CC BY
20
DOI: 1G.23868/2G2112GG6
НОРАДРЕНАЛИН РЕГУЛИРУЕТ ОСТЕОГЕНЕЗ В ЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ПЕРИОД РАЗВИТИЯ
Поступила: 27.11.2021 Принята к печати: 25.122021 Опубликована on-line: 31.12.2021
Н.А. Пасатецкая1, 3, А.И. Лопатин2, С.И. Климшин1, 2, Е.В. Лопатина1, 2
1 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия
3 Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия
NOREPINEPHRINE REGULATES OSTEOGENESIS IN THE EMBRYONIC PERIOD OF DEVELOPMENT
N.A. Pasatetckaia1, 3, A.I. Lopatin2, S.I. Klimshin1, 2, E.V. Lopatina1, 2
1 Pavlov First St. Petersburg State Medical University, St. Petersburg, Russia
2 Pavlov Institute of Physiology Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia
3 Almazov National Medical Research Centre, St. Petersburg, Russia
e-mail: [email protected]
Костная ткань иннервируется симпатическими и сенсорными нервными волокнами, участвующими в регуляции процессов остеогенеза и остеорезорбции на протяжении всей жизни. Фундаментальные исследования и клинические данные подтверждают существование функциональных взаимодействий между нейронами и клетками костной ткани и свидетельствуют о катаболическом и анаболическом действии медиаторов симпатической нервной системы на кость. Однако сведения о регуляции остеоремоделирования в эмбриогенезе практически отсутствуют.
Цель исследования: изучить влияние норадреналина на рост эксплантатов костной ткани в эмбриональный период развития. Работа выполнена на эксплантатах ткани кости 12-дневных куриных эмбрионов с использованием метода органотипического культивирования. Каждая серия эксперимента включала по 120 контрольных и экспериментальных эксплантатов на каждую исследованную концентрацию действующих веществ. В питательную среду экспериментальных эксплантатов добавляли норадреналин (1010 М-10-4 М), пропранолол (10-10 М), атенолол (10-4 М), урапидил (10-6 М) и оценивали морфометрический критерий — индекс площади. Было обнаружено, что норадреналин (10-6 М) стимулирует рост эксплантатов костной ткани через а1-адренорецепторы. Остеотоксический эффект высоких доз препарата реализуется через р2-адренорецепторы. Регуляция остеогенеза норадренали-ном в эмбриональном периоде развития является дозозависимой. Физиологический эффект вещества зависит от взаимодействия с определенным типом адренорецепторов.
Ключевые слова: норадреналин, адренорецепторы, орга-нотипическая культура ткани, эксплантаты ткани кости.
Sympathetic and sensory nerve fibers regulate osteosynthesis and osteoresorption processes throughout life. Fundamental research and clinical data confirm the existence of functional interactions between neurons and bone tissue cells and indicate the catabolic and anabolic effect of sympathetic nervous system mediators on bone tissue. There is practically no information about the regulation of osteoremodeling in embryogenesis.
Objective: to study the effect of norepinephrine on the growth of bone tissue explants in the embryonic period of development. The studies were performed on the bone tissue explants of 12-day old chicken embryos. Norepinephrine (10-10 M — 10-4 M), propranolol (10-10 M), atenolol (10-4 M), urapidil (10-6 M) were added to the experimental Petri dishes. Norepinephrine (10-6 M) stimulates the growth of the bone tissue explants through a1-adrenoreceptors. The osteotoxic effect of high doses of the drug is realized through p2-adrenoreceptors. Embryonic osteogenesis is regulated by norepinephrine in dose-dependent manner. Physiological effect of the substance depends on the interaction with certain types of adrenoreceptors.
Keywords: norepinephrine, adrenoreceptors, organotypic tissue culture, bone tissue explants.
Введение
Как известно, кости не являются статичными структурами, выполняющими исключительно опорную функцию. С момента закладки и до конца жизни они претерпевают постоянные изменения под воздействием внешних и внутренних факторов. Надлежащий баланс процессов остегенеза и остеорезорбции лежит в основе сохранения структуры и функции костей. Костная ткань обильно васкуляризирована и иннервируется сенсорными и симпатическими нервными волокнами. Фундаментальные исследования и клинические данные подтверждают существование функциональных взаимодействий между нейронами и клетками костной ткани. В остеокластах, остеобластах и их клетках-предшественницах обнаружены девять подтипов а- и p-адренорецепторов (a1A, a1B, a1D, a2A, a2B, a2C, pi, p2 и p3) [1]. Результаты, полученные in vivo и in vitro, демонстрируют как катаболический, так и анаболический эффекты агонистов адренорецепторов на костную ткань [2-6]. Наблюдаемый разнонаправленный эффект активации симпатической нервной системы может зависеть от методов исследования и периода
онтогенеза. Однако сведения о регуляции остеоремоделирования в эмбриогенезе практически отсутствуют.
Цель исследования: изучить влияние норадреналина на рост эксплантатов костной ткани в эмбриональном периоде развития.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Исследование проводили на эксплантатах ткани кости 12-дневных куриных эмбрионов. Было выполнено 5 серий эксперимента. Каждая серия включала по 120 контрольных и экспериментальных эксплантатов на каждую исследованную концентрацию действующих веществ. В первой серии эксперимента исследовали влияние норадреналина (ЭкоФармПлюс, Россия) в диапазоне концентраций от 10-10 М до 10-4 М на рост эксплантатов ткани кости. Для изучения механизма ингибирующего действия норадреналина во второй серии эксперимента эксплантаты культивировали в питательной среде,
содержащей норадреналин (10-5 М) и ß1 -адреноблокатор атенолол (10-4 М) (Sigma, США). В третьей серии эксперимента оценивали участие ßg-адренорецепторов в реализации ингибирующего рост эксплантатов действия норадреналина, культивируя их в питательной среде, содержащей норадреналин (10-5 М) и неселективный ингибитор ß-адренорецепторов пропранолол (10-10 М) (Sigma, США). Механизм трофотропного действия норадреналина (10-6 М) изучали в четвертой и пятой сериях эксперимента. Экспериментальные эксплантаты культивировали в питательной среде, содержащей нора-дреналин (10-6 М) в присутствии пропранолола (10-10 М) в четвертой серии и а1-адреноблокатора урапидила (10-6 М) (Sigma, США) в пятой серии эксперимента. Исследование было одобрено комитетом по контролю содержания и использования лабораторных животных ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» МЗ РФ (протокол № 16-6 от 27 мая 2016).
Получение эксплантатов
Бедренную кость очищали от мышц и надкостницы, отсекали эпифизы, затем проводили продольный и несколько поперечных разрезов диафиза. Фрагменты ткани кости размером 1-1,5 мм переносили в чашку Петри, дно которой предварительно покрывали коллагеном (Биолот, Россия), добавляли питательную среду и культивировали в СО2-инкубаторе (Binder, Германия) в течение 3 сут. при 37 °С и 5% СО2 без смены среды. В каждой чашке находилось по 20 эксплантатов костной ткани. Контрольные эксплантаты культивировали в питательной среде следующего состава: 40% раствора Хенкса (Биолот, Россия), 40% среды Игла (Биолот, Россия), 15% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Fisher Scientific, Южная Америка), 0,6% глюкозы (АО «ПФК Обновление», Россия) и 2 мг/мл ципрофлоксацина (Красфарма ПАО, Россия). В питательную среду при культивировании экспериментальных эксплантатов до начала культивирования однократно добавляли норадреналин (10-10 М-10-4М), пропранолол (10-10 М), атенолол (10-4 М), урапидил (10-6 М) согласно протоколу эксперимента.
Оценка эксплантатов
Зона роста представлена клетками неправильной формы с продолговатым ядром — пролиферирующими предшественницами остеобластов и остеокластов, встречаются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (рис. 1) .
Анализ степени роста эксплантатов ткани кости осуществляли с использованием программы ImageJ и мор-фометрического критерия — индекс площади (ИП), который рассчитывали как отношение общей площади эксплантата к площади исходной зоны. За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа. Значение ИП контрольных эксплантатов принимали за 100%. Для визуализации клеток, формирующих зону роста эксплантатов, использовали микроскоп LSM 710 (Carl Zeiss, Германия) ЦКП «Конфокальная микроскопия» Института физиологии им И.П. Павлова РАН и метод дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии, модифицированный для работы с пластиком (Плас-ДИК контраст).
Статистический анализ
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATlSTiCA 10.0. Использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок.
Рис. 1. Зона роста эксплантатов ткани кости 12-дневных куриных эмбрионов. Контроль: Плас-ДИК контраст. Ув х40
Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение (М±а).
Результаты
В первой серии эксперимента при изучении влияния норадреналина на рост эксплантатов было показано, что максимальное стимулирующее действие препарат проявлял в концентрации 10-6 М (рис. 2). ИП экспериментальных эксплантатов был выше контрольного значения на 36,0 ± 1,2% (п=120, р<0,05). В концентрациях 10-10 М и 10-8 М норадреналин на рост эксплантатов ткани кости практически не влиял. Препарат оказывал ингибирующее действие в концентрациях 10-5 М и 10-4 М, ИП экспериментальных эксплантатов был ниже контрольного значения на 45 ± 2% (п=120, р<0,05) и 95 ± 1% (п=120, р<0,01), соответственно.
120
d
§90
10-10 10-8 10-6 ] Контроль I I Норадреналин
10-5 10-4 Концентрация, М
Рис. 2. Влияние норадреналина на рост эксплантатов ткани кости в органотипической культуре ткани. * — р<0,05, ** — р<0,01, различия достоверны относительно контроля
Во второй серии эксперимента введение атенолола (10-4 М) не устраняло ингибирующее
£60
30
0
действие норадреналина (10-5 М). ИП экспериментальных эксплантатов был ниже контрольного значения на 36 ± 1% (п=120, р<0,05) и не отличался от ИП эксплантатов, культивируемых в питательной среде, содержащей только норадреналин (10-5 М). Следовательно, обнаруженный остеотоксический эффект норадреналина не зависит от его взаимодействия с в1-адренорецепторами.
В третьей серии эксперимента при культивировании эксплантатов ткани кости в питательной среде, содержащей норадреналин (10-5 М) и неселективный блокатор р-адренорецепторов пропранолол (10-10 М), ингибирующий эффект норадреналина был нивелирован (рис. 3). ИП экспериментальных эксплантатов был ниже контрольного значения на 17 ± 2% (п=120) и отличался от ИП эксплантатов ткани кости, культивируемых в присутствии только норадреналина, на 28% (р<0,05). Полученные данные позволяют предположить, что ингибирующее рост эксплантатов ткани кости 12-дневных куриных эмбрионов действие норадреналина реализуется с участием Р2-адренорецепторов.
150
90
^ 60
□ Контроль I I Норадреналин |Урапидил I Норадреналин+ Урапидил
Рис. 4. Нивелирование трофотропного эффекта норадреналина (10-6 М) в присутствии урапидила (10-6 М). * — р<0,05, различия достоверны относительно контроля
40
20
Контроль Норадреналин
|Пропранолол | Норадреналин+ Пропранолол
Рис. 3. Нивелирование ингибирующего эффекта норадреналина (10-5 М) на рост эксплантатов ткани кости в присутствии пропранолола (10-10 М). * — р<0,05, различия достоверны относительно контроля, # — р<0,05, различия достоверны относительно ИП эксплантатов, культивируемых в среде в присутствии норадреналина (10-5 М)
При культивировании эксплантатов в питательной среде, содержащей норадреналин (10-6 М) и пропранолол (10-10 М), было показано, что в присутствии пропранолола трофотропный эффект норадреналина сохранялся. ИП экспериментальных эксплантатов был выше контрольного значения на 30,0 ± 1,1% (п=120, р<0,05) и не отличался от ИП эксплантатов, культивируемых в питательной среде, содержащей только норадреналин (10-6 М). Таким образом, можно предположить, что стимуляция процессов клеточного роста и пролиферации клеток зоны роста эксплантатов ткани кости при действии норадреналина в концентрации 10-6 М не связана с влиянием препарата на р-адренорецепторы.
Добавление а1-адреноблокатора урапидила (10-6 М) в питательную среду, содержащую норадреналин (10-6 М), устраняло трофотропное действие норадреналина. ИП экспериментальных эксплантатов не отличался от контрольного значения (рис. 4). Следовательно, тро-фотропное действие норадреналина реализуется через а1-адренорецепторы.
Обсуждение
Иммуногистохимические исследования показали, что сенсорные и симпатические нервные волокна присутствуют в надкостнице и трабекулярной кости, образуя параллельные сети, сопровождающие кровеносные сосуды, прилегающие к костным трабекулам. В меньшей степени нервные волокна расположены в кортикальной кости, эпифизарной ростовой пластинке и костном мозге [7]. Периферические нервные волокна важны для нормального гомеостаза кости и роста скелета в эмбриогенезе, а также принимают участие в восстановлении структуры костной ткани после переломов. Исследования H. Aro (1985) продемонстрировали уменьшение размера костной мозоли после денервации конечностей [8]. В других исследованиях было обнаружено ускорение заживления переломов после резекции нерва или травмы головы [9], однако не уточнялось, связаны ли наблюдаемые эффекты с влиянием медиаторов симпатической нервной системы или опосредованы другими нейротрансмиттерами.
Установлено, что гиперактивация симпатической нервной системы стимулирует остеокластогенез и резорбцию костной ткани за счет активации транскрипционного фактора NF-kB (RANKL) [2], интерлей-кинов 6 и 11 (IL-6, IL-11) и простагландина Е2 [10]. В экспериментальных исследованиях зарегистрировано увеличение массы длинных костей конечностей мыши при блокаде адренорецепторов [4]. В части клинических исследований также было обнаружено предотвращение потери костной массы у пациентов, принимающих р-адреноблокаторы [11, 12]. С другой стороны, известно, что низкие концентрации норадреналина, наблюдаемые после химической симпатэктомии, вызывают резорбцию кости [13]. По-видимому, катехоламины регулируют ремоделирование костной ткани дозозависимо, и оказываемый ими эффект зависит от активации разных типов адренорецепторов.
Девять подтипов а- и p-адренорецепторов (a1A, a1B, a1D, a2A, a2B, a2C, p1, p2 и p3) описаны на поверхности остеобластов и остеокластов. В подавляющем большинстве работ обнаружены р2-адренорецепторы, в то время как информация о наличии и физиологической роли a-адренорецепторов в костных клетках ограничена [1]. Небольшое количество a-адренорецепторов
30
0
80
60
0
на поверхности клеток дает основание предположить, что p-адренорецепторы являются ведущими рецепторами, опосредующими эффект катехоламинов. Необходимо отметить, что а-адренорецепторы обнаружены преимущественно в клеточных линиях, состоящих из недифференцированных остеобластов и остеокластов, а также в линиях, полученных из эмбриональной ткани человека [6]. Таким образом, состав подтипов адренорецеп-торов может отражать стадии дифференцировки клеток ткани кости в источнике культуры клеток и опосредовать регуляцию остеосинтеза катехоламинами в процессе эмбриогенеза.
Проведенные нами исследования выявили тро-фотропное действие норадреналина в концентрации 10-6 М. Препарат стимулировал рост эксплантатов ткани кости на 36% по сравнению с контрольным значением. Уменьшение трофотропного эффекта норадреналина в присутствии неселективного р-адреноблокатора пропранолола не наблюдалось. Однако введение в питательную среду селективного а1-адреноблокатора урапидила устраняло трофотропное действие препарата. Наши результаты согласуются с работой H.H. Huang с соавт. (2009), в которой авторы доказали наличие и функциональную активность а1- и р2-адренорецепторов в клетках линии MG-63 (остеосаркомы человека) и линии HOB (остеобласты длинных костей 17-20-дневного эмбриона человека) [5]. Агонист а1-адренорецепторов циразолин увеличивал пролиферацию клеток линии HOB в дозе 10-6 М, а фенилэфрин стимулировал пролиферацию клеток как линии HOB (в концентрации 10-6 М), так и линии MG-63 (10-7 М-10-5 М). Этот эффект устранял урапидил в дозе 10-4 М. Аналогичные результаты были получены при исследовании влияния адреналина
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Elefteriou F. Impact of the Autonomic Nervous System on the Skeleton. Physiol. Rev. 2018; 98(3): 1083-112.
2. Takeuchi T., Tsuboi T., Arai M. et al. Adrenergic stimulation of osteoclastogenesis mediated by expression of osteoclast differentiation factor in MC3T3-E1 osteoblast-like cells. Biochem. Pharmacol. 2001; 61(5): 579-86.
3. Togari A., Arai M. Pharmacological topics of bone metabolism: the physiological function of the sympathetic nervous system in modulating bone resorption. J. Pharmacol. Sci. 2008; 106(4): 542-6.
4. Bonnet N., Pierroz D.D., Ferrari S.L. Adrenergic control of bone remodeling and its implications for the treatment of osteoporosis. J. Muscu-loskelet. Neuronal Interact. 2008; 8(2): 94-104.
5. Huang H.H., Brennan T.C., Muir M.M. et al. Functional alpha1- and beta2-adrenergic receptors in human osteoblasts. J. Cell. Physiol. 2009; 220(1): 267-75.
6. Fonseca T.L., Jorgetti V., Costa C.C. et al. Double disruption of a2A-and a2C-adrenoceptors results in sympathetic hyperactivity and high-bone-mass phenotype. J. Bone Miner. Res. 2011; 26(3): 591-603.
7. Grassel S.G. The role of peripheral nerve fibers and their neurotransmitters in cartilage and bone physiology and pathophysiology. Arthritis Res. Ther. 2014; 16(6): 485.
8. Aro H. Effect of nerve injury on fracture healing. Callus formation studied in the rat. Acta Orthop. Scand. 1985; 56(3): 233-7.
9. Madsen J.E., Hukkanen M., Aune A.K. et al. Fracture healing and callus innervation after peripheral nerve resection in rats. Clin. Orthop. Relat. Res. 1998; 351: 230-40.
на пролиферативную активность клеток-предшественниц остеобластов мыши MC3T3-E1 [14]. Адреналин дозозависимо стимулировал пролиферацию клеток в диапазоне концентраций 10-9 М-10-5 М через взаимодействие с а-адренорецепторами. Максимальный стимулирующий эффект препарат проявлял в дозе 10-5 М через 48 ч. культивирования.
Важно отметить, что количество адренорецепторов на мембране клеток линий MG-63 и HOB различалось. В клетках эмбриональной линии остеобластов количество ßg-адренорецепторов было ниже, а а1-адренорецепторов в 3 раза выше по сравнению с клетками линии MG-63 [5]. По-видимому, разным количеством а1-адренорецепторов на мембране клеток можно объяснить обнаруженное нами различие эффектов катехоламинов на рост эксплантатов ткани кости куриного эмбриона. В отличие от норадреналина, при введении в питательную среду адреналина (10-14 М-10-4 М) трофотропное действие препарата не наблюдалось [15].
Ранее в аналогичных экспериментальных условиях нами был обнаружен остеотоксический эффект адреналина (10-4 М) [15], реализующийся через активацию ßg-адренорецепторов. Культивирование экспериментальных эксплантатов в присутствии пропранолола, ате-нолола и метопролола на рост эксплантатов ткани кости не влияло [16]. Норадреналин (10-5 М-10-4 М) также ингибировал рост эксплантатов ткани кости при участии ßg-адренорецепторов.
В настоящем исследовании обнаружено, что в эмбриогенезе трофотропный эффект норадреналина реализуется за счет активации а1-адренорецепторов. Высокие дозы препарата оказывают остеотоксическое действие, основанное на активации ßg-адренорецепторов.
10. Kondo H., Takeuchi S., Togari A. Beta-adrenergic signaling stimulates osteoclastogenesis via reactive oxygen species. Am.J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2013; 304(5): E507-15.
11. Bonnet N., Gadois C., McCloskey E. et al. Protective effect of p blockers in postmenopausal women: influence on fractures, bone density, micro and macroarchitecture. Bone 2007; 40(5): 1209-16.
12. Yang S., Nguyen N.D., Center J.R. et al. Association between hypertension and fragility fracture: a longitudinal study. Osteoporos. Int. 2014; 25(1): 97-103.
13. Sherman B.E., Chole R.A. A mechanism for sympathectomy-induced bone resorption in the middle ear. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1995; 113(5): 569-81.
14. Suzuki A., Palmer J.P., Bonjour G. et al. Catecholamines stimulate the proliferation and alkaline phosphatase activity of MC3T3-E1 osteoblast-like cells. Bone 1998; 23(3): 197-203.
15. Пасатецкая Н.А., Лопатин А.И., Кипенко А.В. и др. Ремоделирова-ние костной ткани: возможный вклад адреналина. Волгоградский научно-медицинский журнал 2017; 4(56): 47-50. [Pasatetckaia N.A., Lopatin A.I., Kipenko A.V. et al. Bone remodeling: possible contribution of adrenaline. Volgograd Scientific and Medical J. 2017; 4(56): 47-50].
16. Пасатецкая Н.А. Лопатин А.И., Лопатина Е.В. Сравнительный анализ влияния адреноблокаторов в условиях органотипического культивирования ткани кости. Волгоградский научно-медицинский журнал 2020; 3: 24-9. [Pasatetckaia N.A., Lopatin A.I., Lopatina E.V. Comparative analysis of the effect of adrenoblockers in the conditions of organotypic cultivation of bone tissue. Volgograd Scientific and Medical J. 2020; 3: 24-9].
