CC BY
0Материалы и методы
Воздействие на клетки НСТ116 доксорубицином (100 и 150 нМ) проводили по схеме: 24 ч инкубации ^ 24 ч в среде без препарата ^ 24 ч повторное воздействие ^ съем первой точки ^ 4 сут в среде без препарата ^ съем второй точки. В работе использовали методы вестерн-блот анализа, проточную цитофлу-ометрию, окрашивание кристаллическим фиолетовым и на активность ß-галактозидазы.
Результаты
С помощью низких доз доксорубицина в клетках НСТ116 был установлен фенотип клеточного старения. Мы культивировали клетки в среде с нормальным (4,5 г/л) и пониженным (1 г/л) содержанием глюкозы. Установлено, что снижение глюкозы в среде не влияет на сам фенотип старения. В обеих экспериментальных группах наблюдалось наличие окраски на ß-галактозидазу, остановка клеточного цикла, повышение ключевых маркеров старения р21, р-р53, р-уН2АХ (первая точка). Показано, что пониженная концентрация глюкозы в среде приводит к образованию значительного числа клонов клеток, вышедших из стадии старения после снятия воздействия препарата и вернувшихся к повторной пролиферации. Этот процесс сопровождался снижением уровня белка р21. Окраска на маркеры ауто-фагии показала уменьшение уровня ее ключевых регуляторов (Atg5, Beclin) и снижение интенсивности процесса (LC3A/B) (вторая точка). Клетки, культивируемые в среде с нормальным содержанием глюкозы, демонстрировали значительно менее выраженную способность к выходу из стадии старения. Мы не наблюдали снижения уровня р21, а также изменения в экспрессии генов аутофагии в данной экспериментальной группе.
Выводы
Дефицит глюкозы в культуральной среде не влияет на становление фенотипа старения, индуцируемого низкими дозами доксорубицина; способствует формированию большего числа повторно пролиферирующих клонов после снятия воздействия, этот процесс сопровождается снижением уровня белка р21 и генов — регуляторов аутофагии.
Работа поддержана РНФ № 22-24-00212.
Использованная литература
1. Llop-Hernandez, A ., Verdura, S . , Cuyas, E ., and Menendez, J . A . (2022) Nutritional Niches of Cancer Therapy-Induced
Senescent Cells, Nutrients, 14 .
NK-клеточная иммунотерапия: получение функционально
активной популяции
Авторы:
(1) Лукашина Марина Игоревна, mlukashina@mail.ru, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва
(2) Моллаев Мурад Довлетович, md-mollaev@yandex.ru, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва
(3) Посвятенко Александра Викторовна, sandra.posvjatenko@gmail.com, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва
(4) Кибардин Алексей Владимирович, alexey.kibardin@gmail.com, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Ро-гачева» Минздрава России, Москва
(5) Масчан Михаил Александрович, mmaschan@yandex.ru, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва
(6) Ларин Сергей Сергеевич, sergei_larin@mail.ru, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва
Ключевые слова
NK-клетки, получение, культивирование, функциональная активность
Актуальность
В последние годы иммунотерапия рака стала одним из основных направлений терапии злокачественных опухолей благодаря клеточным продуктам, разрешенным для применения в клинике. Терапия Т-клетками с
химерным антигенным рецептором (CAR-Т-клетки) продемонстрировала значительную эффективность при лечении онкогематологических заболеваний, но крайне ограниченное воздействие на солидные опухоли, что заставляет искать новые подходы и возможности. Натуральные киллерные клетки (NK-клетки) представляют собой популяцию эффекторных клеток с мощной противовирусной и противоопухолевой активностью. Они обладают способностью быстро распознавать и убивать патологические клетки без необходимости предварительной стимуляции, имеют различные механизмы цитотоксического действия. Проведенные клинические исследования препаратов на основе NK-клеток показали многообещающие результаты эффективности и безопасности. Использование NK-клеточной терапии предполагает введение пациенту значительных количеств клеточной массы.
Цель
Разработка технологии получения и экспансии NK-клеток в культуре является критически важными, хотя и длительным, и трудоемким процессом.
Материалы и методы
Источником для экспансии NK-клеток служила периферическая кровь. Выделение мононуклеарной фракции клеток проводили в градиенте плотности фиколла, а также применяли магнитную сепарацию. Полученную мононуклеарную фракцию культивировали в присутствии фидерной линии K562-mIL15-mIL21-4-1BBL в течение 3 нед.
Результаты
В результате культивирования были получены значительные количества NK-клеток: увеличение от исходного количества от 50 000 до 100 000 раз, содержание NK-клеток в конечной популяции составляло от 80 до 98%. Оценку функциональной активности полученных клеток проводили в прямом цитотоксическом тесте с флуоресцентной визуализацией против опухолевых клеточных линий: К562, меланомы, нейробласто-мы. В цитотоксическом тесте наблюдали 100% гибель мишеней через 48-72 ч кокультивирования. Кроме того, с помощью проточного цитометрического анализа проводили оценку маркера дегрануляции (CD107a) против клеточной линии К562. При кокультивировании NK-клеток и клеток К562 маркер дегрануляции увеличивался в среднем в 4 раза по сравнению с интактными клетками. Для оценки возможности хранения полученных функциональных NK-клеток их криоконсервировали. Функциональную активность после размораживания проверяли в тестах, аналогичных свежеприготовленным клеткам. Все характеристики сохранялись.
Выводы
Таким образом, разработан и апробирован протокол экспансии и масштабной наработки NK-клеток, пригодных для клинического применения.
Список литературы
1. Lanier, L . L . Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition // Nat . Immunol . 2008 . 9, 495-502 . 2 . Prager, I . & Watzl, C . Mechanisms of natural killer cell-mediated cellular cytotoxicity // J . Leukoc . Biol . 2019 . 105, 1319-1329 .
Эффективность анализа экспрессионных биомаркеров в практике Пап-теста у женщин репродуктивного возраста
Авторы:
(1) Мельникова Н. В., n_melnikova@list.ru, ФГБУ «Российский научный центр рештенорадиологии» Минздрава России, Москва
(2) Боженко В. К., vbojenko@mail.ru, ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, Москва
(3) Близнюков О. П., blisnukov@mail.ru, ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, Москва
(4) Антонова И. Б., iran24@yandex.ru, ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, Москва
(5) Ивашина С. В., s.ivashina@bk.ru, ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, Москва
