CC BY
61
2004 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Ср.г>. ?. Вып. 4
ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 597.55.2:591.12
Е. Л. Новикова, Н. И. Бакаленко, М. А. Кулакова, Е. В. Елисеева, Р. П. Костюченко, А. К. Дондуа, Т. Ф. Андреева
ЯОХ-ГЕНЫ В ЛАРВАЛЬНОМ РАЗВИТИИ НЕРЕИД NEREIS VIRENS И PL A TYNEREIS DUMERILII
Введение. Яох-гены кодируют транскрипционные факторы и являются ключевыми детерминаторами векториальной позиционной информации у всех билатеральных животных [2, 9, 15]. Современная филогения выявляет три ветви билатеральных животных 11, 7]: две ветвиxnepBH4HopoTbix--Ecdysozoa и Lophotrochozoa - и ветвь вторичноротых животных. Существует множество данных о функциях Нох-генов у представителей Ecdysozoa и Deuterostomia Однако у представителей Lophotrochozoa функция Яох-генов изучена явно недостаточно [11, 12, 14]. При этом морфологическое разнообразие планов организации лофотрохозойных животных превосходит разнообразие планов организации животных других эволюционных ветвей. Кластер Яох-генов не может быть не вовлечен в формирование этого разнообразия.
Понимание механизмов функционирования Яодг-генов у лофотрохозойных животных, столь сильно различающихся как по принципам организации тела (сегментированное тело или нет), так и по характеру раннего развития (прямое развитие или нет), могут прояснить основы создания морфологического разнообразия среди таких различных типов животных, как акнелиды, моллюски, плоские черви, немертины и ряд других. Полихеты тип аннелида) относят к наиболее анцестральным представителям лофотрохозойных животных. Гомономно-сегментированные полихеты - базальные представители этого подтипа живот-, ных. В данной работе проанализирован характер экспрессии генов Яох-кластера у двух близкородственных видов морских гомономно-сегментированных полихет, Nereis virens и Platynereis dumerilii в ходе развития трехсегментной личинки этих животных.
Материалы и методы. Сбор материала. Сбор взрослых особей N. virens проводился в районе Морской биологической станции СПбГУ, Белое море, губа Чула. Половозрелых особей отлавливали у поверхности воды во второй половине июня. Искусственное оплодотворение и культивирование зародышей осуществлялись при 10,5°С [8]. Культуру P. dumerilii содержали в лабораторных условиях при искусственном кормлении и освещении, 18°С [10]. Материал фиксировался 4%-ным ПФА (параформальдегид) на 1,75хФБ (фосфатный буфер) и хранился в спирте при -20°С.
Выделение РНК из личиночных стадий развития N. virens. РНК выделяли из различных стадий личиночного развития (дробление, гаструляция, трохофора, нектохета) с использованием TRIzol реагента согласно протоколу фирмы производителя (Invitrogen). Нативность РНК и ее концентрация оценивались после электрофореза в агарозном геле. Очистка РНК от примесей ДНК осуществлялась при помощи набора DNA-free (Ambion) согласно протоколу фирмы производителя.
Реакция осуществлялась при помощи набора one-step-RT-PCR согласно протоколу фирмы производителя (Ambion). Матрицей для синтеза к-ДНК служила РНК различных стадий развития, в качестве праймеров использовались геноспецифические праймеры к 11 различным фрагментам М>/-Яох-генов. Интенсивность амплификации оценивали по концентрации ДНК в маркерных полосах 100 bp ladder (Roche).
© Е. JI. Новикова, Н. И. Бакапенко, М. А. Кулакова, Е. В. Елисеева, Р. П. Коспоченко, А. К. Дондуа, Т. Ф. Андреева, 2004
Клонирование Нох-генов P. dumeriliL Фрагмент гена Pdu-hoxl был клонирован в лаборатории D. Arendt и любезно нам предоставлен; к-ДНК библиотека со стадии метатрохофоры (48 ч развития) была клонирована в плазмиде Sport6 (Invitrogen) в той же лаборатории. Используя вырожденные праймеры к первой и третьей альфа-спирали гомеодомена класса Antp, нам удалось получить из этой библиотеки короткие (около 80 нп) фрагменты генов Pdu-hox2, Pdu-hox3, Pdu-hox4, Pdu-loxS, Pdu-postl, Pdu-post2.
Гнездовые геноспецифические праймеры были сконструированы на основе сиквенса коротких фрагментов и использованы в двух последовательных PCR в паре с векторспецифическими праймерами; в качестве матрицы использовали ДНК библиотеки. Полученные фрагменты Pdu-Нох-гснов были клонированы в плазмиде T-easy (Promega) и секвенированы. Размер фрагментов - несколько сот пар оснований. Первичные последовательности фрагментов Nvi-Нох-кноъ зарегистрированы в базе данных Genebank под номерами: AFI 51663 - AFI 51673.
Приготовление РНК-зондов с дегогсигениновой меткой. Синтез меченых дегогеигенином смысловых и антисмысловых РНК-зондов осуществляли методом транскрипции in vitro при помощи реагентов фирмы «Roche» согласно протоколу изготовителя. В качестве матрицы для синтеза РНК использовали лионеризированные плазми-ды клонированых М>/-#ох-генов и ¿°а!и-#ох-генов. Концентрацию РНК и размер синтезированного фрагмента определяли электрофорезом в агарозном геле, используя в качестве маркера RNA-ladder (Fermentas).
Гибридизация in situ на тотальных препаратах (WMISH). WMISH проводилась согласно описанной ранее методике [13].
Результаты исследований. Анализ экспрессии Nvi-Нох-генов. Данные RT-PCR. Для определения времени начала активации Nvi-Hox-генов методом RT-PCR была проанализирована РНК, выделенная из неоплодотворенной икры и зародышей ранних стадий развития - дробление, гаструляция, ранняя, средняя и поздняя трохофоры. РНК выделяли во всех случаях из 5 тыс. икринок, эмбрионов или личинок. После выделения РНК растворяли в 50 мкл воды. Количество и качество РНК определяли электрофоретически. Методом RT-PCR было установлено, что все гены активируются в раннем личиночном развитии. Временной порядок активации точно установить этим методом трудно, но тем не менее можно говорить о более ранней и стабильной активации первых четырех генов, при этом Nvi-ИохЗ и Nvi-hox2 активируются раньше, чем Nvi-hoxl n Nvi-hox4. Nvi-lox5, Nvi-hox6, Nvi-lox4, Nvi-lox2, Nvi-post2 активируются на трохофорной стадии, но позднее, чем первые четыре гена.
Анализ экспрессии Nvi-Нох-генов и Pdu-Нох-генов. Данные гибридизации in situ. ' Данные гибридизации in situ о начале экспрессии гена могут отличаться от данных RT-PCR, если уровень экспрессии гена ниже порога чувствительности метода WMISH.
Nvi-hoxl начинает экспрессироваться на стадии ранней трохофоры. По мере развития личинки область экспрессии этого гена распространяется на первый и второй ларвальные сегменты. Начиная со стадии метатрохофоры наблюдается экспрессия Nvi-hoxl в зоне сто-модеума (рис. 1, А). На всех стадиях экспрессия поверхностная. В ходе развития нектохеты эктодермальная экспрессия постепенно ослабевает. У поздних нектохет экспрессия Nvi-hoxl наблюдается в нервных ганглиях ЦНС первого и второго сегментов. Рисунки экспрессии гена hoxl абсолютно идентичны у N. virens и P. dumerilii.
Экспрессию гена Nvi-hox2 методом WMISH нам продемонстрировать не удалось, вероятно, вследствие низкого уровня его экспрессии. Для Pdu-hox2 показаны две фазы экспрессии. Первая - ранняя фаза экспрессии, начинается, когда процесс гаструляции еще не завершен. Область поверхностной экспрессии охватывает довольно широкую зону, примыкающую непосредственно к зоне будущего стомодеума, и не распространяется на дорзапь-ную сторону личинки. На стадии трохофоры область экспрессии значительно сужается, образуя узкие полосы по обеим сторонам от стомодеума, совпадающие, вероятно, с наиболее : вентральными частями формирующегося перистомального и первого ларвального сегмента (рис. 1, Б). Эктодермальная экспрессия постепенно затухает к концу трохофорной стадии. -Вторая - поздняя - фаза экспрессии начинается в конце стадии трохофоры в основаниях хетоносных мешков всех трех ларвальных сегментов (рис. 1, В). Экспрессия последовательно исчезает из первого, второго и третьего сегментов по мере становления ларвальных хет.
^ И Я' йитеНШ йа различных стадиях развития личинок
ШиИохЗ на стадии нектохеты Ж - X и Р^Ля ? Д ~ ^ " ^^ на ™и «^атрохофоры; Е -татрохофоры; Я- Ш™1Т-1ох5 «Iеталии3 " ^ и ****** на стадии мена стад^нектохеты;
дии нектохеты; П- М>/. и РЛцюл! на стадии метатрохофоры. нектохеты, О - М.-розй на ста-
Иы-ИохЗ и РсЬа-ИохЗ начинают экспрессироваться очень рано, еще до завершения га-струляции, их обширная зона экспрессии отмечена в эктодермальных дорзолатеральных клетках. На стадии ранней трохофоры происходит перемещение клеток на вентральную сторону, и домены экспрессии №1-ИохЗ и Рйи-кохЗ значительно смещаются в вентральном направлении (рис. 1, Г). Зона экспрессии охватывает все три ларвальных сегмента и будущую пигидиальную зону. К концу стадии трохофоры области экспрессии ИохЗ смыкаются по срединной линии, латеральные домены исчезают, но позже снова появляются полосы экспрессии в сегментах и пигидиальной зоне (рис. \,Д). В период развития метатрохофоры экспрессия в сегментах постепенно затухает, в то время как в пигидиальной лопасти она сохраняется и усиливается на всех последующих стадиях личиночного развития (рис. 1, £). Экспрессия Рби-кохЗ на поздних стадиях пока не проанализирована.
АЫ-Иох4 начинает экспрессироваться практически одновременно с М>/-Нох1. Домен экспрессии Иу1-Иох4 охватывает область второго и третьего ларвальных сегментов (рис. 1, Ж). На нектохете экспрессия Ыл>1-Иох4 отмечается, в основном, в нервной системе. Картины экспрессии генов Мп-кох4 и Рйи-1пох4 практически идентичны.
АЫ-Иох5 начинает экспрессироваться на стадии поздней трохофоры. Позднее зона его экспрессии ограничена эктодермальными клетками вентральной стороны формирующегося третьего ларвального сегмента (рис. 1, 3). По ходу развития нектохеты эктодермальная экспрессия затухает и новый домен появляется в ЦНС.
Экспрессия генов ШЯох5 и Рйи-1ох5 начинается на стадии трохофоры и отмечается в зоне третьего ларвального сегмента (рис. 1, И).
^¿-Иохб начинает экспрессироваться еще позднее - на стадии ранней метатрохофоры. Сильная экспрессия этого гена отмечена в группе билатерально расположенных клеток, лежащих внутри пигидиальной лопасти очень близко к оси симметрии (рис. 1, К). Позднее она затухает и появляется полоса экспрессии в пигидиальной зоне (рис. 1, Л).
Экспрессия №1-1ох4, Ы\'1-1рх2 и М>/'-/?сюг2 отмечена только в развивающейся пигидиальной зоне (рис. 1, М, Н, О).
М>/-ро5/У начинает экспрессироваться значительно раньше гена М>/-/?05/2. Зона его экспрессии - закладывающиеся хетоносные мешки. Экспрессия А^м-ро.«/ также детектируется в хетоносных мешках (рис. 1, П).
Обсуждение результатов. Основным результатом данной работы является анализ пространственно-временных параметров экспрессии Яох-генов в ходе личиночного развития N. Vпет и Р. йцтегШи Установлено, что характер экспрессии уникален для каждого гена и очень динамичен. Ортологичные гены, как правило, дают сходную картину экспрессии.
Очевидно, что начало экспрессии Яах-гена определяет начало детерминации определенного пространственного домена, судьбу клеток которого специфицирует данный Яох-ген.
Для генов Яох-кластера N. \irerts нами показана линейная сцепленность генов в одном фрагменте ДНК [3]. Порядок генов в Яох-кластере следующий: Иох1, Иох2, ИохЗ, Иох4, Иох5, 1ох5, Иохб, 1ох4, 1ох2, роя12, роь11 (неопубликованные данные). Наличие данных об организации кластера позволяют нам делать обоснованные заключения о совпадении очередности М>/-Яох>генов в кластере с порядком доменов их экспрессии вдоль переднезадней оси тела личинки (правило пространственной колинеарности) и порядком активации их транскрипции по ходу развития (правило.временной колинеарности).
Нами показано, что гены Иох1, Иох4, 1ох5 и роБ12 специфицируют первый, второй, третий ларвальный сегменты и пигидий соответственно. Передние границы доменов экспрессии этих генов совпадают с.границами сегментов и лежат колинеарно вдоль передне-задней оси личинки.
Нох1, Иох4 и 1ох5 активируются в определенных небольших клеточных популяциях, позиции которых совпадают с расположением проспективных зон, специфицируемых эти-
ми генами. В дальнейшем происходит как постепенное расширение зон экспрессии этих генов, так и увеличение интенсивности их транскрипции. Ситуация, обратная для генов hox2 и ИохЗ. Они активируются в обширных пространственных доменах самыми первыми в ходе развития личинки, аратем происходит постепенное уменьшение и уточнение зон, которые они специфицируют, после чего зоны экспрессии постепенно исчезают. Важно отметить, что hox2 и ИохЗ начинают экспрессироваться раньше, чем hoxlb а передняя граница экспрессии hox2 лежит антериорнее таковой hoxl.
Активация hoxl и hox4 происходит на ранней стадии развития и связана с закладкой первого и второго ларвальных сегментов.
По данным гибридизации in situ начало экспрессии Nvi-lox5 и Pdu-lox5 приурочено, вероятно, ко времени закладки третьего ларвального сегмента. Функция гена Nvi-hox5 остается неясной.
Активация остальных Нох-генов (Nvi-hox6, Nvi-lox4, Nvi-lox2, Nvi-post2, Pdu-post2) связана со спецификацией различных клеточных доменов в зоне развивающегося пигидия и происходит значительно позднее. Интересно, что ген передней группы Nvi-hox3 также задействован в этом процессе. В этой зоне каждый ген занимает свой характерный домен экспрессии.
Таким образом, наши результаты позволяют утверждать, что в личиночном развитии полихет N. virens и P. dumerilii реализуется принцип временной и пространственной коли-неарности экспрессии генов Яох-кластера. Последовательная активация Яахг-генов происходит в связи со спецификацией последовательно формирующихся территорий вдоль оси тела личинки. Начало формирования таких доменов происходит уже на стадии гаструляции и продолжается на более поздних стадиях развития. Паттерн распределения доменов экспрессии и рисунок перекрывания доменов позволяют говорить о существовании Нох-кода. Уникальное сочетание различных Нох-генов специфицирует различные личиночные сегменты и домены пигидиальной лопасти (рис. 2). Все это говорит в пользу того, что система Яох-генов участвует в создании позиционной информации для организации плана строения личинки. '
Рис. 2. Экспрессия Яох-генов в личинках N. \irens и Р. скитепШ.
Мы можем утверждать, что наши данные не согласуются с представлениями Э. Дэвидсона о реализации функции Яолг-генов, в соответствии с которыми Яод>кластер необходим для формирования взрослого плана тела [6]. Эти представления явились результатом многолетних блестящих исследований лаборатории Э. Дэвидсона организации и реализации программы личиночного развития морского ежа $ггоп%у1осеЫго№ ригригаШь-
(Deuterostomia) [4]. Развитие St. purpuratus является крайне выраженным случаем непрямого развития. Регуляторный путь от материнских цитоплазматических факторов до регйона-лизованного включения тканеспецифических генов относительно короток. Программа формирования позиционной информации в личиночном развитии этого животного довольно проста, поскольку также проста и сама организация этой личинки! Система генов 'Нох-кластера не участвует в программе региональной спецификации личинки. Клетки, в которых они экспрессируются, не участвуют в построении тела личинки. Предназначение этих клеток - формирование тела взрослого животного. Их активная пролиферация и дифференциация происходят перед метаморфозом. Показано, что именно в это время активируется система генов Яох-кластера. Поскольку система Яох-генов участвует в построении взрослого плана тела и у Ecdysozoa, в развитии которых отсутствует личиночная стадия, то возникло предположение о том, что сама система Яох-генов с функцией векторального патерниро-вания возникла в ходе эволюции Bilateria только в связи с необходимостью создания плана тела больших размеров. И если это так, то и у Lophothrochozoa, имеющих непрямой тип развития, например у полихет, система генов Яох-кластера не должна работать для спецификации личиночного развития. Раннее личиночное развитие базальных полихет (нереид) происходит, несомненно, с участием кластера Яох-генов (данное исследование). Это позволяет предполагать, что само возникновение кластера Яох-генов не связано с необходимостью специфицировать план строения взрослого тела. Следует думать, что он стал необходим уже при создании микрофауны билатеральных животных. Для уточнения всех этих предположений необходимо исследовать характер экспрессии генов Яох-кластера у представителей различных таксонов животных с непрямым типом развития.
Кооптации. Вовлечение отдельных Яодг-генов, групп постериальных генов, целых Яох-кластеров в программы развития различных морфологических структур, являющихся эволюционными инновациями, описано многократно [5]. В нашей работе в личиночном развитии нереид также обнаружено это явление, hoxl экспрессируется в клетках дна стома-деума у обоих видов нереид. Природа этих клеток не определена. Pdu-hox2 экспрессируется на стадии метатрохофоры в глубинных клетках, вероятно, в дифференцирующихся хетоб-ластах.
В данной работе показано, что postl у обоих видов нереид не участвует в реализации функции векторального паттернирования. Функция этого гена, вероятно, связана со спецификацией территорий развивающихся параподий [6].
Экспрессия Nvi-hoxó отмечается в группе глубинных клеток на границе третьего сегмента и пигидиальной зоны. Функция этой экспрессии неясна.
Заключение. Данная статья является единственным в научной литературе описанием экспрессии всего кластера Яох-генов у базальных полихет. Ортологичные гены демонстрируют в целом сходный паттерн экспрессии у двух представителей нереид. Анализ экспрессии генов Яох-кластера показывает, что функция этих генов связана с регионализацией тела трохофорной личинки вдоль переднезадней оси в соответствии с правилами спецификации плана тела, показанными и для представителей двух других эволюционных ветвей - Ecdysozoa и Deuterostomia. Это позволяет говорить о наличии общих для всех трех ветвей морфогенетических программ развития. Таким образом, программа позиционной регионализации, в которой участвует Яох-кластер, должна была возникнуть у первичного билатерального предка до расхождения эволюционных ветвей.
Авторы выражают благодарность Ж. Е. Федоровой за помощь в получении материала для исследований и П. Ю. Конюкову за помощь в оформлении статьи.
Summary
Novikova Е. L., Bakalenko N. /.. Kulakova М. A.. Eliseyeva Е. V.. Kostyuchenko R. P., Dondua A. K., Andreye-va T. F. Hox-genes in larval development of nereids Nereis virens and Platynereis dumerilii.
In this work we have analyzed Яох-genes' expression patterns during embryonic and larval development of two homonomously segmented annelids, Nereis virens and Platynereis dumerilii. tfox-cluster of N. virens contains at least
114 ч
eleven genes; we have also cloned seven Hox-genes of P. dumerilii. The expression patterns of Hox-genes in the nereids supports the existence of common rules of Hox-cluster gene expression in three clades (the Deuterostomia, the Ecdysozoa and the Lophotrochozoa), which suggests that the function of vectorial patterning along the antero-posterior axis may have been realized in Urbilatería.
Литература
I. Aguinaldo A. M, Turbeville J. M., Linford L. S„ Rivera M. C., GareyJ. R., RaffR. A., Lake J. A Evidence for a clade of nematodes, arthropods and other moulting animals // Nature. 1997. Vol. 387. P. 489-493 2. Akam M. //ox-genes and the evolution of diverse body plans // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1995. Vol.349. P. 313-319. 3. Andreeva T. F, Cook Ch., Korchagina N. M., Akam M., Dondua A. K. Cloning and analysis of structural organization of //ox-genes in the Polychaete Nereis virens // Ontogenez. 2001. Vol. 32. P. 225-233. 4. Arenas-Mena С., Cameron A. R., Davidson E. H. Spatial expression of tfo*-cluster genes in the ontogeny of a sea urchinII Development. 2000. Vol. 127. P. 4631-4643. 5. Davidson E. H. Genomic regulatory systems. Pasadena, 2001. 6. Davidson E. H„ Peterson K. J., Cameron R. A. Origin of bilaterian body plans: evolution of developmental regulatory mechanisms // Science. 1995. Vol.24. P. 1319-1325. 7. deRosaR., GrenierJ.K., AndreevaT., CookC.E., Adoutte A., Akam M., CarrollS.B., Balavoine G. Hox-genes in brachiodods and priapulids and protostome evolution // Nature. 1999. Vol. 399. P lll-llb. 8. Dondua A. K. Effect of actinomycin D and sibiromycin on the embryonic and larval development of Nereis virens (Sars.) // Ontogenez. 1975. Vol.6. P. 475-484. 9. Carroll S. В., GrenierJ.K.. Weatherbee S. D. From DNA to Diversity: Molecular Genetics and the Evolution of Animal Design. Maiden, 2001. 10. HauenschildC., Fischer A. Platynereis dumerilii: Mikroskopische Anatomie, Fortpflanzung, Entwicklung, Grosses Zoologisches Praktikum. Stuttgart, 1969. \\. Irvine S. Q„ mariindak M. Q. (2000). Expression patterns of anterior Hox-genes in the polychaete Chaetopterus: correlation with morphological boundaries // Dev. Biol. 2000. Vol.217. P. 333-351. 12. Kmita-CunisseM„ LoosliF., BierneJ., Gehring W. J. Homeobox genes in the ribbonworm Lineus sanguineus: evolutionary implications // Proc Natl Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 3030-3035 13. Kulakova M. A., Kostyuchenko R. P., Andreeva T. F., Dondua i. K. The abdominal-B-like gene expression during larval development of Nereis virens (Polychaeta) // Mech Dev. 2002. Vol. 115. P. 177-179. 14. Lee P. N.. Callaerls P.. deCouetH.G., Martindale M. O. Cephalopod tfox-genes and the origin of morphological novelties // Nature. 2003. N424. P. 1061-1065. 15. Peterson K. J.. Davidson E. H. Regulatory evolution and the origin of the bilaterians // Prqc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 4430-4433.
Статья поступила в редакцию 17 июня 2004 г.
