CC BY
50
© ОСИПЕНКО Б.Г., ПОЛЯКОВА Л.О. -
НИТРОЗОДИМЕТИЛАМИН - ГЕПАТОТРОПНЫЙ ЯД И КАНЦЕРОГЕН: ОСТРОЕ И ПОДОСТРОЕ ОТРАВЛЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ (сообщение 3)
Б.Г. Осипенко, Л. О. Полякова
(Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов; Иркутский государственный педагогический университет, ректор — к.ф.-м.н., проф. A.B. Гаврилюк)
Резюме. Острые и подострые отравления нитрозодиметиламином (НДМА) сопровождаются повреждением биохимических систем печени с послелующим некрозом гепатоцитов. Наиболее уязвимым звеном считают белково-синтезирующую систему. Обнаруживается связь между повреждением гепатоцитов и метаболизмом НДМА в печени.
Ключевые слова. Нитрозодиметиламин, острые и подострые отравления, биохимия печени.
Острое отравление
Выявление высокой токсической и канцерогенной активности НДМА резко стимулировало исследование биохимических основ этих аффектов. Однако здесь наметилась тенденция к решению узких вопросов, касающихся патологии печени, и в литературе имеются лишь единичные сведения о состоянии других систем.
В сыворотке крови кроликов, отравленных НДМА (7 мг/кг) на высоте интоксикации обнаруживалось увеличение содержания непрямого (свободного) билирубина, холестерина, активация псевдохолинэстеразы и транзиторная гипергликемия. Моча этих животных давала положительную реакцию на билирубин. При отравлении крыс (НДМА в дозе 50 мг/кг) все авторы наблюдали, кроме того, относительное снижение содержания сывороточных белков, изменение соотношения их фракций, снижение активности АТФ-азы, увеличение содержания пирувата, и активацию в сыворотке глу-матико-пировиноградной и щавелевоуксусной транс-миназ, уроканиназы.
Согласно другим данным, некрогенные дозы НДМА к концу 18 часа интоксикации вызывали у крыс Spraque-Dawley увеличение активности сорбитолдегидрогеназы, глумататдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы и ор-нитинкарбамоил-трансферазы [18]. При глубоких поражениях печени в сыворотке крови крыс было найдено почти четырехкратное увеличение активности про-лил-4гидроксилазы [32].
Подавляющее большинство из названных эффектов свидетельствовало о глубоких повреждениях структуры и функции печени при отравлениях НДМА, что объяснялось его выраженным избирательным гепатот-ропным действием.
Наиболее распространенная точка зрения на происхождение центролобулярных некрозов при воздействии гепатотропных ядов уделяет основное внимание гипоксическому фактору: нарушению внутричерепного кровообращения, снижению содержания кислорода в крови или уменьшению потребления кислорода печеночной тканью [20,27,31]. Считают, что гибель клеток может быть связана со всеми перечисленными видами гипоксии (смешанный тип гипоксии). Однако, нередко главную роль отводят нарушению потребления кислорода печенью, связанному с повреждением дыхательного метаболизма в гепатоцитах [1,2].
Относительно НДМА было показано, что при остром отравлении он может снижать потребление кислорода крысами. Введение вещества в некротизирующих дозах (7,10 мг/кг) кроликам вызвало снижение уровня
Р02 в мышцах задних конечностей уже в первые часы интоксикации. Однако насыщение кислородом артериальной крови сохранялось при его значительном падении в венозной крови. То есть, элементы гипоксии при остром отравлении НДМА имели место, что подтверждалось ранним накоплением в крови молочной и пиро-виноградной кислот. Вместе с тем, показано, что кровоток в печени при отравлении НДМА увеличивается и его токсическое действие реализуется в условиях интенсивного потребления кислорода гепатоцитами [24].
Такие данные позволили отвергнуть ишемическую гипотезу происхождения некрозов в печени при отравлении НДМА [24] и искать первичные механизмы ге-патотоксического действия на уровне дыхательного метаболизма клеток.
Bailie, Christie [5] после латентного периода, равного 12 часам (НДМА в дозе 100 мг/кг), наблюдали значительное снижение аэробного окисления пирувата, L-малата, цитрата, в-оксибутирата, октаноата, L-глутама-та, а-оксиглютарата. Гликолитическая и сукцинатокси-дазная активности при этом оставались нормальными, даже в условиях гистологически определяемых обширных некрозов.
Уровень НАД в гомогенате и в митохондриальной фракции печени крыс, отравленных смертельной дозой НДМА (100 мг/кг), через 6 часов оказывался неизменным, но он снижался к концу 11-12 часов интоксикации.
В этих условиях прямая кореляция между убылью НАД и окисления биосубстратов, найденным Bailie, Christie [5] давала возможность говорить о зависящем от НАД угнетении активности соответствующих энзимов. Действительно, добавление в инкубационную среду НАД частично восстановило аэробное окисление субстратов, нарушенное при интоксикации НДМА. Коэнзим А (КоА), НАДФ и АТФ не обнаруживали такой способности [5].
Вместе с тем, добавление НДМА к изолированным митохондриям в концентрации 10 мг/кг не влияло на окисление ряда субстратов.
In vitro НДМА (0,13 мг/кг) не изменял окислительное фосфорилирование в митохондриях печени крыс [24].
In vivo НДМА в дозе 50 мг/кг через 2 часа после введения не изменял в печени активность НАДФ- и НАДФ-Н-цитохром-С-редуктазы [9]. Однако, согласно другим данным, введение некрогенных доз НДМА приводило к резкому снижению сумм НАД + НАДН в печени крыс уже к концу 3-го часа интоксикации. Убыль содержания
НАДФ и НАДФ-Н обнаруживалась спустя 2 часа после введения вещества. Синтез НАД не нарушался даже при выраженном повреждении печени [24].
В целом эти данные не послужили достаточныш основанием для выводов о том, что нарушение дыкания может быгть первопричиной дезорганизации обмена в гепатоцитах. На первыш план выступали аффекты, связанные с повреждением синтеза белков в печени.
Уже в начале исследований гепатотоксического действия НДМА быто замечено, что острое отравление сопровождается развитием белковой дистрофии в гепа-тоцитах. Затем быто найдено, что наиболее характерной особенностью действия НДМА на печень является раннее угнетение синтеза белков в микросомальном аппарате гепатоцитов.
Включение меченыгх по С14 аминокислот в белки печени после введения некротизирующей дозы НДМА крысам нарушалось уже через 3 часа во всех субклеточный фракциях [24]. Концентрация в них свободный аминокислот, их включение в свободный аминокислотный пул при этом значительно не изменялись. В белки рибосом печени крыс включение аминокислот подавлялось уже к 30-й минуте интоксикации [10].
Chu, Mirvish [8] нашли, что ряд нитрозаминов, в том числе НДМА, не влияют на транспорт аминокислот в клетки печени, но в этих условиях изменяется величина свободного пула лейцина.
Анализируя причины нарушения синтеза белка при интоксикации НДМА, Magee [24] предположил, что этот эффект не связан с дефицитом аминокислот или с повреждением кодирования белка на матрице в рибосомах. Наиболее вероятный эффект может возникать на стадии активации и переноса аминокислот. Однако активация аминокислот, судя по лимитирующему процесс содержанию пирофосфата — АТФ, окислительному фосфолированию и индукции аденозинтрифосфа-зы, не нарушалась.
In vitro быто вытвлено незначительное нарушение взаимодействия между С14 — лейцином и s-РНК в микросомах печени крыс в присутствии РН 5,0-ферментов и НДМА [7]. In vivo и in vitro угнетение биосинтеза белков сопровождалось ингибированием включения меченых по С14 оротата и аденина в РНК [33]. Значительного угнетения включения Р32 в ядерную и цитоплазмати-ческую РНК печени отравленный НДМА крыс не наблюдалось [25].
Вместе с тем, быто отмечено, что введение НДМА в некрогеннык дозах (30-100 мг/кг) уже спустя 1-3 часа приводит к деградации полисом печени крыс и мышей [11]. Рибосомно-полисомныш профиль представлялся увеличением фракций олиго- и монорибосом и малой выграженностыю фракции полирибосом. Из этого следовало, что распад полисом и повреждение их матричной активности могли быгть основной причиной угнетения белкового синтеза в клетках печени при отравлении НДМА.
Последний вопрос явился специальным предметом исследований Mizrahi et al. [25]. Авторы изучали возможность потери информационной РНК полирибосомами печени крыс через 2-5 часов после внутривенного введения НДМА в дозе 100 мг/кг. Оказалось, что по-стмитохондриальная фракция отравленнык НДМА жи-вотнык более интенсивно, чем фракция контрольный, включала С14 — фенилаланин в присутствии искусствен-
ной информационной PHK — поли-У. Эти данные свидетельствовали о том, что соответствующие точки для экзогенной информационной PHK в полисомах насыщались у интактных животных более низкими концентрациями поли-У, чем у подопыгтнык. Такой характер процесса наблюдался после обработки полисом рибо-нуклеазой, когда они распадались на мономеры, благодаря утрате информационной PHK.
Mager, Bornstein [24], исследовавшие усиление полимеризации фенилаланина полиуридиловой кислотой микросомами печени крыс, отравленных HДMА (10 мг/ крыса), высказытали предположение, что этот эффект отражает повышение сродства поверхности рибосом к взаимодействию с экзогенным кодирующим агентом. Вместе с тем факт снижения активности включения собственных аминокислот в белки, и может быпъ объяснен деструкцией, связанной с рибосомами информационной PHK и следующей за этим демаскировкой обычно защищенных мест связывания.
В отличие от полисом монорибосомальная фракция пе могла использовать поли-У для синтеза полифени-лаланина. Это наводило на мысль, что монорибосомы при воздействии HДMЛ оказытаются лишенныши м-PHK и пептидил-т-PHK [10]. Данные в пользу такого предположения быти вскоре получены [З0].
В целом такие данные позволяли сделать вытод, что HДMА может ускорять распад информационной PHK, повреждая тем самым рибосомальную белково-синте-зирующую систему клеток печени. Такой вывод, однако, пе мог быгть исчерпытающим. In vitro HДMЛ снижал вязкость ДHK [З].
In vivo некрогенные дозы HДMА вызытали нарушения синтеза ДHK, разрыты нитей ДHK и изменение ее константы седиментации [ЗЗ], а так же хроматографи-ческого профиля белков хроматина клеток печени крыс [16], его термостабильности и угнетение ядерной PHK-полимеразы [14]. Из этого следовало, что нарушение синтеза белков в гепатоцитах при интоксикации HДMА могло быть связано с повреждением не только рибосом, но и ядерного генетического материала. В основе таких повреждений могло лежать изменение молекулярной структуры как нуклеиновый кислот, так и белков.
Argus et al. [4] впервые высказали мысль о том, что токсические и канцерогенные свойства H^M^- обусловлены его способностью денатурировать белки. В опытах авторов H^M^- при инкубации с ним вызытал преципитацию овальбумина и альбумина бычьей сыворотки. Преципитация усиливалась при добавлении в среду хлорида ртути, йодата калия, перекиси водорода и тормозилась в присутствии йодуксусной кислоты.
Такая зависимость давала возможность предположить, что преципитация в этих условиях обусловлена возникновением необычных связей между молекулами белков за счет реакции тиолдисульфидного обмена.
Указанная точка зрения пе лишена оснований, поскольку хлорид ртути является тиоловым реагентом, образующим S-Hg-S- мостики, а иодат калия и перекись водорода способны окислять SH-группы до дисульфидов. Таким образом, названные реагенты и HÍM^- могли действовать па сульфгидрильные группы однонаправленно. В противоположность этому иодук-суспая кислота, алкилируя SH-группы, должна быта препятствовать образованию дисульфидных связей, предупреждая преципитацию белков.
Такая интерпретация биомеханизма действия НДМА на белковую молекулу предполагала возможность «защиты» белка тиолосодержащими низкомолекулярными соединениями. In vitro в опытах Argus et al. [4] цистеин полностью предотвращал вызываемое НДМА соединение овальбумина. Этот эффект достигался даже в условиях добавления цистеина в инкубационную среду по истечении 40 минут с момента контакта НДМА с белками.
К сожалению, «денатурационная концепция» Argus et al. [4] (в том, виде, как они ее излагали) не получила дальнейшего развития в связи с накоплением новых данных, полученных в экспериментах с меченым С14 — НДМА. Было выявлено, что инкубация срезов печени с радиоактивным НДМА приводила к появлению метки в сериновом, метиониновом, лизиновом, гистиди-новом и цистеиновом аминокислотных остатках ядерных и цитоплазматических белков [24,34].
Метилированию подвергались также фосфолипид-ная фракция печени и нуклеиновые кислоты. Метка определялась во всех фракциях ядерных и цитоплазма-тических РНК, ДНК ядер и митохондрий печени [6,19]. Метилирование нуклеиновых кислот происходило в необычном для нуклеотидов положении на уровне гуанина с образованием необычного основания — 7 метил-гуанина. Частично метка обнаруживалась в С6 — 0 — положении гуанина, в 1 и 3 положениях аденозина и в 1- аденина [13].
Печень оказалась не единственным органом, где выявлялись эффекты метилирования макромолекул у животных. В небольшом объеме метилированные производные белков и нуклеиновых кислот были найдены в почках, селезенке, поджелудочной железе, мозге и других органах [29].
Эти данные устанавливали тесную связь между повреждением структуры макромолекул, могущем определять токсическое действие НДМА, и разрушением его в организме до метилирующего метаболита. Однако к настоящему времени лишь намечены гипотетические пути биотрансформации этого вещества.
В соответствующем разделе на метаболических реакциях НДМА мы остановимся более подробно. Здесь же укажем, что основная масса яда разрушается в печени в течение небольшого отрезка времени. Интенсивность метаболизма у различных видов животных варьирует. Наиболее активно этот процесс протекает у хомячков и у крыс (период полураспада НДМА у крыс равен 4 часам). Судя по образованию СО2 из НДМА и метилированию гуанина ДНК печени, у человека скорость метаболизма вещества лишь немного меньше, чем у крыс [26].
В целом острое токсическое действие НДМА, согласно экспериментальным данным, опосредуется из-
бирательным повреждением структуры и функции печени. Эта особенность, по-видимому, связана с метаболическими превращениями вещества до высоко реакционных метилирующих дериватов, модифицирующих макромолекулярные структуры гепатоцитов. Основное внимание при этом уделяют необратимой дезорганизации белковых синтезов.
Подострое и хроническое отравление
Подострое отравление НДМА (7 мг/кг) у кроликов сопровождалось изменениями в коагуляционной ленте Вельтмана (сдвиг вправо), устойчивости коллоидов сыворотки и увеличением содержания непрямого (свободного) билирубина в крови. В моче было найдено содержание сахара, выявлена положительная качественная реакция на билирубин. При подостром отравлении НДМА (2 мг/кг, 18 инъекций внутрибрюшинно) в крови подопытных крыс в течении всего эксперимента (23 суток) оказывалось сниженным содержание сахара. К концу восьмых суток опыта в сыворотке крови наблюдали накопление липидов. В моче было найдено возрастание количества мочевины.
При ингаляционном воздействии (2 мкг/л по 4 часа в сутки в течении 12 месяцев) этими авторами обнаружена фазовость потребления крысами кислорода и ли-пидемия.
Длительное ингаляционное воздействие НДМА (0,05 и 0,4 мг/м3) вызывало снижение содержания альбуминов (через 5-8 недель), увеличение содержания р— глобулинов и убыль гамма-глобулинов (через 3 недели) в сыворотке крови крыс. При этом наблюдали гипер-холестеринемию, возрастание активности сывороточных аланин- и аспарагин-аминотрансфераз.
Hoch-Ligetti et а1. [15] измеряли активность р-глю-куронидазы и лактатдегидрогеназы в печени, почках и легких крыс при длительном скармливании НДМА и диэтилнитрозамина. В период между 7-10 неделями эксперимента в печени и почках повышалась активность р-глюкуронизады. В легких она увеличивалась к середине 19 недели. Возрастание активности этого энзима зависело от времени воздействия веществ, но не от их дозы.
В совокупности такие результаты указывали на то, что в условиях подострого и хронического воздействия НДМА могут наблюдаться элементы повреждения печени, свойственные острому отравлению, нарушения белковой, липидной и пигментной функции и, по-видимому, проницаемости клеточных мембран.
Этих данных, однако, явно недостаточно. Их значимость для интерпретации биомеханизма токсического и, тем более, канцерогенного действия НДМА (в описанных условиях эксперимента индуцировались опухоли печени, почек и легких) оставалась не ясной.
NITROSODIMETHYLAMIN - HEPATOTROPIC POISON AND CANCEROGENE (MESSAGE 3)
B.G. Osipenko, L.O. Poljakova (Irkutsk State Medical University)
Acute poisonings by dimethylnitrosamine (NDMA) are accompanied by damaging biochemical systems of liver with following hepatocyties necrosis. The weakest point is protein-producing system. The damaging of hepatocytes and metabolism of NDM A in liver show the relation.
ЛИТЕРАТУРА
I. Аковбян В.А. Изменение газового состава крови, внешнего дыхания и гемодинамики при экспериментальном токсическом гепатите: Автореф. дис... канд. мед. наук.
— Ташкент, 1968. — 136 с.
2 Герасимов А.М. Энзимологическое исследование состояния митохондрий печени крыс при остром отравлении гепатотропными ядами: Автореф. дис. канд. мед. наук. — Москва, 1967. — 32 с.
3. Зыбина Д.А., Круглякова К.Е., Еммануэлъ Н.М. Автокаталитический характер процессов взаимодействия некоторых химических мутагенов с ДНК // Супермутагены. - М.: Наука, 1966. - С.72-78.
4. Argus M, Acrcros J., Alam A. A viscometric study of hydrogen — binding properties of carcinogenic nitrosamines a related compounds // J. Med. Chem. — 1999. — Bd. 36, № 8.
— S.1083-1058.
5. Bailie M., Christie G. The acute toxic action of dimethylnit-rosamine on liver cells // Biochem. J. — 1959. — Vol. 72, №№ 3. — P.473-479.
6. Barnes J. Nitrosamines // Essays Toxicology - J№ У. — London. — 1974. — Vol. 5. — P.1-15.
7. Brouwers J., Emmelot P. Microsomal N-demethylation and hepatic carcinogen dimethylnitrosamine on amino acid incorporation into the proteins of rat liver and hepatomas // Exptl. Cell Res. — 1990. — Vol. 293, J№ 3. — P.467-474.
8. Chu C., Mirvish S. Effects of N-nitroso compounds on the specific radioactivity of liver proteins after injection of 14C
— leucine into rats // Cancer Res. — 1977. — Vol. 37, J№ 5. — P.1564-1570.
9. Claveland P., Smuckler E. Effect of CCl4, dimethylnitro-samine and thyoacetamide on hepatic DPNH and TPNH cytochrome — C reductase // Proc. Soc. Exptl. Biol. And Med. — 1965. — Vol. 120, J№ 5. — P.808-810.
10. Delpino A., Ferrini U. On the functional state of liver ribo-somes following administration of the carcinogen dimeth-ylnitrosamine // Europ. J. Cancer. — 1993. — Vol. 9, J№ 4. — P.245-252.
II. Gravela E, Pani P., Bertone G. Changes in the hepatotoxic-ithy by dimethylnitrosamine relation to modifications of the drug metabolizing enzyme system // Ital. J. Biochem. — 1998. — Vol. 23, JJ 6. — P.402-411.
12. Gronov M, Thackrah T. Nuclear protein changes during the nitrosamine indused carcinogenesis of rat liver // Chem. — Biol., Interactions. — 1974. — Vol. 9, JJ 3. — P.225-236.
13. Harris G., Autrup H., Stonner G. Metabolism of dimethylnitrosamine and 1,2 dimethylhydrazine in cultured human brondi // Cancer Res. — 1977. — Vol. 37, JJ 7, part l. — P.2309-2311.
14. Herzog J., Farber J. Inhibition of rat liver RNA polymerases by action of the methylating agents dimethylnitrosamine in vivo // Cancer Res. — 1996. — Vol. 236, JJ 5. — P.1761-1770.
15. Hoch — Ligetti C., Lobi L., Arvin J. Effect of nitrosamine derivatives on enzyme concentrations in rat organs during carcinogenesis // Brit. J. Cancer. — 1989. — Vol. 18, JJ 1. — P.271-284.
16. Huang P., Stewart B. Dimethylnitrosamine — induced changes in composition of rat liver chromatin protein // Lancer Lett. — 1977. — Vol. 2, JJ 6. — P.341-347.
17. Hultin T., Arrhenius E., Low H., Magee P. Toxic liver injurg. Ihibition by dimethylnitrosamine of incorporation of labelles amino acid into proteins of rat-liver preparations in vitro // Biochem J. - 1960. - Vol. 76, № 1. - P.109-116.
18. Korsrund G., Grice H, Goodman T. Sensitivity of several serum enzymes for the detection of thioacetamide, Bimeth-ylnitrosamine, - diethanolamine — induced liver damage in rat // Toxicol and Appl. Pharmacol. - 1993. - Vol. 26, №№ 2.
- P.299-313.
19. Liu Yu-Xin., Guttenplan J. Mutation specificitiec of N-nit-rosamines in a host-mediated assay. Comparison. with direct acting N-nitroso. compounds in vitro // Mol. Carcino-genes. - 1992. - Vol. 6, №№ 4. - P.232-237.
20. McLean E., Bras G., McLean A. Venous acclusions in the liver following nitrosodimethylamine // Brit. J. Expt. Pathol.
- 1965. - Vol. 6, №№ 46. - P.367-369.
21. Magee P. Toxicity of nitrosamines their possible human healt hazards // Food an Cosmetics Toxicol. - 1971. - Vol. 9. -P.213-216.
22. Magee P. Nitrosamine activations / In: In vitro metabolic activation mutagenesis testing. - Amsterdam, 1976. - P.213-216.
23. Magee P. Evidence for the formation of eleotrophilic metabolites from N- nitroso compounds // In: Origins Hum. Cancer, Book B. Cold Spring Harbor. - 1977. - P.629-637.
24. Mager J., Bornstein S. Enhancement of the polyuridilic aced-derected phenylalanine polymerization in liver-microsomes with dimethylnitrosamine // Biochem. biophys. Acta. -1971. - Vol. 95, №№ 4. - P.682-684.
25. Mizrah J., de Vries G. Instability of polyribosomes derived from rat pretraathment wich the hepatocarcinogen dimeth-ylnitrosamine // Biochem and biophys. Res. Communs. -1971. - Vol. 21, №№ 555. - P.561-591.
26. Montesano R., Magee P. Molecular basis of alkylation of DNA by earcinogenic epoxides // Proc. Amer., Assoc. Cancer Rec. - 1972. - Vol. 13, №№ 62. - P.16-63.
27. Oldezshansen H. Azzneimittel and celerschaden // Therapiewoche. - 1971. - Bd. 21, Ht. 34. - S.2339-2357.
28. O'Connor P., Capps M, Craig A. Comporative studies of the hepatocarcinogen N,N - dimethylnitrosamine in vivo // Brit. J. Cancer. - 1993. - Vol. 27, №№ 2. - P.153-166.
29. Pegg A. Metabolism of nitrosodimethylamine // In: Mole-cural and cellular aspects of carcinogen screening tests. IARC Scientific Publication. - 1980. - №№ 27. - P.3-22.
30. Plapp F, Hayes L, Chiga M. Dissociability and tRNA content of monosomes produced by dimethylnitrosamine and starvation // Nature. - 1974. - Vol. 247, №№ 5439. - P.311-313.
31. Reuber M. Hepatic vein thrombosis in buffalo strain female rats ingesting dimethylnitrosamine // Pathol. Europ. - 1975.
- Vol. 10, №№ 3. - P.241-244.
32. Restelli E., Tuderman L, Kivarikko K Effect of hepatic injury on prolil 3-hydroxilase and 4- hydroxilase actixities in rat liver // Biochem. J. - 1978. - Vol. 170, №№ 1. - P. 129135.
33. Stewart B., Hicks R.., Magee P. Acute biochemical and morphological effects of N- nitrosodimethylamine // Chem. -Biol. Interactions. - 1975. - Vol. 11, №№ 5. - P.413-429.
34. Turberville C., Craddock V. Methylation of nuclear proteins by dimethylnitrosamine and methyomine in the rat in vivo // Biochem. J. - 1971. - Vol. 124, №№ 4. - P.725-739.
