CC BY
12024
ВОДНЫЕ РАСТВОРЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
Постерный доклад
НОВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕИНА В КАЧЕСТВЕ РАТИОМЕТРИЧЕСКОГО ЗОНДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
ЭНДОГЕННОЙ HOBr
Григорьева Д.В.1, Горудко И.В.1, Костевич В.А. 23, Горбунов Н.П. 2, Панасенко О.М. 3, Соколов А.В. 2,3
1 Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, Минск, 220030, Беларусь 2 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины», ул. Академика Павлова, 12, Санкт-Петербург, 197022, Россия 3 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства», ул. Малая Пироговская, 1а, Москва, 119435, Россия
Среди активных форм галогенов (АФГ), образующихся в реакциях, катализируемых гем-содержащими пе-роксидазами млекопитающих (миелопероксидазой (МПО), пероксидазой эозинофилов, лактопероксидазой, пе-роксидазином 1), HOCl и HOBr являются наиболее реакционноспособными и играют важную роль в физиологических и патологических процессах. Существуют многочисленные методы регистрации АФГ с использованием флуоресцентных зондов, однако разработка способов избирательной регистрации АФГ, и, прежде всего, HOBr является одной из нерешенных задач. Флуоресцеин - органическое соединение, относящееся к семейству ксан-теновых красителей. Изотиоцианатные производные флуоресцеина используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине в качестве флуорофоров для обнаружения антигенов и антител. Ранее нами было показано, что после взаимодействия с HOBr, а также в системе МПО-Н2О2-Вг флуоресцеин превращается в эозин Y, обладающий флуоресценцией на длине волны 540 нм при ее возбуждении на длине волны 520 нм. Целью настоящей работы явилось исследование возможности использования реакции бромирования флуоресцеина, в результате которой образуется эозин Y, для регистрации продукции HOBr в суспензии нейтрофилов. Показано, что при добавлении в суспензию нейтрофилов в фосфатно-солевом буфере (рН 7,35), содержащем флуоресцеин (5 мкМ) и NaBr (30 мМ), стандартного индуктора активации нейтрофилов форболового эфира РМА (50 нМ) регистрировалось 2,5-кратное увеличение интенсивности флуоресценции на длине волны 540 нм при ее возбуждении на длине волны 520 нм по сравнению с нестимулированными клетками, что свидетельствует о продукции HOBr и образовании эозина Y. Важно отметить, что при активации клеток PMA в отсутствие NaBr в клеточной суспензии на используемых длинах волн возбуждения/регистрации не было выявлено достоверного увеличения интенсивности флуоресценции. Это говорит о том, что в подобранных условиях выявляется именно продукция клетками HOBr. Для оценки вклада других оксидантов, ответственных за преобразования флуорес-цеина в эозин Y в суспензии активированных нейтрофилов, использовали ингибиторы различных ферментных систем (ингибитор сборки и активации НАДФН-оксидазы - DPI, ингибитор МПО - 4-ABAH, ингибитор инду-цибельной NO-синтазы - L-NAME). Индуцированное РМА преобразование флуоресцеина в эозин Y в суспензии нейтрофилов ингибировалось в присутствии 4-АВАН или DPI, подтверждая, что для образования эозина Y в суспензии активированных нейтрофилов важны два аспекта - каталитически активная МПО и респираторный взрыв, как источник Н2О2, необходимого для катализа МПО. L-NAME не оказывал влияния на образование эозина Y в суспензии РМА-активированных нейтрофилов, свидетельствуя о том, что ONOO- не вносит существенного вклада в преобразование флуоресцеина в эозин Y. Таким образом, флуоресцеин представляет собой чувствительный и селективный ратиометрический флуоресцентный зонд (зонд переключения) для детекции HOBr в живых клетках, а также для оценки бромирующей активности МПО и других пероксидаз.
Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грант № 075-15-2022-315 на организацию и развитие Научного центра мирового уровня "Фотоника").
