Новая методика определения эндогенных ацетальдегида и этилового спирта в крови крупного рогатого скота методом капиллярной газовой хроматографии Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВЕТЕРИНАРНЫЕ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ

УДК 619:612 12:636.2 Т< В. ПОСТНОВА

ЭКЦ УВД Омской области ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет»

НОВАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ АЦЕТАЛЬДЕГИДА И ЭТИЛОВОГО СПИРТА В КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Разработана новая методика количественного определения эндогенных ацетальдеги-да и этилового спирта в крови крупного рогатого скота. Подобраны условия про-боподготовки исследуемых объектов методом прямой дистилляции и условия газо-хроматографического разделения ацетальдегида и этилового спирта в полученных дистиллятах.

Ацетальдегид и этиловый спирт — естественные Содержание этих метаболитов в крови крупного

метаболиты, присутствующие в крови млеко- рогатого скота может меняться в зависимости от питающих, в том числе крупного рогатого скота. В рациона кормления, различных физиологических последнее время большое внимание уделяется (возраста, пола, условия содержания и т. д.) и биологическому значению ацетальдегида как кле- патологических состояний. В то же время в доступ-точного регулятора дыхательной цепи митохондрий ной литературе сведения о концентрации этих и участника других важных метаболических пре- веществ в крови животных отсутствуют. Поэтому вращений, происходящих в организмах млеко- изучение содержания эндогенных ацетальдегида и питающих. Высокая биологическая активность этилового спирта в крови представляет большой ацетальдегида позволяет предположить, что именно интерес.

этому соединению, а не этанолу принадлежит важ- В настоящее время известна методика коли-

ная роль в жизнедеятельности клетки. Однако чественного определения этилового спирта в крови этанолу отводится роль подвижного депо, регули- человека методом газожидкостной хроматографии, рующегп концентрацию днетальдегида в клетке но она изживает сроя 12, 3, 4]. Методика разработана

Таблица 1

Нормативы оперативного контроля

Определяемое вещество Диапазон измеряемых масссовых концентраций Сходимость Воспроизподимость Пигрешносп.

Ацетальдегид, мг/дм3 от 0.5 до 10.0 15 18 13

Этиловый спирт, мг/дм; от 0.5 до 10,0 15 1Я 13

Таблица 2

Оценка правильности методики определения

метод концентрация этанола в стандартном растворе. % найдено, % относительная ошибка, %

ГЖХ, алхилнитриты 0.01 | .0096+ /-0,0025 -1.0

ГЖХ 0.01 С,0098 + /-,0013 2.0

Таблица 3

Оценка правильности и воспроизводимости методики определения

проба, п = 2 найдено в пробе мкг добавка, мкг найдено в пробе с добавкой, мкг найдено в добавке, мкг относительная ошибка, % воспроизводимость, %

0,0001 %р-р этанола 24,8В 5,0 29,79 4,95 0,7 5,2

0,0001 % р-р ацетальдегида 24,92 5.0 29,86 4.98 0,5 4,7

в 60-х годах, предполагает использование устаревшего газохроматографического оборудования и при совместном присутствии в исследуемом объекте пропилового, изопропилового и этилового спиртов, определить количественное содержание последнего не представляется возможным. В связи с этим целью данного исследования является разработка методики количественного определения ацеталь-дегида и этилового спирта в крови животных, основанной на использовании современного газохроматографического оборудования.

Исследования выполнены методом капиллярной газовой хроматографии. Исследуемый объект — цельная кровь крупного рогатого скота,

Принцип метода: метод основан на газохромато-графическом разделении исследуемых компонентов с использованием капиллярной колонки и последующем количественном определении ацетальдеги-да и этилового спирта в дистиллятах цельной крови крупного рогатого скота.

Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси поочередно поступают в пламенно-ионизационный детектор, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков. В основе детектирования лежит измерение различий электропроводности пламени чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, поступающей из хроматографической колонки в измерительную камеру детектора.

Установление подлинности веществ производится по времени их удерживания, которое исчисляется от момента введения анализируемого вещества в колонку до появления максимума пика.

Диапазон измеряемых концентраций ацеталь-дегида и этилового спирта - от0,5 до 1000 мг/дм-.

Расчет концентрации ацетальдегида и этилового спирта производят с помощью внутреннего стандарта. Внутренний стандарт - 1,2-пропиленглнколь.

Время хроматографирования — 32 минуты.

Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы [1]

Газовый хроматограф фирмы «Хьюлетт Паккард» (США), модель 5890, серия 2, с пламенно-ионизационным детектором и системой электронного регулирования потока газа-носителя;

Колонка хроматографическая капиллярная «НР -РРАР» (США) 50мх 0,32 мм х 0,52 мкм;

Компьютер с программным обеспечением;

Микрошприц вместимостью 10 мм ';

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ24Ю4;

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919 или колбонагреватель;

Термометры жидкостные стеклянные с ценой деления 0,1 или 0,5 градусов Цельсия по ГОСТ 28498;

Колбы мерные 2-100-2 и 2-25-2 по ГОСТ 1770;

Колбы 2-500-2 по ГОСТ 1770;

Дефлегматор 100 ТС по ГОСТ 20789;

Каплеуловитель по ГОСТ 25336;

Холодильник стеклянный лабораторный по ГОСТ 25336;

Цилиндр 1-100 по ГОСТ 1770;

Пипетки 2-2-10 по ГОСТ 29169;

Ацетальдегид уксусный технический;

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652;

1,2-пропиленгликоль по ТУ 6-09-2434-81 ;

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

Газ-носитель — азот о. ч. по ГОСТ 9293 или генератор азота;

Водород технический марки А по ГОСТ 3022 или генератор водорода;

Воздух сжатый по ГОСТ 17433 или воздушный компрессор любого чипа, обеспечивающий необходимое давление и чистоту воздуха в соответствии с инструкцией по эксплуатации газового хроматографа;

Таблица 4

Оценка воспроизводимости методики определения

№ п/п содержание этилового спирта, % содержание ацетальдегида, %

1 0,00009 0,00025

2 0,00007 0,00024

3 0,00008 0,00026

.»ООО

Рис. 1. Хроматограмма анализа образца цельной крови крупного рогатого скота

Допускается применение других средств измерений, материалов и реактивов с метрологическими характеристиками и по качеству не хуже указанных.

Подготовка пробы и ход определения

Взвешивают 50 г цельной крови в перегонную колбу вместимостью 500 см3, затем добавляют 50 см3 дистиллированной воды. Смесь перемешивают. Колбу со смесью присоединяют к дефлегматору с каплеуловителем и холодильником с прямой трубкой.

При нагревании (бурное вспенивание) смесь подвергают прямой дистилляции и собирают точно 25 см1 дистиллята в мерную колбу вместимостью 25 см '. Ацетальдегид и этиловый спирт отгоняются с первыми миллилитрами дистиллята. Приемную колбу необходимо дополнительно охлаждать.

В 25 см3 полученного дистиллята вносят 2 мм3 внутреннего стандарта. Внутренний стандарт — 1,2-пропиленгликоль. Смесь тщательно перемешивают и подвергают хроматографическому исследованию. Достаточно провести два определения. За результат измерения принимают среднеариф-митическое значение двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать нормативов оперативного контроля сходимости с1, воспроизводимости Б и погрешности К, значения которых приведены в таблице 1 [1].

Условия хроматографирования [1]

Температурная программа термостата колонки: начальная температура - 50 градусов Цельсия, 10 мин, в изотерме, далее подъем температуры со скоростью 15 градусов в минуту до 220 градусов Цельсия, 10 мин. в изотерме;

Температура инжектора -150 градусов Цельсия;

Температура детектора - 230 градусов Цельсия;

Газ - носитель - азот;

Деление потока -1:40.

Хроматограф предварительно градуируют по ацетальдегиду, этиловому спирту и пропиленглико-лю, используя не менее трех градуировочных смесей.

Записывают хроматограммы анализа каждой градуировочной смеси. Регистрируют время удерживания и площади пиков определяемых веществ.

Измерения выполняют не менее двух раз. Градуировку хроматографа выполняют не реже одного раза в две недели. Значения времени удерживания, градуировочных коэффициентов и концентрации внутреннего стандарта заносят в память компьютера. Расчетная концентрация внутреннего стандарта 83,2 мг/дм3.

Контроль точности результатов измерений

Для оценки правильности результатов измерений были проведены исследования объектов по новой методике и известной ранее [2, 3, 4] (табл. 2). Кроме того, правильность и воспроизводимость предлагаемой методики оценивалась методом добавок (табл. 3).

По предложенной методике было проведено исследование образцов цельной крови крупного рогатого скота. Хроматограмма анализа образца цельной крови крупного рогатого скота представлена на рис. 1. Полученные результаты отражены в табл.4.

Таким образом, предложенная методика количественного определения эндогенных ацетальдегида и этилового спирта в крови крупного рогатого скота позволяет получать точные и воспроизводимые результаты, Методика может быть рекомендована для использования в научных исследованиях по биохимии крови млекопитающих, а также для применения в судебной медицине при определении количественного содержания в крови человека как эндогенного, так и экзогенного ацетальдегида и этилового спирта.

Библиографический список

1. ГОСТ Р 51698-2000 Водкаи спирт этиловый. Газохромато-графическийэкспресс-метод определения содержания токсичных микропримесей.-М.: ГОСТСТАНДАРТ РОССИИ, 2000 г.

2. Об обнаружении и определении этилового алкоголя в крови и моче методом газожидкостной хроматографии: Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32.

3. Бережной Р. В., СмусинаЯ. С., Томилина В. В., Ширинский П. П. Руководство по судебно- медицинской экспертизе отравлений. - М.: Медицина, 1980г.

4. Швайкова М. Д. Токсикологическая химия. — М.. Медицина, 1975 г.

ПОСТНОВА Татьяна Вячеславовна, соискатель кафедры химии.

Дата поступления статьи в редакцию: 17.05.06 г. © Постнова Т.В.