опухоли независимо от схемы лечения.
Коэффициент задержки роста опухоли составил К = 1,4-3,2 (250 мг/кг десятикратно) и К = 1,0-1,7 (500 мг/кг пятикратно; рис. 1). Мыши удовлетворительно переносили СЕКО в использованных схемах лечения.
Сутки после трансплантации опухоли
Рис. 1. Действие СЕКО на запущенную Са755 РЭ+.
1 - контроль роста опухоли;
2 - СЕКО 250 мг/кг десятикратно;
3 - СЕКО 500 мг/кг пятикратно.
Результаты изучения СЕКО
при метастазирующей опухоли
При наличии первичного узла. В результате патоморфологического исследования показано, что внутримышечно трансплантированная меланома В16/Б10 РЭ- имеет обычное строение и состоит из полиморфных клеток, среди которых встречаются клетки с митозом и признаками апоптоза. Имеются участки некроза в пределах 5-10% от площади среза. Отмечаются выраженное очаговое развитие кровеносных сосудов, их умеренное полнокровие, небольшие очаги кровоизлияний, инвазия в прилежащую мышечную ткань.
Анализ основных маркеров неоангиогенеза показал, что в срезах опухоли реакция УБвР сильная. Лишь в отдельных участках реакция умеренная или слабая. В эндотелии большинства кровеносных сосудов выявляется сильная реакция СБ34 и СБ31. Эти данные, подтверждающие стандартное строение и васкуляризацию внутримышечно развивающейся меланомы, свидетельствуют об интенсивном кровотоке, определяющем возможность и стандартные сроки метастазирования.
Динамика роста внутримышечной меланомы В16/Р10 РЭ- под действием СЕКО отражена в табл. 1.
Оценка выживаемости мышей показала, что в сравниваемых группах гибель животных наступала практически в одинаковые сроки - на 18-25-е сутки после трансплантации. При вскрытии в обеих группах метастазы в легких обнаружены у 40 и 50% мышей соответственно.
В отсутствие первичного узла. Данные по контролю метастазирования у мышей с удаленной меланомой В16/Б10 РЭ- представлены в табл. 2.
Сравнительное изучение
СЕКО и тамоксифена
Анализ роста опухоли в контрольной группе показал, что Са755 РЭ+ без специфического лечения растет стандартно и достигает к 12-м суткам после перевивки Уер = 1303 [711-1895] мм3, а к 22-м - Уер=10 000 [6436-13564] мм3. На этом фоне показано, что СЕКО в разовой дозе 250 мг/кг или та-моксифен в разовой дозе 50 мг/кг при десятикратном курсе практически одинаково и достоверно
ингибировали рост опухоли, ТРО = 78-79% против ТРО = 72-88% (p < 0,05) соответственно (рис. 2).
Сутки после трансплантации опухоли
Рис. 2. Ингибирование роста Са755 РЭ+ с помощью СЕКО и тамоксифена.
1 - контроль роста опухоли;
2 - СЕКО 250 мг/кг десятикратно;
3 - тамоксифен 50 мг/кг десятикратно.
Результаты изучения комбинации
СЕКО + анастрозол
На мышах с Са755 РЭ+ показано, что в монорежиме СЕКО 250 мг/кг или анастрозол 10 мг/кг при десятикратном курсе оказывали практически равное ингибирующее действие, ТРО = 76 и 73% (р < 0,05) соответственно. Однако на этом уровне эффект отмечали только после окончания введения, а затем он постепенно снижался и к 20-м суткам роста опухоли был ниже минимально значимого - 25 и 2% соответственно. Длительная, в течение 20 дней антиэстрогенная терапия Са755 РЭ+ с последовательным без интервала введением СЕКО и анастрозола десятикратным курсом в приведенных дозах привела не только к повышению, но и к пролонгированию действия: сразу после окончания лечения ТРО = 86-79% (р < 0,05), а на 28-е сутки ТРО = 52% (р < 0,05; рис. 3).
Сутки после трансплантации опухоли
Рис. 3. Результаты изучения комбинации СЕКО и анастрозол; Ca755 РЭ+.
1 - контроль роста опухоли;
2 - СЕКО 250 мг/кг десятикратно;
3 - анастрозол 10 мг/кг десятикратно;
4 - СЕКО 250 мг/кг + анастрозол 10 мг/кг.
Влияние СЕКО на рост меланомы B16/F10 РЭ
Таблица 1
Группа(n =10) Разовая доза Средний объем опухоли (Уср, мм3) на сутки после трансплантации опухоли
8-е 10-е 13-е 15-е
Контроль роста опухоли 0,3 мла 750 [608-892]8 2097 [1767-2427] 3645 [3104-4186] 6124 [4760-7282]
СЕКО 250 мг/кгб 740 [617-863] 2016 [1799-2233] 3671 [3120-4222] 6233 [5542-6924]
а1% раствор крахмального клейстера - разбавитель СЕКО при пероральном введении по адекватной схеме. ^Суммарно 2,5 г/кг в 1% растворе крахмального клейстера ежедневно на 3-12-е сутки после трансплантации. 'Данные представлены как средняя арифметическая [ДИ -95%].
Таблица 2
Показатели метастазирования у мышей с удаленной меланомой В1б/Б10 РЭ под действием СЕКО при ежедневном пероральном введении____
Группаа, n = 10 Разовая доза Средняя масса легких, мг ЛК
Контроль роста опухоли 0,3 мл8 519 [296-742]д 3,0
СЕКО 250 мг/кгг 445 [275-615] 2,6
Здоровые мыши0 - 172 [181-163] 1,0
аВ группе мышей с опухолью метастазирование составило 100%. бИсторический контроль. в1% раствор крахмального клейстера - разбавитель СЕКО при пероральном введении по адекватной схеме. Суммарно 2,5 г/кг в 1% растворе крахмального клейстера ежедневно на 3-12-е сутки после трансплантации. "Данные представлены как средняя арифметическая [ДИ -95%].
Заключение
Таким образом, СЕКО в разовой дозе 250 мг/кг при десятикратном ежедневном введении в желудок в растворе крахмального клейстера проявляет значимый ингибирующий эффект в отношении запущенной Са755 ЭР+ и также эффективен, как тамоксифен при раннем лечении. В указанном режиме СЕКО не стимулирует метастазирование и рост метастазов в легких у мышей с В16/Р10 РЭ-.
При сочетании с анастрозолом последовательное без интервала введение СЕКО дает почти двукратный терапевтический выигрыш по уровню ингибирования и пролонгированию достигнутого эффекта. Применение СЕКО в монорежиме или при комбинированной терапии не сопровождается побочными эффектами.
Авторы выражают благодарность ООО «Медресурс» (РФ, Москва) за финансовую поддержку исследований.
Литература
1. Knots in trees - A new rich source of lignans / Holmbom B., Eckerman C., Eklund P., Hemming J., Nisula L., Reunanen M., Sjoholm R., Sundberg A., Sundberg K., Willfor S. // Phytochem. Rev. - 2003. - Vol. 2. - P. 331-340.
2. Studies on the Metabolism of the Plant Lignans Secoisolariciresinol and Matairesinol / Niemeyer H. B., Honig D. M., Kulling S. E., Metzler M. // J. Agric. Food Chem. - 2003. - Vol. 51. - P. 6317-6325.
3. Enterolactone Inhibits the Growth of 7,12-Dimethylbenz(a) anthracene-induced Mammary Carcinomas in the Rat / Saarinen N. M., Huovinen R., Warri A., Makela S. I., Valentin-Blasini L., Sjoholm R., Ammala J., Lehtila R., Eckerman C., Collan Y. U., Santti R. S. // Mol. Cancer Ther. - 2002. - Vol. 1. - P. 869-876.
4. Xanthopoulos J. M., Romano A. E., Majumdar S. K. Response of mouse breast cancer cell to anastrozole, tamoxifen, and the combinatoion // J. Biomed. Biotechnol. - 2005. - Vol. 1. - Р. 10-19.
5. Результаты скрининга нового фитоантиэстрогена секоизоларицирезинола на гормонозависимой опухолевой модели in vivo / Седакова Л. А., Смирнова Г. Б., Борисова Ю. А., Трещалина Е. М. // Тез. докл. Белорусско-Российской науч.-практ. конф., г. Минск, 23-25 мая 2013 г. - С. 73.
6. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург, 1985 г. // Ланималогия. - 1993. - № 1. - С. 29.
7. Большаков О. П., Незнанов Н. Г., Бабаханян Р. В. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных // Качествен. клин. практ. - 2002. - № ??.- С. ??
8. The field bean protease inhibitor has the potential to suppress B16/F10 melanoma cell lung metastasis in mice / Banerji A., Fer-nandes A., Bane S., Ahire S. // Cancer Lett. - 1998. - Vol. 129, N 1. - P. 15-20.
9. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Трещалина Е. М., Жукова О. С., Герасимова Г. К., Андронова Н. В., Гарин А. М. // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А. Н. Миронова.- ч. 1, гл. 39. - М.: Гриф и К, 2012. - C. 642657.
10. Методические указания по изучению (доклиническому) средств, обладающих способность ингибировать процесс мета-стазирования и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей / Зуева Е. П, Козлов А. М., Герасимова Г. К., Амосова Е. Н., Разина Т. Г., Гольдберг В. Е. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабриева. - 3-е изд. - М.: Медицина, 2005. - С. 674-685.
Поступила 15.01.2014
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
СЕКО - Секоизоларицирезинол; ЛК - легочно-соматический коэффициент; ТРО - торможение роста опухоли; ДИ - доверительный интервал
