CC BY
64
50 БИОТЕРАПИЯ
УДК 611.13.16-018:616-006-085:615.849
S. P. Yarmonenko
A NEW PARADIGM FOR COMBINATION ANTIANGIOGEIC-CYTOTOXIC TUMOR THERAPY
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
The analytical review examines the state of antiangiogenic therapy based on VEGF-active agents, which as well as inhibits neoangiogenesis and temporarily normalizes already existing but imperfect tumor vasculature. Understanding molecular and cellular mechanisms of antiangiogenic and traditional cytotoxic antineoplastic agents (ionizing radiation and chemotherapeutic drugs) could facilitate the development of antiangiogenic-cytotoxic therapy of malignant tumors.
Key words: tumors, angiogenesis, antiangiogenic agents, radiation therapy.
С. П. Ярмоненко
НОВАЯ ПАРАДИГМА КОМБИНИРОВАННОЙ АНТИАНГИОГЕННО-ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РАКА
ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Представлен аналитический обзор современного состояния методов антиангиогенной терапии рака с помощью УБОР-активных агентов, с одной стороны, ингибирующих неоангиогенез, а с другой — временно «нормализующих» уже существующую несовершенную васкуляризацию опухолей. Понимание молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия антиангиогенных и традиционных цитотоксических противоопухолевых агентов (ионизирующего излучения и химиотерапевтических препаратов) может способствовать разработке эффективных методов комбинированной антиангиогенно-цитотоксической терапии рака.
Ключевые слова: ангиогенез, антиангиогенные препараты, лучевая терапия опухолей.
ВВЕДЕНИЕ
Рациональная идея, впервые высказанная J. Folkman более 30 лет тому назад [24], о целесообразности разработки средств и методов нарушения васкуляризации опухолей, а следовательно, связанной с этим доставки необходимых для их роста и метастазирования кислорода и питательных веществ, легла в основу новых подходов к лечению рака, обозначенных как антиан-гиогенная терапия (ААТ). Эти принципы сразу же привлекли многих исследователей [1, 58] к поиску антиангиогенных агентов (ААА). Однако, как следует из недавнего обзора Jain [37], самостоятельное клиническое применение отдельных ААА привело лишь к скромному улучшению непосредственных результатов лечения опухолей и не сопровождалось увеличением продолжительности жизни пациентов. В то же
время использование при химиотерапии больных колоректальным раком бевацизумаба (антител, блокирующих образование VEGF — сосудистого эндотелиального фактора роста) увеличило 5-месячную выживаемость [32]. Эти клинические результаты как бы подтверждают ранние предположения о том, что сочетание ААА с химиотерапией или с лучевой терапией должно быть удачным, т. к. при этом повреждаются 2 различных параметра опухолевого роста: цитотокси-ческие агенты непосредственно приводят к гибели злокачественных клеток, а антиангиогенные — опосредованно, лишая их питания [57].
Однако нельзя не обратить внимания на парадоксальность существующей ситуации, ибо вызываемое ААА нарушение васкуляризации опухоли должно ухудшать доставку химиотерапевтических препаратов,
что действительно показано в работе [44], и кислорода, вследствие чего, что также продемонстрировано, ослабляется эффективность лучевой терапии [20, 47].
Как же объяснить этот парадокс, состоящий в существовании диаметрально противоположных экспериментальных и клинических данных, которые перечислены, например, в недавней работе [64], где приведены полученные разными авторами как положительные (аддитивные или синергичные), так и отрицательные результаты комбинированного применения традиционных противоопухолевых средств — химиотерапевтических препаратов и/или ионизирующего излучения в сочетании с ААА?
Для разрешения возникшего парадокса R. K. Jain была предложена новая, альтернативная прежним представлениям, парадигма комбинированной терапии ААА в сочетании с лекарственной и/или лучевой терапией [36]. В ее основу положена гипотеза о том, что ААА способны подавлять рост опухоли, действуя альтернативными путями: угнетая новообразование сосудов, и временно «нормализуя» уже существующую характерную для опухолей ненормальную сосудистую сеть. В период такой «нормализации» улучшается доставка препаратов и кислорода к повреждаемым клеткам опухолей, являющихся мишенями лекарственной и лучевой терапии, что должно неминуемо сопровождаться повышением противоопухолевого эффекта.
Если предложенная парадигма окажется справедливой, то это позволит понять причины противоречивых результатов, полученных при сочетании ААА с традиционными цитотоксическими средствами, ответив тем самым на ключевой вопрос, справедливо названный критическим [37] при оценке перспектив новых подходов, основанных на такой комбинированной антиангиогенно-цитотоксической терапии (ААЦТ).
СТРУКТУРА ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ И ПРИЧИНЫ НЕУДАЧ ТРАДИЦИОННЫХ КОНСЕРВАТИВНЫХ МЕТОДОВ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ
Поддержание роста опухоли требует постоянной доставки питательных веществ и кислорода. Для этого, а также для осуществления метастазирования опухолевых клеток необходима хорошо развитая сосудистая сеть, которая формируется за счет развития существующих сосудов, образования новых (ангиогенеза) и/или рекрутирования (привлечения) эндотелиальных клеток костного мозга (постнатальный ангиогенез) [9]. Образующаяся в результате васкулатура опухоли оказывается неполноценной как в структурном, так и в функциональном отношении. Сосуды легко проницаемы, извиты, расширены и часто сообщаются между собой случайными шунтами. Выстилающие их эндотелиальные клетки морфологически повреждены, перициты (клетки, поддерживающие эндотелий) разрыхлены или отсутствуют, ненормальна и базальная мембрана — обычно утолщена, а иногда отсутствует. В связи с такими ненормальностями кровоток в опухоли становится дезорганизованным
и неравномерным. Кроме того, безудержно пролиферирующие опухолевые клетки дополнительно оказывают давление на кровеносные и лимфатические сосуды.
Перечисленные дефекты сосудистой сети создают в опухоли очаги некроза и участки с патологической микросредой, характеризующиеся интерстициальной гипертензией (вызывающей развитие внесосудистого гидростатического давления), гипоксией и ацидозом. Неполноценный кровоток и интерстициальное давление препятствуют доставке химиотерапевтических препаратов, а недостаток кислорода снижает чувствительность гипоксических клеток опухолей к ионизирующему излучению. К сожалению, опухоль адаптируется к гипоксии и ацидозу, и большое количество ее клеток выживает в этих условиях. Кроме того, гипоксия индуцирует генетическую нестабильность и способствует селекции опухолевых клеток, обладающих высоким метастатическим потенциалом [7]. Наконец, гипоксия и низкие показатели рН способствуют ослаблению цитотоксических свойств иммунных клеток, инфильтрирующих опухоль [37], что также укрепляет ее устойчивость к внешним факторам.
Улучшения результатов лекарственной и лучевой терапии пытаются достичь путем повышения в опухоли концентрации химиотерапевтических препаратов и кислорода, соответственно увеличивая дозы вводимых препаратов или применяя обогащенные кислородом дыхательные смеси. Однако эта многолетняя стратегия не привела к заметным клиническим успехам, что в определенной степени связывают с порозностью сосудистых стенок [31]. Возникающая при этом утечка плазмы вызывает интерстициальную гипертензию и даже временную задержку кровотока.
В совокупности с описанными выше повреждениями в системе доставки образуется некий порочный круг, в принципе создающий непреодолимые препятствия поступлению любых, в т. ч. и высоких, концентраций химиотерапевтических препаратов и кислорода. Именно с этим в большой степени связаны неудачи стратегии традиционных методов консервативной терапии рака.
Как же разорвать существующий порочный круг? Очевидно, что если улучшить систему доставки, то большое количество клеток, в т. ч. и находящихся в ишемических участках опухоли, получит необходимые концентрации химиотерапевтических препаратов и кислорода при стандартных условиях лечения без увеличения вводимых доз и концентрации кислорода. Именно в этом состоит рациональность новой терапевтической парадигмы, которая в отличие от прежней стратегии базируется не на тотальном увеличении количества препаратов и кислорода, а на распределении их необходимых концентраций в небольших фракциях гипоксических клеток.
«НОРМАЛИЗАЦИЯ» ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ ОПУХОЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ААА
В свете новой парадигмы ААТ под «нормализацией» васкуляризации (НВ) опухолей понимают способы
реконструирования (исправления) уже существующей сосудистой сети с целью приблизить ее к кровоснабжению нормальных тканей. В обычных условиях функционирование системы стимуляторов ангиогене-
за, часто представленных сосудистым эндотелиальным фактором роста (vascular endothelial growth factor — VEGF), контрбалансируется ингибиторами ангиогенеза, такими как тромбоспондин-1, причем этот баланс, как, впрочем, и при патологическом ангиогенезе, направлен в сторону стимуляции [35]. Однако при патологическом ангиогенезе периодически происходит разбалансировка этого процесса. Поэтому восстановление баланса должно приближать сосудистую сеть опухоли к нормальному типу.
Можно было бы предположить, что улучшение доставки кислорода и питательных веществ в период НВ будет способствовать росту опухоли. Однако ни в экспериментальных условиях, ни в клинике при монотерапии ААА этого не наблюдалось, что объясняют несколькими причинами [37]:
1. ААТ одновременно сопровождается сокращением количества сосудов (густоты сети), что способствует регрессии опухоли. Кроме того, нормализации подвержены далеко не все сосуды из-за различий в их зрелости, в связи с чем в разных регионах опухоли различается варьирующий во времени баланс про-и антиангиогенных молекул. Поэтому НВ в одном участке может сопровождаться ее подавлением в другом. Препятствует росту опухолевой массы и происходящее при ААТ угнетение неоангиогенеза.
2. Не получила подтверждения и интуитивно ожидаемая возможность роста опухоли в связи с усилением пролиферации опухолевых клеток в участках НВ. Более того, активно делящиеся клетки становятся более чувствительными к облучению и многим химиотерапевтическим препаратам.
3. Известно, что гипоксия способствует гибели клеток, поэтому ее уменьшение должно было бы ускорять рост опухоли; однако возрастает количество данных о том, что гипоксия, напротив, промотирует прогрессию рака. Эти два разнонаправленных эффекта ААТ нивелируют друг друга.
4. В некоторых опухолях выживаемость злокачественных и эндотелиальных клеток зависит от одних и тех же ангиогенных факторов (VEGF); в этих случаях под влиянием ААА могут погибать как опухолевые, так и эндотелиальные клетки.
По совокупности высказанных соображений возможность некоторого ускорения роста опухолей вследствие НВ предположительно маскируется опосредованной и прямой гибелью злокачественных клеток под влиянием ААА [37]. Поэтому не удивительно, что при ААТ в клинике, несмотря на выраженное уменьшение микроциркуляции, регрессия опухолей происходит весьма слабо [63].
Если бы мы располагали идеальными ААА, способными полностью ингибировать кровоснабжение опухолей без повреждения нормальных сосудов, то отпала бы необходимость в цитотоксической терапии.
К сожалению, таковые пока отсутствуют. Желаемого эффекта и полной регрессии опухоли можно было бы достичь увеличением дозы доступных ААА, но при этом возникает угроза нарушения васкуляризации жизненно важных органов, включая сердечно-сосудистую, эндокринную и нервную системы [9]. Действительно, повышение дозы бевацизумаба приводит к увеличению риска побочных эффектов, в частности артериальной тромбоэмболии [50]. Кроме того, интенсивная регрессия сосудов непродуктивна еще и потому, что может скомпрометировать доставку химиотерапевтических препаратов и кислорода. Действительно, сверхоптимальные дозы ААА снижают оксигенацию и доставку препаратов, а потому уменьшают эффективность лекарственной [44] и лучевой [47] терапии.
Все это свидетельствует о необходимости соблюдения деликатного баланса при управлении нормализацией и регрессией васкуляризации опухоли и необходимости оптимизировать ААТ путем выбора рациональных доз и разработки режимов ее применения в сочетании с традиционными цитотоксическими методами лечения.
Рассмотрим некоторые возможности осуществления нормализации кровоснабжения опухолей с помощью ААА.
Из всех известных ангиогенных молекул наиболее критической является опухолевый цитокин VEGF (известный также как VEGF-A), который рассматривается как мишень для диагностики и лечения [9, 16, 21]. VEGF способствует выживаемости и пролиферации эндотелиальных клеток, повышает их адгезивную способность и проницаемость сосудов. В большинстве солидных опухолей наблюдается гиперэкспрессия VEGF, поэтому для обеспечения НВ необходим постоянный контроль уровня VEGF. Действительно, блокирование VEGF приводит к пассивному сокращению существующих зрелых сосудов перевивных опухолей мышей и активации ремоделирования оставшейся сети таким образом, что она приближается к характерной для нормальных тканей. «Нормализация» выражается в уменьшении извилистости и проницаемости сосудов, расширении их диаметра, приближении к нормальной толщине базальной мембраны и укреплении перицитарного покрытия. Происходящие морфологические изменения сосудов приводят к функциональному совершенствованию кровоснабжения — снижению интерстициального давления, улучшению проникновения препаратов в эти участки опухоли и повышению их оксигенации, что сопровождается повышением эффективности химиотерапии [31, 34,
38, 59, 64, 65], а также лучевой терапии [41, 42, 46, 57,
60, 64]. Период времени, в течение которого происходят изменения васкуляризации опухоли, обозначили термином «нормализационное окно» [64]. Положительные результаты блокирования VEGF в сочетании с лекарственной и лучевой терапией получены и в клинике при лечении пациентов по поводу колоректального рака [63].
ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОЙ АНТИАНГИО-ГЕННО-ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ
Разработка оптимальных режимов ААЦТ, имея в виду концентрации ААА, а также временные параметры их применения, нуждается в понимании физиологических, патогенетических, клеточных и молекулярных механизмов их взаимодействия с состоянием кровоснабжения опухолей, определяющим возможности доставки кислорода и лечебных препаратов. Именно этим актуальным вопросам посвящены 3 недавних обзора [37, 60, 64].
В работе, выполненной в отделе радиационной онкологии Массачусетского госпиталя [64], на модели растущей у мышей глиобластомы человека четко показано, что после применения DC101 (специфического антитела, блокирующего VEGFR2) возникает временное «нормализационное окно», во время которого происходит увеличение оксигенации опухоли, благодаря чему проводимая в этот период лучевая терапия дает наибольший результат. Авторами продемонстрировано, что именно в этот период времени, но никак не до и не после него снижается опухолевая гипоксия, происходит укрепление перицитарного покрытия опухолевых сосудов, а также нормализация патологически утолщенной сосудистой базальной мембраны.
При изучении молекулярных механизмов действия DC101, обеспечивающих НВ при блокировании VEGFR2, показано [64], что в рекрутировании перицитов, играющем ключевую роль в этом процессе, преимущественное медиаторное значение приобретает участие клеточного ангиопоетина-1, который, как известно, снижает проницаемость сосудов гематоэнце-фалического барьера [42]. Нормализация же базальной мембраны при блокаде VEGFR2 происходит вследствие активации матриксных металлопротеиназ.
Монотерапия с использованием DC 101 (40 мг/кг на 0, 3 и 6-й день) вызывала незначительную задержку роста опухоли (« 2,5 дня). Фракционированное у-облу-чение в разовой дозе 7 Гр, производимое в течение 3 последовательных дней, вызывало более длительную задержку роста (« 12,5 дня). Если DC101 применяли в сочетании с 4 режимами такого вида лучевой терапии, проводившейся не в оптимальные периоды времени (с 9-го по 7-й или со 2-го по 0-й день до начала введения DC101 либо с 1-го по 3-й или с 7-го по 9-й день после него), то эффект комбинированной терапии был не более чем аддитивный. И лишь при облучении в интервале времени 4-6 дней после применения DC101, т. е. в период «нормализационного окна», проявился выраженный синергический эффект — задержка роста опухолей оказалась сверхаддитивной и превысила 20 дней.
Таким образом, построение оптимального режима ААЦТ требует знания времени проявления индуцируемого тем или иным ААА «нормализационного окна». Очевидно, что этот период весьма кратковременный:
в приведенном примере он составил всего 3 дня через строго определенное время после начала ААТ.
Эффективность ААТ и, особенно, комбинированной ААЦТ зависит также от дозы ААА. При этом следует помнить о возможной токсичности применяемых средств для нормальных тканей. Так, согласно Baffert и соавт. (цит. по R.K. Jain [37]) в экспериментах на мышах многие попытки блокирования VEGF вызывали регрессию нормальных сосудов трахеи и щитовидной железы. В клинике пока не отработаны дозы ААА, гарантирующие отсутствие побочных эффектов. В том же обзоре [37] приведены 2 клинических примера о проявлении негативных последствий: высокие дозы (10 мг/кг каждые 2 недели) бевацизумаба при лечении рака почки привели к развитию у пациентов гипертонии и протеинурии, а согласно [50] и при меньших (5 мг/кг) дозах препарата, но в сочетании с химиотерапией, возрос риск кардиоваскулярных проблем, приводивших даже к летальному исходу.
Наконец, при разработке подходов к практическому применению новой парадигмы ААТ следует учитывать индивидуальный ответ разных опухолей и даже одной и той же опухоли на разных стадиях развития.
Все это делает рациональной постановку вопроса о комбинированном применении ААА в виде своеобразных коктейлей, влияющих на известные патогенетические пути управления ангиогенезом на разных временных этапах, начиная от зарождения ангиоген-ных молекул [37].
Таким образом, существенным ограничением на пути успешной терапии рака в рамках рассматриваемой парадигмы является необходимость знания индивидуального ангиогенного профиля конкретной опухоли, применительно к которому должен создаваться специальный коктейль ААА. Определенные возможности в этом направлении, на наш взгляд, может представить ААЦТ с использованием нетоксичных ААА, а также включение их в коктейли с уже апробированными ААА (возможно, в меньших дозах), причем не только с целью повышения терапевтического эффекта, но и для продления периода нормализационного окна.
ПРИРОДНЫЙ ИНГИБИТОР АНГИОГЕНЕЗА — ПРЕПАРАТ АЕ-941 (НЕОВАСТАТ, КАРТСЕЛЬ)
Биологически активные вещества, подавляющие ангиогенез, впервые были обнаружены в хрящевой ткани. Проведенные эксперименты показали, что фрагменты хряща, имплантированные на хориоаллан-тоисную оболочку эмбриона цыпленка, проявляют резистентность к инвазии васкуляризированной мезенхимой носителя [18]. Эта антиангиогенная активность сохранялась в водном экстракте из хрящевой ткани, что указывало на присутствие в хряще водорастворимых ингибиторов ангиогенеза [55].
Эти наблюдения легли в основу производства препарата АЕ-941, природного ААА, выпускаемого (Aeterna Laboratories, Канада) в 2 формах: в виде лекарственного препарата неовастат (Н) и биологически
активной пищевой добавки картсель [15]. Обе формы содержат одно и то же действующее начало (АЕ-941) в эквивалентной концентрации.
Схема получения Н включает в себя гомогенизацию акульего хряща и последующий отбор фракции с молекулярной массой компонентов менее 500 кДа [15]. Таким образом, Н представляет собой не препарат хряща, а экстракт, в котором удалено до 95 % нерастворимых веществ [27]. Н производят и тестируют на оборудовании, соответствующем современным фармацевтическим стандартам (Good Manufacturing Practice). Контроль качества препарата проводят, используя общепринятые мировые стандарты: физико-химические и микробиологические показатели, химическую идентификацию, молекулярные параметры и биологическую активность.
В настоящее время механизмы действия, безопасность и эффективность Н достаточно полно изучены в экспериментальных исследованиях и в клинических испытаниях I-III фазы.
Н ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток (ЭК) in vitro, но не оказывает значительного воздействия на мышечные клетки и фибробласты кожи человека. Антиангиогенная активность препарата проявляется также угнетением неоваскуляризации в ex ovo хориоаллантоисной оболочке цыпленка, а также ингибированием неоваскуляризации, вызываемой in vivo так называемыми имплантантами Мартигеля. Исследования показали, что Н характеризуется биодоступностью при пероральном применении [14].
Механизм антиангиогенной активности Н состоит по меньшей мере из 4 компонентов: ингибирования сигнальных путей VEGF, индукции апоптоза ЭК, угнетения активности специфических матриксных метал-лопротеиназ и стимуляции ферментной деятельности тканевого активатора плазминогена.
Ингибирование сигнальных путей VEGF. Образование новых кровеносных сосудов (неоангиогенез) происходит в основном за счет пролиферации и миграции ЭК. Эти процессы индуцируются ангиогенными стимуляторами, такими как VEGF и основной фактор роста фибробластов (bFGF — basic Fibroblast Growth Factor) [11, 12, 39]. VEGF специфично связывается на поверхности ЭК с рецепторами семейства тирозинки-назы: fms-подобной тирозинкиназы (Flt-1 или VEGFR-1) и фетальной печеночной киназы-1 (Flk-1/KDR или VEGFR-2) [38]. Связывание VEGF с VEGFR-2 инициирует фосфорилирование тирозина в некоторых ключевых сигнальных интермедиатах [45], которые, по-видимому, служат причиной возникновения большинства митогенетических [61], хемотаксических [52], антиапоптических [26] эффектов и повышения сосудистой проницаемости, обусловленных VEGF.
Н существенно влияет на механизм ангиогенеза, протекающего с участием VEGF. В препарате аортального кольца крысы — модели ангиогенеза ex vivo — Н ингибировал VEGF-зависимое разрастание ЭК, подавляя как пролиферацию, так и миграцию клеток [4]. В этой же работе показано, что введение Н в желудок
приводит к уменьшению повышенной проницаемости кровеносных сосудов, вызываемой VEGF. Эффект воздействия Н на VEGF-связывание коррелировал с заметной редукцией VEGFR-2-опосредованного фосфо-рилирования тирозина при отсутствии влияния на активность VEGFR-1. Эти данные показывают, что Н содержит компоненты, влияющие на функцию VEGFR-2, что приводит к ингибированию VEGF-опосредованных сигнальных путей.
Индукция апоптоза эндотелиальных клеток. Отличительным признаком ААА является их способность избирательно индуцировать апоптоз только эндотелиальных клеток [13]. В экспериментах c клетками быка и человека, предварительно обработанными
Н, наблюдали гибель исключительно ЭК, тогда как клетки других типов оставались интактными. При этом замечено, что индуцированный Н апоптоз ЭК заметно подавлялся zVAD-fmk — ингибитором ка-спаз широкого спектра действия, что предполагает участие каспаз в этом процессе. Было обнаружено, что Н индуцирует апоптотическую гибель клеток путем повышения активности каспазы-3 и каспазы-8, что коррелирует с фрагментацией ядра и выбросом цитохрома с из митохондрий в цитоплазму [6].
Ингибирование действия матриксных металло-протеиназ. Установлено, что одним из важнейших компонентов механизма образования метастазов является разрушение мембранных барьеров и окружающего межклеточного матрикса (ОВМ). Этот процесс включает в себя активацию внеклеточных протеаз семейства матриксных металлопротеиназ — многодоменных цинкзависимых эндопептидаз [25, 48]. Описано около 25 членов этого семейства, всем ферментам дана полная характеристика, главным образом в отношении их специфичности к протеинам ОВМ [8, 40, 54]. Показано, что совместным действием ММР способны разрушать все молекулярные компоненты ОВМ, выполняя важнейшую роль в процессах инвазии опухоли и ангиогенеза [56]. Во внеклеточной среде активность ММР контролируется тканевыми ингибиторами матриксных металлопротеиназ (TIMP), семейством протеиназ, состоящих из 4 компонентов (TIMP 1-4), действующих как эндогенные ингибиторы ММР, защищающие компоненты ОВМ от деградации [17].
В исследованиях с применением люминесцентного анализа и метода субстрат-гель-зимографии Н значительно угнетал активность ММР-2, оказывая менее выраженное ингибирующее влияние на ММР-1, -7, -9 и -13. Хотя молекулярные компоненты, определяющие угнетение активности ММР, не были идентифицированы по биохимическим показателям, ингибирующая активность зависела от присутствия в Н молекул типа TIMP, показывая, что именно эти молекулы оказывают определенное влияние на процесс ингибирования ММР [30].
Стимуляция тканевого активатора плазминогена. Тканевый активатор плазминогена (tissue Plasminogen Activator — tРА) специфично конвертирует циркулирующий плазминоген в активный протеи-
назный плазмин путем разрыва пептидной связи Arg561-Val562 [43]. Плазмин — это трипсиноподобная протеаза с широкой специфичностью, способная расщеплять большинство компонентов ОВМ либо напрямую, либо посредством активирования ММР или эластаз [49].
Роль tPA в механизме ангиогенеза до конца не выяснена. Вместе с тем известно, что tPA служит ключевым ферментом фибринолиза благодаря своей способности ускорять трансформацию плазминогена в плазмин, что приводит к деградации фибрина [43]. Не вполне ясно, каким образом эта фибринолитичес-кая активность влияет на процесс ангиогенеза. Вместе с тем показано, что высокий уровень tPA коррелирует с позитивным прогнозом при различных опухолях [10, 23], тогда как сниженное содержания tPA ассоциируется с малигнизацией опухоли [53]. Исходя из этого, было выдвинуто предположение, что стимуляция образования плазмина под влиянием tPA может индуцировать расщепление проангиогенного матрикса фибрина, что в конечном итоге ведет к торможению ангиогенеза [51].
Недавние исследования показали, что под влиянием Н значительно увеличивается образование tPA-зависимого плазмина in vitro. Аналогичный эффект наблюдали in vivo: у животных с привитой глиобласто-мой человека введение Н приводило к заметному повышению уровня tPA [29].
Противоопухолевые и антиметастатические свойства Н в эксперименте. Непрерывный прием Н в значительной степени угнетает рост опухолей мышей, что проявляется значительным дозозависимым уменьшением объема опухолей [14]. Более того, мыши с экспериментальной глиобластомой, получавшие Н, жили значительно дольше контрольных животных, которым не вводили Н [5], что хорошо согласуется с данными о замедлении темпов процесса опухолевой не-оваскуляризации. При введении Н per os мышам с карциномой легкого Льюис на 70 % уменьшилось количество метастазов [14]. На этой же модели показано, что применение Н в сочетании с однократным введением цисплатина в субоптимальной дозе способствовало большему угнетению метастазирования по сравнению с результатами при введении только цисплатина. Более того, при таком сочетании улучшалось соотношение эффективность/токсичность цисплатина [62]. Эти данные свидетельствуют о потенциальной ценности сочетанного применения Н с химиотерапевтическими препаратами.
Клинические испытания неовастата. В ходе клинических испытаний Н (фазы I-II) препарат получали пациенты с рефрактерными опухолями простаты, легких и почек. Основной целью этих исследований была оценка безопасности применения Н и определение оптимальной дозировки для клинических испытаний III фазы. Неовастат хорошо переносился больными при дозах 30-240 мл/сут. При такой дозировке не отмечено ни одного случая дозозависимой токсичности, летального исхода или существенных отклонений лаборатор-
ных показателей, что позволило оценить профиль безопасности Н как безупречный.
Н получали 48 пациентов с рефрактерным раком простаты. Анализ эффективности показал, что у 38 % пациентов либо улучшились, либо не ухудшились показатели PSA более чем на 25 %. Столь выраженный эффект наблюдали у 42 % больных, получавших самые высокие дозы препарата, и у 20 % больных, получавших самые низкие дозы [33].
При обследовании 48 пациентов с немелкоклеточным раком легких с целью изучения влияния дозировки на эффективность лечения среднее время жизни увеличилось на 33 % (6,15 мес. против 4,63 мес.; ^=0,026). Относительный риск смерти пациентов, получавших Н в дозе более 2,63 мл/кг/сут (что соответствует примерно 180 мл/сут при массе тела 70 кг), снизился на 50 % по сравнению с группой пациентов, получающих менее 2,63 мл/кг/сут [19].
При проведении клинических испытаний у 22 больных метастатической гипернефромой среднее время жизни у 14 пациентов, получавших Н в дозе 240 мл/сут, было значительно выше, чем у 8 пациентов, получавших 60 мл/сут (16,3 мес. против 7,1 мес.; £=0,01) [3].
Проведены клинические испытания фазы III с применением Н у пациентов с немелкоклеточным раком легких. Наблюдали 302 больных в 50 центрах США, Канады и Европы. В исследование были включены пациенты с местнораспространенными и диссеминированными опухолями, резистентными к системной иммунотерапии и химиотерапии. У больных с относительно благоприятным прогнозом при применении высоких доз препарата удалось достичь более чем 2-кратного увеличения медианы продолжительности жизни. При неблагоприятном прогнозе отмечено существенное улучшение качества жизни [28].
В настоящее время безопасность и эффективность применения Н изучается в клинических испытаниях фазы III у 760 пациентов с вновь установленным диагнозом немелкоклеточного рака легких стадии IIIA и IIIB в 50 исследовательских центрах Канады и США. Больные получают Н или плацебо в сочетании с химио- и/или лучевой терапией. Исследование начато в апреле 2000 г., результаты станут известны по окончании 2005 г. Аналогичные клинические испытания фазы III проводятся в 50 центрах Европы, Канады и США у 302 больных с прогрессирующей гипернефромой. Начато изучение Н при опухолях молочных желез, головного мозга и лейкозах.
ПЕРСПЕКТИВЫ КОМБИНИРОВАННОЙ ААЦТ
Являясь относительно новым подходом к лечению рака, ААТ обладает рядом преимуществ по отношению к стандартным видам цитотоксической терапии. Во-первых, ААА избирательно воздействуют на генетически устойчивые клетки, что определяет значительно меньшую вероятность развития резистентности [40]. Во-вторых, изученные к настоящему времени
ААА очень редко вызывают побочные эффекты (за исключением неспецифичных ингибиторов ММР и VEGF-нацеленных препаратов). Так, более чем у 800 пациентов, принимавших Н на протяжении 4 лет, не было зафиксировано ни одного случая токсичности. В-третьих, действие ААТ направлено не на опухолевые клетки, а на кровоснабжение опухоли, что позволяет рассчитывать на положительные результаты при опухолях, резистентных к лучевой и химиотерапии. И наконец, неразрывная связь развития как солидных, так и жидких опухолей с ангиогенезом предполагает широкую область применения ААТ при лечении самых различных видов опухолей.
Анализируя сравнительную эффективность применяемых ААА, следует отметить, что практически все они воздействуют не более чем на 1-2 компонента многоступенчатого механизма опухолевого ангиогене-
за. В этом аспекте Н выгодно выделяется своим муль-тифокусным влиянием на все 4 компонента указанного процесса: препарат ингибирует сигнальные пути VEGF, индуцирует апоптоз ЭК, угнетает действие MMP и стимулирует активность tPA. С этих позиций Н может рассматриваться как своего рода эквивалент «антиангиогенного коктейля», действующего на разных стадиях механизма опухолевого ангиогенеза.
Наиболее перспективным должно быть комбинированное применение Н или нескольких ААА в сочетании с традиционными цитотоксическими средствами лечения рака — лучевой и лекарственной терапией. Нами получены вполне обнадеживающие предварительные данные о существенном усилении радиационного поражения двух видов перевивных опухолей мышей при их облучении на фоне применения Н [2]. Дальнейшие исследования по разработке режимов ААЦТ, имея в виду временные и дозовые параметры используемых агентов, а также по выделению активных ингредиентов Н, должны быть полезны как для клинической практики, так и в плане получения конкретной информации об оптимальном составе антиан-гиогенных коктейлей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Горбунова В. А. Новые направления в лекарственном лечении злокачественных опухолей: опухолевый ангиогенез и антиангиогенные препараты // Мед. радиология и радиационная безопасность. —
2003. — Т. 48, № 6. — С. 29-42.
2. Ярмоненко С. П., Вайнсон А. А., Мещерикова В. В., Ярмоненко С. С. Антиангиогенная терапия рака и первые результаты применения природного ингиби-тра ангиогенеза Картселя при лучевой терапии перевивных опухолей мышей // Мед. радиология. — 2005.
— 49, № 6. — В печати.
3. Batist G., Patenaude F., Champagne P. et al. Neovastat (AE-941) in refractory renal cell carcinoma patients: report of a phase II trial with two dose levels // Ann. Oncol. — 2002. — Vol. 13. — P. 1259-1263.
4. Beliveau R., Gingras D., Kruger E. A. et al. The antiangiogenic agent Neovastat (A/E-941) inhibits vascu-
lar endothelial growth factor-mediated biological effects // Clin. Cancer Res. — 2002. — Vol. 8. — P. 242-1260.
5. Berger F., Jourdes P., Benabid A. L. AE-941 (Neovastat) induces the expression of angiostatin in experimental glioma // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. — 2001. — Vol. 42. — P. 724-731.
6. Boivin D., Gendron S., Beaulieu E. et al. The antiangiogenic agent Neovastat (AE-941) induces endothelial cell apoptosis // Mol. Cancer Ther. — 2002. — Vol. 1. — P. 795-802.
7. Bottaro D. P., Liotta L. A. Cancer: OUT of air is not out of action // Nature. — 2003. — Vol. 423. — P. 593-595.
8. Cao Y. Endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic implications // Int. J. Biochem. Cell Biol.
— 2001. — Vol. 33. — P. 357-369.
9. Carmeliet P., Jain R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases // Nature. — 2000. — Vol. 407. — P. 593-595.
10. Chappuis P. O., Dieterich B., Sciretta V. et al. Functional evaluation of plasmin formation in primary breast cancer // J. Clin. Oncol. — 2001. — Vol. 19. — P. 2731-2738.
11. Connolly D. T., Heuvelman D. M., Nelson R. et al. Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis // J. Clin. Invest. — 1989. — Vol. 84. — P. 1470-1478.
12. Connolly D. T., Stoddard B. L., Harakas N. K., Feder J. Human fibroblast-derived growth factor is a mitogen and chemoattractant for endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1987. — Vol. 144.
— P. 705-712.
13. Dimmeler S., Zaiher A. M. Endothelial cell apoptosis in angiogenesis and vessel regression // Circ. Res. —
2000. — Vol. 87. — P. 434-439.
14. Dupont E., Falardeau P., Mousa S. A. et al. Antiangiogenic and antimetastatic properties of Neovastat A/E 941), an orally active extract derived from cartilage tissue // Clin. Exp. Metast. — 2002. — Vol. 19.
— P. 145-153.
15. Dupont E., Brazeau P., Juneau C. Extracts of shark cartilage having an antiangiogenic activity and an effect on tumor progression: process of making thereof // US Patent 5.618.925 (1997).
16. Dvorak H. F. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy // J. Clin. Oncol. — 2002. — Vol. 20. — P. 4368-4380.
17. Edwards D. R. The tissue inhibitors of metallopro-
teinases (TIMPs). In: Matrix metalloproteinases.
Inhibitors in Cancer Therapy / N. J. Clendeninn, K. Appelt (eds.). — Totowa, NJ: Humana, 2001. — P. 67-84.
18. Eisenstein R., Sorgente N., Soble L. W. et al. The resistance of certain tissues to invasion: penetrability of explanted tissues by vascularized mesenchyme // Am. J. Pathol. — 1973. — Vol. 73. — P. 765-774.
19. Falardeau P., Champagne P., Poyet P. et al. Neovastat, a naturally occurring multifunctional antian-
giogenic drug, in phase III clinical trials // Semin. Oncol.
— Vol. 28. — P. 620-628.
20. Fenton B. M., Paoni S. F., Ding I. // Radiother. Oncol. — 2004. — Vol. 72. — P. 221 (uht. no [3]).
21. Ferrara H., Hilan K. J., Gerber H. P., Novotny W. Discovery and development of bevacizumad, an anti-VEGF antibody for treating cancer // Nat. Rev. Drug Discov. — 2004. — Vol. 3. — P. 391-400.
22. Ferrara N., Gerber H. P. The role of vascular endothelial growth factor in angeogenesis // Acta Haematol. — 2001. — Vol. 106. — P. 148-166.
23. Ferrier C. M., Susiu S., van GeloofW. L. et al. High tPA-expression in primary melanoma of the limb correlates with good prognosis // Br. J. Cancer. — 2000.
— Vol. 83. — P. 1351-1359.
24. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications // N. Engl. J. Med. — 1971. — Vol. 285. — P. 1182-1186.
25. Forget M.-A., Desrosiers R. R., Beaulieu R. Physiological roles of matrix metalloproteinases: implications for tumor growth and metastasis // Can. J. Physiol. Pharmacol. — 1999. — Vol. 77. — P. 465-480.
26. Gerber H. P., McMurtrey A., Kowalski J. et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3’-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Fk-1/KDR activation // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 273. — P. 30336-30343.
27. Gingras O., Renaud A., Mousseau N., Beliveau R. Shark cartilage extracts as antiangiogenic agents: smart drinks or bitter pills? // Cancer Metast. Rev. — 2000. — Vol. 19. — P. 83-86.
28. Gingras D., Batist G., Beliveau R . AE-941 (Neovastat): a novel multifunctional antiangiogenic compound // Expert. Rev. Anticancer Ther. — 2001. — P. 1341-1347.
29. Gingras D., Bovin D., Deckers C. et al. Neovastat — a novel antiangiogenic drag for cancer therapy // Anti-Cancer Drugs. — 2003. — Vol. 14. — P. 91-96.
30. Gingras D., Renaud A., Mousseau N. et al. Matrix proteinase inhibition by AE-941, a multifunctional antian-giogenic compound // Anticancer Res. — 2001. — Vol. 21. — P. 145-155.
31. Hobbs S. K., Monsky W. L., Yuan F. et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998. — Vol. 95, No. 8. — P. 4607-4612.
32. Hurwitz H., Fehrenbacher L., Novotni W. et al. Bevacizumab + irinotecan, fluorouracin, and leucovorin for metastatic colorectal cancer // N. Engl. J. Med. —
2004. — Vol. 350. — P. 2335-2342.
33. Huss W. J., Hanrahan C. F., Barrios R. J. Angiogenesis and Prostate cancer: Identification of a Molecular Progression Switch // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 2736-2743.
34. Inal T., Mancuso M., Hashizume H. et al. Inhibition of VEGF signaling in cancer causes loss of endothelial fenestrations, regression of tumor vessels, and
appearance of basement membrane ghosts // Am. J. Pathol.
— 2004. — Vol. 165. — P. 35-52.
35. Jain R. K. Molecular regulation of vessel maturation // Nat. Med. — 2003. — Vol. 9. — P. 685-693.
36. Jain R. K. Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: A new paradigm for combination therapy // Nat. Med. — 2001. — Vol. 7. — P. 987-989.
37. Jain R. K. Normalization of tumor vascularity: an emerging concept in antiangiogenic therapy // Science. —
2005. — Vol. 307. — P. 58-62.
38. KatambiA., Mouta C. C., Yun C. O. et al. Vascular endothelial growth factor (VGEF)-C differentially affects tumor vascular function and leukocyte recruitment: Role of VEGF-receptor 2 and host VEGF-A // Cancer Res. —
2001. — Vol. 61. — P. 2404-2408.
39. Keck P. I., Hauser S. D., Krivi G. et al. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF // Science. — 1989. — Vol. 246. — P. 1309-1312.
40. Kerbel R. S. Inhibition of tumor angiogenesis as a strategy to circumvent acquired resistance to anticancer therapeutic agents // Bio. Essays. — 1991. — Vol. 13. — P. 31-38.
41. Kozin S. V., Boucher Y., Hicklin D. J. et al. Vascular endothelial growth factor receptor-2-blocking antibody potentiates radiation induced long-term control of human tumor xenografts // Cancer Res. — 2001. — Vol.
61. — P. 39-44.
42. Lee G. G., Heijn M., di Tomasso E. et al. Anti-vascular endothelial growth factor treatment augments tumor radiation response under normoxic or hypoxic conditions // Cancer Res. — 2000. — Vol. 60. — P. 5565-5670.
43. LijnenH. R., CollenD. Mechanisms of physiological fibrinolysis // Bailliere’s Clin. Haematol. — 1995. — Vol. 8. — P. 277-290.
44. Ma J., Pulfer S., Li S. et al. Pharmacodynamic-mediated of temozolomide tumor concentrations by the angiogenesis inhibitor TNP-470 // Cancer Res. — 2001.
— Vol. 61. — P. 5491-5498.
45. Matsumoto T., Claesson-Welsh L. VEGF receptor signal transduction // Sci. STKE. — 2001. — Vol. 112. — RE21.
46. Maueri H. J., Hanna N. N., Backett M. A. et al. Combined effects of angiostatin and ionising radiation in antitumor therapy // Nature. — 1998. — Vol. 394. — P. 287-291.
47. Murata R., Nishimura Y., Hiraccka M. An antian-giogenic agent (TNP-740) inhibited reoxygenation during fractionated radiotherapy of murine mammary carcinoma // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. — 1997. — Vol. 37. — P. 1107-1113.
48. Nagase H., Woessner J. F. Jr. Matrix metalloproteinases // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 21491-21494.
49. Pepper M. S. Role of matrix metalloproteinase and plasminogen activator-plasmin systems in angiogenesis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 2001. — Vol. 21. — P. 1104-1117.
50. Ratner M. Genentech discloses safety concerns over Avastin // Nat. Biotechnol. — 2004. — Vol. 22. — P. 1198.
51. Reijerkerk A., Voest E. E., Gebbink M. F. No grip, no growth: the conceptual basis of excessive proteolysis in the treatment of cancer // Eur. J. Cancer. — 2000. — Vol.
36. — P. 1695-1705.
52. Rousseau S., Houle F., Kotanidos H. et al. Vascular endothelial growth factor VEGF-driven actin-based motility is mediated by VEGFR-2 and requires concerted activation of stress-activated protein kinase 2 ( SAPK2/p38) and geldanamycin-sensitive phosphorylation of focal adhesion kinase // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 10661-10672.
53. Sawaya R., Ramo O. J., Shi M. L., Mandybur G. Biological significance of tissue plasminogen activator content in brain tumors // J. Neurosurg. — 1991. — Vol. 74. — P. 480-486.
54. Scappaticci F. A. Mechanisms and future directions for angiogenesis-based cancer therapies // J. Clin. Oncol. — 2002. — Vol. 20. — P. 3806-3827.
55. Sorgente N., Kuettner K. E., Soble L. W., Eisenstein R. The resistance of certain tissues to invasion.
II. Evidence of extractable factors in cartilage which inhibit invasion by vascularized mesenchyme // Lab. Invest. — 1975. — Vol. 32. — P. 217-222.
56. Statler-Stevenson W. G. Matrix metalloproteinas-es in angiogenesis: a moving target for therapeutic intervention // J. Clin. Invest. — 1999. — Vol. 103. — P. 1237-1241.
57. Teicher B. A., Holden S. A., Ara G. et al. Influence of an anti-angiogenic treatment on 9L gliosarcoma: oxygenation and response to cytotoxic therapy // Int. J. Cancer. — 1995. — Vol. 1. — P. 732-737.
58. Thirty-Ninth Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, May 31 — June 3, 2003 Chicago. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 2003. — 905 p.
59. Tong R. T., Bucher Y., Kozin S. V. et al. Vascular normalisation by vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade induces a pressure gradient across the vasculature and improves drug penetration in tumors // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64. — P. 3731-3736.
60. Wachsberger Ph., Burd R., Dicker A. P. Tumor Response to Ionizing Radiation with Antiangiogenesis or Vascular Targeting Agents: Exploring Mechanisms of interaction // Clin. Cancer Res. — 2003. — Vol. 9. — P. 1957-1971.
61. Waltenberger J., Claesson-Welsh L., SiegbahnA. et al. Different signal transduction properties of KDR and Fit1, two receptors for vascular endothelial growth factor // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269. — P. 26988-26995.
62. Weber M. H., Lee J., Orr F. W. The effect of Neovastat (AE-941) on an experimental metastatic bone tumor model // Int. J. Oncol. — 2002. — P. 20299-20303.
63. Willett C. G., Boucher Y., di Tomaso E. et al. Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer // Nat. Med. — 2004. — Vol. 10. — P. 145-147.
64. Winkler F., Kozin S. V., TongR. T. et al. Kinetics of vascular normalisation by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: Role of oxygenation, angiopoetin-1, and matrix Metalloproteinases // Cancer Cell. — 2004. — Vol. 6. — P. 553-563.
65. YuanF., Chen Y., DellianM. et al. Time-dependent vascular regression and permeability changes in established human tumor xenografts induced an anti-vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor antibody // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — Vol. 99. — P. 14765-14770.
