CC BY
33
НОВАЯ МОДЕЛЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНОЙ И АНТИФИБРОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ*
Голофеевский В. Ю., Антушевич А. Е., Антонов В. Г., Гребенюк А. А. Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
NEW MODEL OF THE EXPERIMENTAL CIRRHOSIS FOR ESTIMATION HEPATOPROTECTIVE AND ANTIFIBROTIC EFFICIENCY OF DRUGS
Golofeevskiy V. Yu., Antushevich A. E., Antonov V.G, Grebeniuk A. N.
The Chair of Military Therapy and the Chair of Military Toxicology and Medical Protection of Military Medical Academy of name S. М. Kirov
Резюме
* Иллюстрации к ста- Цель исследования: разработка модели цирроза печени у животных, оценка его клинико-морфологических осо-
тъе - на цветной вклейке бенностей и изучение терапевтической эффективности инозина глицил-цистеинил-глутамата динатрия в сравнении в журнал с S-адеметионином.
Материал и методы: Серии опытов (200 белых крыс), хроническая интоксикация диметилнитрозамином (ДМНА) в разных режимах и алкоголем в течение 3-4 недель. На фоне продолжающейся интоксикации введение инозина глицил-цистеинил-глутамата динатрия (10 или 30 мг/кг) или S-адеметионина (70 мг/кг) до 9 недель. Через каждую неделю серию из 7-8 животных взвешивали, оценивали состояние органов брюшной полости, видимых сосудов, наличие асцита. Брали образцы крови для биохимического анализа и печени для гистологического исследования.
Результаты: Установлено, что при введении ДМНА внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг 3 раза в неделю + этанола в дозе 3 г/кг (перорально через день) в течение 4 недель закономерно развиваются макроскопические (гепатомегалия, асцит, коллатерали), биохимические и гистологические признаки цирроза печени (дистрофия гепатоцитов, внутриклеточный холестаз, макрофагальная реакция, выраженный фиброз, узелковая перестройка, нарушения кровообращения). Применение с лечебной целью S-адеметионина способствовало регрессии признаков цирроза, но наиболее полный клинико-морфологический ответ обеспечил инозина глицил-цистеинил-глутамат динатрия в дозе 30 мг/кг.
Заключение: В данном исследовании разработана адекватная модель экспериментального цирроза печени с обоснованием соответствия большинства критериев циррозу печени у человека. Сделан вывод о высокой поливалентной терапевтической эффективности препарата инозина глицил-цистеинил-глутамат динатрия и перспективности его применения в клинической гепатологии и токсикологии.
Ключевые слова: экспериментальный цирроз печени, диметилнитрозамин, алкоголь, лечение. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2017; 146 (10): 88-93
Summary
Research objective: working out of model of a cirrhosis at animals, an estimation of its clinical-morphological features, studying of therapeutic efficiency of inosin glitsil-tsisteinil-glutamat dinatrium in comparison with ademetionin.
Material and methods: Series of experiences (200 white rats), a chronic dimethylnitrosamine's intoxication (DMNA)) in different modes and alcohol within 3-4 weeks. Against a proceeding intoxication introduction of inosin glitsil-tsisteinil-glutamat dinatrium (10 or 30 mg/kg) or ademetionin (70 mg/kg) till 9 weeks. Through every week series from 7-8 animals weighed, estimated a condition of bodies of a belly cavity, visible vessels, presence of ascites. Samples of blood for the biochemical analysis and a liver for histological research took.
Results: It is established that at introduction DMNA intraperitoneally in a dose of 10 mg/kg 3 times a week + ethanol in a dose of 3 g/kg (oral every other day) within 4 weeks naturally develop macroscopic (hepatomegaly, ascites, collaterals), biochemical and histological signs of a cirrhosis (a dystrophy of hepatocytes, endocellular cholestasis, the reaction of macrophages, expressed fibrosis, nodular reorganization, blood circulation infringements). Application with the medical purpose of ademetionin promoted regress of signs of a cirrhosis, but the fullest clinical-morphological answer has provided inosin glitsil-tsisteinil-glutamat dinatrium in a dose of 30 mg/kg.
Conclusion: In the given research the adequate model of an experimental cirrhosis with a substantiation of conformity of the majority of criteria to a cirrhosis at the person is developed. The conclusion is drawn on high polyvalent therapeutic efficiency of inosin glitsil-tsisteinil-glutamat dinatrium and perspectivity of its application in clinical hepatology and toxicology.
Keywords: an experimental cirrhosis, dimethylnitrosamine, alcohol, treatment.
Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2017; 146 (10): 88-93
Голофеевский Вячеслав Юрьевич
Golofeevskiy Vyacheslav Yu. vgolf@yandex.ru
Введение
На протяжении десятилетий многие исследователи стремились разработать адекватную экспериментальную модель острой и хронической патологии печени, включая цирроз, для объективной оценки терапевтической и превентивной эффективности т.н. гепатопротекторных лекарственных средств, перспективных для клинической практики. К настоящему времени известны модели, основанные на хронической интоксикации формальдегидом, тетрахлорметаном (СС14), совтолом-1, этанолом и другими токсикантами, на хроническом дефиците незаменимых нутриентов, которые, по сути, обеспечивали в большей степени развитие токсического повреждения печени - острого токсического гепатита или острой дистрофии, и в меньшей степени - хронического гепатита и цирроза печени [1-8]. Анализ литературы свидетельствует, что клинико-морфологические проявления поражения печени при моделировании в эксперименте у животных по многим критериям не соответствуют таковым при циррозе печени у человека.
В процессе экспериментального анализа нами была разработана оригинальная модель цирроза печени у крыс, индуцированного №диметилнитро-замином (ДМНА) в комбинации с этанолом (заявка на изобретение, регистрационный номер 2016145857
от 22 ноября 2016 г.), которому были присущи основные клинико-лабораторные и морфологические признаки цирроза печени у человека. Новая модель отличается от ранее предложенных способов комбинацией ДМНА с этанолом, режимами и дозами введения токсикантов. При этом следует напомнить, что ДМНА является наиболее «распространенным» токсикантом, попадающим в организм человека с продуктами питания, водой, при курении, образующийся в процессе переработки продуктов питания (особенно при жарении, копчении) и приготовлении ряда напитков. Таким образом, негативному постепенному воздействию ДМНА подвергается практически каждый человек. Токсическое воздействие этанола хорошо известно, при этом при хронической интоксикации алкоголем у человека закономерно развивается хронический алкогольный стеатогепатит и, нередко, цирроз печени.
Цель настоящего исследования заключалась в разработке нового способа моделирования цирроза печени в эксперименте на животных, оценке лабораторных и морфологических особенностей его развития и изучении на данной модели антитоксической, гепатопротективной и антифибротической эффективности инозина глицил-цистеинил-глута-мата динатрия в сравнении с адеметионином.
Материал и методы исследования
Эксперименты выполнены на белых крысах-самцах массой 180-250 г, выращенных в питомнике л РАН г. Санкт-Петербург. Животных наблюдали ( в стандартных условиях содержания и питания о и руководствовались положениями Федерального у закона № 86-ФЗ «О лекарственных средствах» от б 22.06.1998 г., Приказа МЗ РФ № 267 «Правила лабо- ч раторной практики в РФ» от 19.06.2003 г.) и «Руко- i водства по экспериментальному (доклиническому) i изучению новых фармакологических средств» [9]. i
Был использован стандартный 99,9 % раствор
ДМНА (Sigma), из которого готовили 1 % водный н
раствор. Животных подвергали комбинированному с
воздействию этанола в дозе 3 г/кг (через день в течение з
6 недель) и ДМНА в субтоксической дозе 5-10 мг/кг. и
Схемы интоксикации: 1) внутрибрюшинное введение с
ДМНА через день в течение пяти недель с увеличе- ]
нием дозы (две недели по 5 мг/кг, третья неделя по м
7,5 мг/кг и четвертая-пятая недели по 10 мг/кг); 2) к
ДМНА вводили перорально в дозах и режиме, ана- и
логичных 1-й схеме; 3) внутрибрюшинное введение с
ДМНА в дозе 10 мг/кг 3 раза в неделю в течение че- и
тырех недель с перерывами между неделями по 4 дня. i
Инозина глицил-цистеинил-глутамата динатрия
(Na2GCGI) и для сравнения - адеметионин, начинали i
вводить крысам через три недели от начала интоксика- н
ции (установленный срок формирования эксперимен- н
тального цирроза печени). Na2GCGI вводили подкож- с
но через день в дозах 10 мг/кг и 30 мг/кг, а адеметионин п
ежедневно подкожно в дозе 70 мг/кг на протяжении л
последующих за формированием цирроза шести не- в
дель. Расчет доз адеметионина был сопоставим с ре- j
комендованными дозами для клинической практики. п
Общая продолжительность эксперимента составила 9 недель. Перед введением ДМНА и через 3 недели (формирование цирроза), а затем через 6 и 9 недель общей продолжительности опыта (группы лечения) у животных оценивали общий статус и массу тела, брали материал для лабораторных тестов. Биохимический анализ крови включал оценку общего белка, креатинина, мочевины, глюкозы, билирубина, калия, натрия, хлора, кальция, АЛТ, АСТ, ГГТП, ЩФ при помощи анализатора «Roche Omni C».
Фрагменты печени для гистологического исследования фиксировали в смеси 10 % формалина, этилового спирта и уксусной кислоты, заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (оценка общей структуры) и пикрофук-сином по Ван Гизону (оценка соединительной ткани). Препараты изучали при помощи исследовательских микроскопов Polyvar и Leica DMRE, цифрового комплекса видеонаблюдения и программы анализа изображений «Видеотест-4». Препараты подвергали стереоморфометрии с компьютерной обработкой изображений для более отчетливого выделения окрашенных в красный цвет коллагеновых волокон.
Достоверность различий средних выборок оценивали при помощи t-критерия Стьюдента, эффективность лечения - с помощью пробит-анализа по Фин-ни (программа Statistica+2005 для Windows). Среднюю ошибку альтернативных показателей определяли по таблице Генеса, расчет доверительного интервала - с использованием поправки Йетса для малых выборок и вспомогательной переменной Фишера, для оценки значимости межгрупповых различий применяли критерии х2 Пирсона и Фишера.
Результаты исследования
В опытах по 1-й схеме через 2-3 недели интоксикации отмечали появление признаков портальной гипертензии: выраженное венозное полнокровие органов желудочно-кишечного тракта, раскрытие анастомозов и формирование путей окольного кровотока по задней брюшной стенке, между органами малого таза, в околопочечной клетчатке. Размеры селезенки увеличивались, ткань была дряблой и полнокровной. В карманах брюшины отмечали скопление небольшого количества жидкости, т.е. появление асцита. Печень увеличена, темно-красная, дряблая, полнокровная.
Через 4-5 недель после начала введения ДМНА признаки портальной гипертензии нарастали. Животные заметно прибавили в массе за счет асцита (естественная прибавка массы у интактных животных 7-10 г за 1 неделю), при этом в брюшной полости животных накапливалось до 10 мл транссудата. Визуально отмечали централизацию коллатерального кровообращения с выделением крупных путей окольного кровотока по поверхности диафрагмы, в околопочечной клетчатке, между петлями кишки и в малом тазу. Размеры селезенки и печени резко увеличены, поверхность неровная, с зернистой структурой. Отмечено накопление жидкости в грудной полости, отек головного мозга и его оболочек.
При введении ДМНА по 2-й схеме отмечали изменения, сходные с таковыми в серии опытов по 1-й схеме. Однако различия стали более отчетливыми к окончанию 4-5-й недели эксперимента. Печень зернистой структуры, красно-коричневого цвета, полнокровная. Выраженность асцита при пероральном введении увеличилась, брюшная полость содержала до 20 мл прозрачного транссудата светло-желтого цвета, развивалась анасарка, увеличились признаки портальной гипертензии и коллатерального кровообращения, селезенка еще более увеличилась в размерах. Имели место дистрофические изменения почек, надпочечников, легких, головного мозга.
Наблюдение за животными в опытах по 3-й схеме позволило констатировать аналогичные, но устойчивые и воспроизводимые в 100 % случаев результаты с формированием через 3-4 недели интоксикации картины цирроза печени, соответствующей по макроскопическим, лабораторным и морфологическим критериям циррозу печени у человека.
При гистологическом анализе уже через одну неделю после начала интоксикации (рис. 1 - ин-тактная печень; рис. 2 - интоксикация) в меж-дольковой соединительной ткани наблюдали активацию коллагеногенеза с появлением большого количества фуксинофильных коллагеновых волокон в виде радиальных септ в зоне центральных вен и расширенных синусоидов. Появлялись признаки баллонной и гидропической дистрофии гепатоцитов. Ядра эндотелиоцитов увеличивались в размерах, а повреждение эндотелия и активация гемолиза проявлялись микротромбированием центральных вен с явлениями васкулита, Наблюдали
лимфоцитарный и макрофагальный инфильтраты по ходу синусоидов, формирование путей окольного кровотока в печеночных дольках. Очевидные явления васкулита, реакция макрофагов и лимфоцитов, вероятно, способствуют повышению продукции цитокинов и активации фиброгенеза с образованием центро-центральных септ, наблюдаемых и в дальнейшие сроки хронической интоксикации животных. В структуру септ также входили венозные капилляры, выполняющие роль центро-центральных анастомозов.
Гистологический анализ через 2 недели интоксикации свидетельствовал об усилении фиброгенеза печени, формировании центро-центральных септ, расширении синусоидов, «сладже» в крупных сосудах (рис. 3). Возникали центро-портальные септы, «масса» коллагеновых волокон в портальных трактах увеличилась. Септы часто были направлены к капсуле печени, которая утолщалась, формировались псевдодольки. Степень белково-ги-дропической дистрофии гепатоцитов нарастала, ядра гепатоцитов были пикнотичны с нарушением ядерно-цитоплазматических отношений. В соединительно-тканных септах замечено присутствие сидерофагов с продуктами фагоцитоза эритроцитов.
Через 3 недели интоксикации степень повреждения структуры печени еще более возросла, что совпало с развитием стойкого асцита и портальной гипертензии. При гистологическом анализе (рис. 4) отмечали более развитую соединительную ткань в септах, вследствие чего они приобретали более регулярное строение, прослеживался процесс формирования псевдодолек. Так, наблюдали очевидный эффект «коллагенизации» центральных вен, формирование коллатерального кровообращения по расширенным синусоидам, заключенным в волоконный состав септ. Гепатоциты в участках узелковой трансформации подвергались еще более выраженной дистрофии с появлением признаков внутриклеточного и внутридолькового холестаза.
Через 4 недели интоксикации и далее у животных констатированы достоверные морфологические признаки цирроза печени - узелковых псевдодолек и фиброза портальных трактов (рис. 5). Соединительнотканные септы утолщались, имелись выраженная дистрофия гепатоцитов и скопление макрофагов, нарастала портальная гипертензия. Таким образом, полученные именно в такие сроки опыта результаты позволили рассматривать данную экспериментальную модель цирроза печени в качестве базовой для дальнейшей оценки эффективности испытуемых лекарственных средств.
Серия животных со сформированным циррозом печени была разделена на 2 группы, которым начинали введение Na2GCGI или адеметионина. Через 3 (1-я подгруппа) и 6 (2-я подгруппа) недель экспериментальной терапии у животных оценивали морфологические и биохимические показатели. Кроме того, сформировано 2 группы контроля (без какого-либо лечения и крысы, которым вводили 0,9 % раствор хлорида натрия в течение 3-х недель).
Группы животных
Показатель Интактные (n=10) ДМНА (n=8) Лечение Na2GCGI 10 мг/кг (n=10) Лечение Na2GCGI 30 мг/кг (n=10) Лечение адеметионин 70 мг/кг (n=8)
Общий белок, г/л 62,0 ± 1,0 61,0 ± 1,3 60,0 ± 1,5 62,4 ± 1,4 61,3 ± 1,2
Креатинин, мк-моль/л 43,2 ± 0,6 52,1 ± 1,2** 44,8 ± 0,5 * 46,2 ± 0,7 48,4 ± 1,0
Щелочная фос-фатаза, ед/л 325,1 ± 15,5 541,0 ± 47,9** 314,9 ± 36,7 А 300,7 ± 25,5 А 310,6 ±36,2 А
Глобулин, г/л 29,1 ± 0,8 30,5 ± 0,6 30,2 ± 0,3 29,4 ± 1,8 30,7 ± 1,0
Альбумин, г/л 32,9 ± 0,9 30,5 ± 1,0 29,8 ± 1,2 33,0 ± 0,7 30,6 ± 0,8
Мочевина, ммоль/л 4,8 ± 0,3 13,2 ± 0,3* 8,5 ± 0,8 ж 8,8 ± 0,9 А 10,2 ± 0,1А
АСТ, ед/л 220,8 ± 4,7 260,0 ± 15,7** 239,0 ± 19,4 219,0 ± 8,6 ж 238,0 ± 19,5
АЛТ, ед/л 143,0 ± 5,0 151,4 ± 10,5 150,2 ± 9,3 145,2 ± 10,9 146,2 ± 11,2
ГГТП, ед/л 4,6 ± 0,3 5,5 ± 0,2 4,7 ± 0,2 4,9 ± 0,2 5,3 ± 0,3
Общий билирубин, мкмоль/л 1,9 ± 0,1 4,7 ± 0,9** 3,0 ± 0,9** 2,5 ± 0,4 А 2,8 ± 0,3 А
Ca, ммоль/л 2,4 ± 0,02 2,35 ± 0,03 2,39 ± 0,06 2,3 ± 0,04 2,4 ± 0,03
Cl, ммоль/л 105,2 ± 0,7 102,3 ± 0,7 102,0 ± 0,7 102,6 ± 0,4 102,1 ± 0,3
K, ммоль/л 6,4 ± 0,1 5,8 ± 0,2 6,4 ± 0,5 6,0 ± 0,4 6,5 ± 0,3
Таблица.
Биохимические показатели крови (М±т)
Примечания
1 * - различия с группой интактных животных достоверны при р<0,05;
2 ** - различия с группой интактных животных достоверны при р< 0,01
▲ - различия с показателем в контрольной группе достоверны при р<0,05
Na, ммоль/л
138,3 ± 0,8
137,7 ± 0,5
137,9 ± 0,3
138,0 ± 0,8
139,7 ± 0,5
Введение адеметионина в течение 6 недель приводило к некоторому снижению объемного содержания соединительной ткани в паренхиме печени, что подтверждает его антифибротическое действие. Однако сохранялись морфологические проявления нарушений кровообращения в паренхиме печени. Сравнительно большое количество волокон соединительной ткани сохранялось пе-рипортально, а также в составе крупных септ, наблюдались также мелкие соединительнотканные септы. Гепатоциты имели признаки умеренной дистрофии, сохранялась умеренная лимфоци-тарная инфильтрация (рис. 6).
Na2GCGI в дозе 10 мг/кг в течение 3 недель (на фоне предшествующей хронической интоксикации) оказывал более значимый гепатопротек-тивный (терапевтический) эффект по сравнению с адеметионином. В гистологических препаратах печени отмечено снижение новообразования соединительнотканных септ, коллагеновые волокна распределялись преимущественно пери-синусоидально в виде тонких нитей и в перипор-тальной зоне долек (рис. 7). Отмечено значимое снижение количества гепатоцитов с белково-ги-дропической дистрофией. Введение Na2GCGI в течение 6 недель сопровождалось дальнейшим существенным снижением новообразования соединительной ткани и отсутствием признаков нарушений внутриорганной гемодинамики. Также отмечено существенное снижение числа дистрофически измененных гепатоцитов. Таким образом, Na2GCGI в дозе 10 мг/кг показал значимое гепатопротективное и антифибротическое воздействие с регрессией патоморфологических признаков токсически индуцированного цирроза печени.
Применение №20С01 в дозе 30 мг/кг оказалось еще более эффективным (рис. 8). Уже в процессе
3-недельного введения еще более наглядно снижалась выраженность фиброза паренхимы печени и числа гепатоцитов с признаками дистрофии. Структура подавляющего большинства гепатоцитов была не изменена, при этом наблюдали признаки активации процессов регенерации с увеличением числа двухядерных клеток.
Таким образом, становится очевидным выраженный гепатопротективный и антифибротиче-ский эффект №20С01, способствующий регрессу фиброза, дистрофии и воспаления в паренхиме печени при экспериментальном циррозе печени. Морфометрия объемного содержания соединительной ткани в паренхиме печени у опытных и контрольных животных также подтвердила, что №2ССС1 в использованной дозе существенно превысил по антифибротическому действию адеметионин. Нельзя также обойти вниманием дозозависимый эффект Na2GCGI.
В таблице 1 представлены основные биохимические показатели животных через 6 недель лечения экспериментального цирроза печени (хотя предварительные оценки были сделаны также на этапе 3-недельного введения препаратов). Очевидно то, что в процессе хронической интоксикации у животных (без лечения) появляются биохимические признаки холестатического и цитолитического синдромов и начальные признаки почечной недостаточности.
На фоне введения Na2GCGI и адеметионина уровни билирубина, ЩФ, АсТ имели тенденцию к нормализации, причем наиболее выраженную при использовании Na2GCGI в дозе 30 мг/кг. Таким образом, динамика биохимических показателей крови совпадает с данными морфометрии объемного содержания соединительной ткани в печени животных и свидетельствует также о ге-патопротективном эффекте Na2GCGI.
Обсуждение полученных результатов
Таким образом, можно констатировать, что, во-первых, продолжительное введение животным ДМНА неизменно приводит к формированию токсического гепатита с исходом в цирроз печени. Характерно то, что развиваются типичные для цирроза синдромы (портальная гипертензия, асцит, ренальный синдром, трофологические и поведенческие нарушения), гистологические изменения (дистрофия гепатоцитов, макрофагальная и моно-нуклеарная реакция, фиброз портальных трактов, микронодулярная перестройка структуры печени) и биохимические проявления (нарушение обмена билирубина, цитолиз, холестаз, гепатоцеллюляр-ная недостаточность). При этом важным звеном инициации фиброгенеза и дисрегенераторного процесса можно считать нарушение целостности сосудистого русла, прежде всего, центральных вен, с последующей патологической реорганизацией сосудов портальных трактов. В таких условиях, несомненно, развивается ишемия печени с диффузными патологическими изменениями ее паренхимы и стромы.
Во-вторых, примерно одна треть животных на фоне хронической интоксикации ДМНА, несмотря на последующее введение адеметионина, погибла. В то же время наиболее высокий терапевтический эффект обеспечил Na2GCGI, введение которого уже в течение первых 3 недель и последующих 6 недель хронической интоксикации ДМНА способствовало снижению признаков активации кол-лагеногенеза по сравнению с группами контроля. Следовательно, становится очевидной и возможной регрессия фибротического процесса, восстановление нарушенных функций гепатоцитов, хотя некоторые гистологические признаки дистрофии гепатоцитов в течение этих сроков терапии еще могли сохраняться, однако выживаемость животных составила 100 %.
Известно, что с МНН Инозина глицил-цисте-инил-глутамата динатрия (Na2GCGI) в РФ зарегистрированы препараты как лекарственное средство, разрешенное к применению в качестве иммуномодулирующего, противовирусного и гепатопротекторного средства. Основными показаниями к применению Na2GCGI являются хронические вирусные гепатиты в составе комплексной терапии, однако клинико-фармакологи-ческие эффекты и режимы дозирования до конца не установлены. Результаты ранее проводимых исследований показали, что Na2GCGI обладает отчетливой противовирусной активностью против РНК-содержащих вирусов простого герпеса со 100 %-й выживаемостью экспериментальных животных [10]. В клинических условиях глицил-ци-стеинил-глутамата динатрия продемонстрировал выраженную гепатопротективную эффективность при лечении тяжелых отравлений этанолом [11, 12]. Поэтому для понимания возможных молекулярных процессов, обеспечивающих лечебные эффекты Na2GCGI, представляется необходимой его краткая фармакологическая и фармакокинети-ческая характеристика.
Можно полагать, что гепатопротективная (фармакологическая) активность препарата глицил-цистеинил-глутамата динатрия обусловлена, прежде всего, антиоксидантной функцией метаболитов окисленного глутатиона (GSSG) и инозина. Окисленный глутатион является одним из ключевых эффекторов в системе редокс-регуляции клеточных функций, функционируя в сочетании с молекулой восстановленного глутатиона ^8Н), образуя редокс-пару 08Н/088С, присутствующую во всех клеточных популяциях и микроорганизмах [13, 14].
Глутатионовый цикл регулирует активность рецепторов, ферментов, ионных каналов, обмен белков внутриклеточных мембран и транспортных молекул, белков внеклеточного матрикса и цитоскелета [15]. Транспорт GSH и GSSG и их внеклеточные и внутриклеточные концентрации являются АТФ-зависимым процессом, но обратно в клетку может поступать только восстановленный глутатион и/или его аминокислоты. Внеклеточный распад GSH осуществляется мембраносвязанной у-глютамилтрансферазой (GGT - КФ 2.3.2.2).
GSSG, как комплементарный компонент гли-цил-цистеинил-глутамата динатрия, реализует биологическую активность инозина (пуринового компонента), который является, в свою очередь, основным метаболитом при распаде аденозина. Подобно аденозину, инозин через пуриновые рецепторы воздействует на клеточные функции и АТФ. Помимо пуриновых рецепторов, инозин является парциальным агонистом бензодиазепи-новых рецепторов, способен изменять чувствительность адренорецепторов, восстанавливая их аффинность к действию катехоламинов [16].
Инозин влияет на пластичность мембран эритроцитов и их способность к агрегации, снижает тонус резистивных сосудов, улучшает реологические свойства крови, удаляет из зон повреждения и ишемии недоокисленные продукты - лактат и пируват, улучшает оксигенацию и энергообеспечение, стимулирует продукцию противовоспалительных цитокинов макрофагами [17, 18]. Вероятно поэтому инозин обладает нейро-, кардио- и гепа-топротекторными свойствами, противовоспалительной и противосудорожной активностью [18-21].
В конечном итоге, в фармакологической формуле №2ССС1, инозин и глицил-цистеинил-глу-тамат динатрия являются комплементарными в фармакодинамическом и фармакокинетическом отношении, а на уровне клетки комплементарность GSSG и инозина выражается в том, что GSSG увеличивает аффинность рецепторов А1, А2А и А3 к действию инозина [22].
Гепатопротективные, антифибротические и антитоксические свойства Na2GCGI логично могут быть объяснены стимуляцией фагоцитарной и де-токсицирующей функций макрофагов, влиянием на рецепторные тирозинкиназы и тирозинфосфа-тазы, кальциевые каналы и уровни внутриклеточного кальция [23, 24].
Заключение
Разработанная модель экспериментального цирроза печени может быть рекомендована в качестве стандартной для дальнейшего и более глубокого понимания общеклинических, функциональных, метаболических и морфологических закономерностей развития этой патологии. Предлагаемая модель наиболее полно соответствует клини-ко-морфологическим признакам и критериям цирроза печени у человека, что позволяет использовать её для объективной сравнительной
оценки антифибротической эффективности известных и перспективных лекарственных средств. В качестве перспективного препарата для предупреждения и регрессии цирротическо-го процесса может быть использован препарат глицил-цистеинил-глутамата динатрия, который, с учетом ранее проводимых исследований, продемонстрировал поливалентную фармакологическую активность и превзошел эффективность адеметионина.
Литература
1. Гальперин Э. И. Получение цирроза печени и асцита в эксперименте. Экспериментальная хирургия, 1960, № 1, сс. 46-49.
2. Костырев О. А. Роль регенераторных процессов в формировании экспериментального цирроза печени. Архив патологии, 1972, том 34, № 10, сс. 59-64.
3. Венгеровский А. И. Фармакологические подходы к регуляции функций печени. Бюллетень сибирской медицины. 2002, № 1, сс. 25-28.
4. Шалимов С. А., Радзиховский А. П., Кейсевич Л. В. Руководство по экспериментальной хирургии. - М.: Медицина, 1989, 272 с.
5. Popper H. Histogenesis of alcoholic fibrosis and cirrhosis in the baboon. Am J Pathol., 1980, vol. 98, no. 3, pp. 695-716.
6. Tsukamoto H., Matsuoka M., French S. Experimental models of hepatic fibrosis: a review. Semin. Liver Dis., 1990, vol. 10, no. 1, pp. 56-65.
7. Lieber C. S. Interaction of ethanol with drugs, hepatotox-ic agents, carcinogens and vitamins. Alcohol Alcohol., 1990, vol. 25, no. 2/3, pp. 157-176.
8. Альперович Б. И., Орлов А. В., Киселева Ю. В. Возможности криодеструкции в лечении цирроза печени. Бюллетень сибирской медицины, 2004, № 2, сс. 79-85.
9. Хабриев Р. У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Медицина, 2005, 832 с.
10. Степанов А. В., Ярцева А. А., Гребенюк А. Н., Антонов В. Г., Антушевич А. Е. Экспериментальное обоснование применения иммуномодулятора молик-сан в качестве средства терапии герпесвирусной инфекции. Военно-медицинский журнал, 2014, № 2, сс. 64-65.
11. Гребенюк А. Н., Рейнюк В. Л., Антушевич А. Е., Ха-лютин Д. А., Маркосян А. М. Эффективность гепа-топротекторов пептидной и непептидной природы в терапии острых крайне тяжелых отравлений этиловым спиртом. Вестник Российской Военно-медицинской академии, 2014, № 1, сс. 136-141.
12. Гребенюк А. Н., Рейнюк В. Л., Антушевич А. Е., Ха-лютин Д. А. Эффективность гепатопротектора с пептидным компонентом моликсана при острой крайне тяжелой интоксикации этанолом. Токсикологический вестник, 2014, № 4, сс. 12-19.
13. Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M. R. Cell signalling and the glutathione redox system. Biochem. Pharmacol., 2002, 64: pp. 1057-1064.
14. Быстрова Ф. М., Буданова Е. Н. Перекись водорода и пероксиредоксины в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации. Биологические мембраны, 2007, том 24, № 2, сс. 115-125.
15. Мартинович Г. Г., Черенкевич С. Н. Окислительно-восстановительные процессы в клетках. - Минск: издательство «БГУ», 2008, 159 с.
16. Ganzella M. et al. Intracerebroventricular administration of inosine is anticonvulsant against quinolinic acid-induced seizures in mice: an effect independent of benzodiazepine and adenosine receptors. Pharmacol Biochem Behav., 2011, vol. 100, № 2, pp. 271-274.
17. Szabo G., Stumpf N., Radovits T. et al. Effects of inosine on reperfusion injury after heart transplantation. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 2006, vol. 30, no. 2, pp. 96-102.
18. da Rocha Lapa F, da Silva MD, de Almeida Cabrini D, Santos AR. Anti-inflammatory effects of purine nucleosides, adenosine and inosine, in a mouse model of pleurisy: evidence for the role of adenosine A2 receptors. Purinergic Signal., 2012, Dec., vol. 8, no. 4, pp. 693-704.
19. Modis K., Gero D., Stangl R. et al. Adenosine and inosine exert cytoprotective effects in an in vitro model of liver ischemia-reperfusion injury. Int J Mol Med., 2013, Feb., vol. 31, no. 2, pp. 437-446.
20. Nascimento F. P., Macedo-Junior S.J., Pamplona F. A. Adenosine A1 receptor-dependent antinociception induced by inosine in mice: pharmacological, genetic and biochemical aspects. Mol Neurobiol., 2015, Jun., vol. 51, no. 3, pp. 1368-1778.
21. Robin E., Saborium J., Maralac F., Raddatz E. Involvement of CD 73, equilibrative nucleoside transporters and inosine in rhythm and conduction disturbances mediated by adenosine A1 and A2a receptors in the developing heart. J Mol Cel1 Cardiol., 2013, Oct., vol. 63, no. 1, pp. 14-25.
22. Welihinda A. A., KaurM., Greene K., Zhai Y., Amento E. P. The adenosine metabolite inosine is a functional agonist of the adenosine A2a receptor with a unique signaling bias. Cell Signal., 2016, Feb., vol. 28, no. 6, pp. 552-560.
23. Крутецкая 3. И. Участие комплекса ARP2/3 и белков WASP в действии глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах. Доклады Академии Наук, 2015, том 464, № 2, сс. 227-230.
24. Крутецкая 3. И. Ингибиторы фосфолипазы А2 модулируют влияние глутоксима и моликсана на внутриклеточный уровень Са2+ в макрофагах. Доклады Академии Наук, 2015, том 465, № 2, сс.1-3.
К статье
Новая модель экспериментального цирроза печени для оценки гепатопротективной и антифибротической эффективности лекарственных препаратов (стр. 88-93)
ШпшЯЯНВ^Н!
л-С^^и,'
А
Рисунок 1.
А) Паренхима печени интактных белых крыс. Окраска по Ван Гизону, об. х20, ок. х15. Б) Паренхима печени интактных белых крыс. Окраска гематоксилином и эозином, об. х40, ок. х15.
Рисунок 2.
А) Паренхима печени белых крыс через 1 неделю интоксикации. Активация коллагеногене-за, формирование соединительнотканных септ. Окраска по Ван Гизону, об. х10, ок. х15. Б) Паренхима печени белых крыс через 1 неделю интоксикации. Дистрофия гепа-тоцитов, макрофагальная и лимфоцитарная реакция. Окраска гематоксилином и эозином, об. х40, ок. х15.
* * яНИ' Т-жааВя
ш
Рисунок 3.
А) Паренхима печени крыс через 2 недели интоксикации. Формирование соединительнотканных септ, коллагенизация центральных вен. Окраска по Ван Гизону, об. х10, ок. х15. Б) Паренхима печени крыс через 2 недели интоксикации. Окраска гематоксилином и эозином, об. х20, ок. х15.
Рисунок 4.
А) Паренхима печени крыс через 3 недели интоксикации. Отчетливое развитие септ и формирование узелков (псевдодолек). Окраска по Ван Гизону, об. х10, ок. х15. Б) Паренхима печени крыс через 3 недели интоксикации. Выраженная дистрофия гепатоцитов, признаки холестаза, резкое расширение синусоидов. Окраска гематоксилином и эозином, об. х40, ок. х15.
Рисунок 5.
А) Паренхима печени крысы через 5 недель интоксикации. Окраска по Ван Гизону. Признаки узелковой перестройки и цирроза печени. Об. х10, ок. х15.
Б) Паренхима печени крысы через 5 недель интоксикации. Нарастание дистрофических изменений гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином, об. х40, ок. х15.
Рисунок 6.
А) Паренхима печени крысы с ДМНА-индуцированным циррозом через 6 недель введения адеметионина. Признаки гемодинамических нарушений и коллагенизации центральных вен. Окраска по Ван Гизону, об. х10, ок. х15. Б) Паренхима печени крысы с ДМНА-индуцирован-ным циррозом через 6 недель введения адеметионина. Сохраняются признаки дистрофии гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином, об. х40, ок. х15.
Рисунок 7.
А) Паренхима печени крысы с ДМНА-индуцированным циррозом через 3 недели введения Na2GCGI в дозе 10 мг/ кг. Коллагенизация минимальна. Окраска по Ван Гизону, об. х10, ок. х15.
Б) Паренхима печени крысы с ДМНА-индуцированным циррозом через 3 недели введения Na2GCGI (10 мг/кг). Окраска гематоксилином и эозином, х40, ок. х15.
ш
Ш
ш
А
Рисунок 8.
А) Паренхима печени крысы с ДМНА-индуцированным циррозом через 6 недель введения Na2GCGI (30 мг/кг). Окраска по Ван Гизону, об. х10, ок. х15. Б) Паренхима печени крысы с ДМНА-индуцированным циррозом через 6 недель введения Na2GCGI (30 мг/кг). Структура приближается к признакам нормы. Окраска гематоксилином и эозином, об. х40, ок. х15.
ч
А
