НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ В БОРЬБЕ С БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ: ОХОТНИКИ ИЛИ ДОБЫЧА? Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

REVIEWS

© Долгушин И.И., Мезенцева Е.А., 2020

Щ Check for updates

Нейтрофильные внеклеточные ловушки в борьбе с биопленкообразующими микроорганизмами: охотники или добыча?

Долгушин И.И., Мезенцева Е.А.И

ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», 454092, Челябинск, Россия

В обзоре представлены современные данные о взаимоотношениях нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) и биопленкообразующих микроорганизмов P. aeruginosa, S. aureus, Candida spp., полученные в исследованиях in vitro и in vivo. До 80% микробных инфекций человека связаны с биопленкообразующими микроорганизмами. Формирование высокоспециализированных сообществ в виде биопленок является одной из основных стратегий выживания бактерий и грибов, значимо повышая их толерантность к действию агрессивных и стрессовых внешних условий, химиотерапевтических препаратов, факторов иммунной системы, способствуя их персистенции и хронизации инфекционного процесса. Образование НВЛ в процессе нетоза является одним из биологических механизмов, используемых нейтрофилами в защите от патогенов. Хемоаттрактанты биопленочного происхождения, а также выделяемые эпителиальными и иммунокомпетентными клетками, привлекают и активируют мигрирующие нейтрофилы. Однако учитывая, что в биопленках бактерии образуют достаточно крупные клеточные кластеры и агрегаты, процесс фагоцитоза порой оказывается затруднен или невозможен. В этих условиях логично предположить, что значимость НВЛ в антибиопленочном иммунитете увеличивается. Однако за счет компонентов внеклеточного биопленочного матрикса (например, экзополисахарид Psl P. aeruginosa), молекул системы quorum sensing (например, quorum sensing-система LasR P. aeruginosa), ферментов (например, LasA-протеаза и LasB-эластаза P. aeruginosa), токсинов (например, лейкоцидин Пантона-Валентайна и Y-гемолизин AB S. aureus) и, вероятно, других, пока не изученных, факторов микроорганизмы в биопленках способны влиять на сигнальные системы, задействованные в нетозе, на интенсивность формирования НВЛ, механизмы секвестрации и киллинга в них, порой подчиняя и используя компоненты НВЛ для собственных целей.

Ключевые слова: нейтрофилы; нейтрофильные внеклеточные ловушки; нетоз; биопленки; биопленочные инфекции; биопленкообразующие микроорганизмы; обзор.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Для цитирования: Долгушин И.И., Мезенцева Е.А. Нейтрофильные внеклеточные ловушки в борьбе с биопленкообразующими микроорганизмами: охотники или добыча? Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(5): 468-481. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-5-9

Neutrophil extracellular traps in the fight against biofilm-forming microorganisms: hunters or prey?

Ilya I. Dolgushin, Elena A. Mezentseva"

South-Ural State Medical University, 454092, Chelyabinsk, Russia

The review presents up-to-date data on the relationships between neutrophil extracellular traps (NETs) and biofilm-forming microorganisms P. aeruginosa, S. aureus, Candida spp. obtained in vitro and in vivo studies. Up to 80% of human microbial infections are associated with biofilm-forming microorganisms. The formation of highly specialized biofilm communities is one of the main strategies for the survival of bacteria and fungi, significantly increasing their tolerance to aggressive and stressful environmental conditions, chemotherapeutic drugs, and immune system factors, contributing to their persistence and chronicity of the infectious process. The formation of NETs in the process of NETosis is one of the biological mechanisms used by neutrophils in protection against pathogens. Chemoattractants of biofilm origin, as well as those secreted by epithelial and immunocompetent cells, attract and activate migrating neutrophils. However, given that bacteria form fairly large

Поступила 18.06.2020 Принята в печать 28.08.2020

ЖУРНАЛ МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ИММУНОБИОЛОГИИ. 2020; 97(5)

DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-5-9

ОБЗОРЫ

cell clusters and aggregates in biofilms, the process of phagocytosis is sometimes difficult or impossible. Under these conditions, it is logical to assume that the importance of NETs in anti-biofilm immunity increases. However, due to the components of the extracellular biofilm matrix (e.g., Psl exopolysaccharide P. aeruginosa), quorum sensing (QS) molecules (e.g., LasR QS system P. aeruginosa), enzymes (e.g., LasA protease and LasB elastase P. aeruginosa), toxins (e.g., Panton-Valentine leukocidin and AB Y-hemolysin S. aureus) and probably other factors yet to be studied, the microorganisms in biofilms are able to influence the signaling systems involved in NETosis, the intensity of the formation of NETs, the sequestration and killing mechanisms in them, sometimes subordinating and using NETs components for their own purposes.

Keywords: neutrophils; neutrophilic extracellular traps; NETosis; biofilms; biofilm infections; biofilm-forming microorganisms; review.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

For citation: Dolgushin I.I., Mezentseva E.A. Neutrophil extracellular traps in the fight against biofilm-forming microorganisms: hunters or prey? Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2020; 97(5): 468-481. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-5-9

Received 18 June 2020 Accepted 28 August 2020

Введение

Открытие V. Brinkmann и коллегами в 2004 г. нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) как формы врожденного ответа, который связывает микроорганизмы, предотвращает их распространение и обеспечивает высокую локальную концентрацию антимикробных агентов [1, 2], послужило толчком к изучению роли НВЛ, наряду с фагоцитозом и дегра-нуляцией, в защите от патогенов и продемонстрировало их эффективность при ряде бактериальных, грибковых и вирусных инфекций [3-9]. Однако, несмотря на широкий арсенал средств противостояния, борьба с микроорганизмами резко осложняется, когда они формируют ассоциации, называемые биопленками, участвующие в развитии персистиру-ющих инфекций и деструктивных воспалительных процессов [10,11].

Основная часть

Для бактерий и грибов характерны два разных «образа жизни»: планктонный и биопленочный [12, 13].

При планктонном существовании одиночные клетки или клетки в небольших цепочках (например, стрептококки) либо скоплениях (например, стафилококки) «плавают» без защиты от токсических веществ, бактериофагов и фагоцитов. Следовательно, такой стиль жизни опасен для микробов [12].

При биопленочном образе жизни микроорганизмов образование совокупностей клеток, окруженных самопродуцируемым внеклеточным ма-триксом, является одной из стратегий выживания [14]. Такие микробные агрегаты могут прилипать к естественным или искусственным поверхностям (сидячий рост, адгезированные биопленки), например к зубам, клеткам эпидермиса, венозным катете -рам, искусственным суставам, или могут располагаться в тканях (неадгезированные или суспензион-

ные биопленки), например на слизистых оболочках, в мокроте или в труднозаживающих ранах [12]. Таким образом, биопленка — это постоянно обновляющееся сообщество микробов на биогенном или абиогенном субстрате, окруженных внеклеточным полимерным матриксом из экзополисахаридов, внеклеточной ДНК, белков, РНК и липидов, который предохраняет их от вредных воздействий, химио-терапевтических препаратов и влияний организма-хозяина, представляет собой один из факторов межмикробного взаимодействия и коммуникации, способствует горизонтальному переносу генов, является источником питательных веществ для бактерий во время голодания [13-22].

Использование современных технологий позволило установить, что развитие биопленки включает несколько последовательных этапов:

1) первоначальное прикрепление планктонных бактерий к поверхности (субстрату);

2) созревание биопленки;

3) отделение планктонных форм (дисперсия, отслойка, рассредоточение биопленки) с последующей их миграцией в новые локусы [13, 23].

Внутри биопленок микроорганизмы используют межклеточную коммуникационную систему из небольших сигнальных молекул, аутоиндукторов, называемую quorum sensing (QS) [14, 18, 20]. Система QS не только определяет плотность популяции, но и регулирует различные признаки, такие как бактериальный фенотип, экспрессия генов факторов вирулентности, пространственная дифференциация и формирование биопленок [18, 21]. Высвобождение QS-молекул обеспечивает быструю локальную связь между клетками в зараженной области, синхронизацию их роста, а также реакции на изменения температуры и pH окружающей среды, присутствие биоцидных соединений и т.д. [13, 24]. До 80% микробных инфекций человека, включая

REVIEWS

эндокардит, периодонтит, риносинусит, остеомиелит, хронические незаживающие раны, менингит, инфекции почек, постимплантационные инфекции, микробно-воспалительные процессы в бронхоле-гочной системе при муковисцидозе связаны с биопленкообразующими микроорганизмами [13, 20]. Как ни парадоксально, большие дозы антибиотиков, используемых для лечения биопленочных инфекций, способствуют формированию антибиотико-резистентных штаммов бактерий [13].

НВЛ представляют собой волокна ДНК, «декорированные» набором белков ядерного, цитозо-льного и гранулярного происхождения, из которых часть составляют «протеомное ядро», относительно постоянное, независимо от индуцирующего стимула, включая гистоны Н2А, Н2В, Н4, лакто-феррин, миелопероксидазу (МПО), нейтрофиль-ную эластазу (НЭ), резистин, нейтрофильный де-фензин-2, а-актинин, Р-актин, миозин-9, моезин, профилин-1, пластин-2, филамин-А, липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов, а-энолазу, глюкозо-6-фосфат-изомеразу, транске-толазу [25-28]. Существование протеомных вариаций может быть связано с тем, что различные стимулы запускают отличающиеся внутриклеточные сигнальные каскады, которые в итоге приводят к некоторым изменениям в белковом составе НВЛ. Хотя возможен и другой сценарий, по которому адгезия дополнительных белков может происходить уже после высвобождения НВЛ в зависимости от окружающей их среды [28].

На сегодняшний день известны NADPH-окси-даза (КОХ)-зависимые и NOX-независимые механизмы формирования НВЛ [29, 30]. Наиболее изученным является NOX-зависимый механизм, при котором активационный стимул, например фор-бол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) или бактериальный липополисахарид, вызывает выход запасов Са2+ в цитозоль, повышение активности протеин-киназы С и фосфорилирование gp91phox/Nox2 [29, 31]. Данный процесс облегчает сборку комплекса NADPH-оксидазы, тем самым стимулируя генерацию активных форм кислорода (АФК), способствующих последующей дезинтеграции мембран ядра и гранул [9, 29, 32-35]. Выходящие при этом из азуро-фильных гранул НЭ и МПО контактируют с содержимым ядра, участвуя в расщеплении гистонов и деконденсации хроматина [9, 29, 34]. Кульминацией процесса является выброс деконденсированной ДНК, «декорированной» белками, в межклеточное пространство через разрывы в клеточной мембране нейтрофила, чему способствует генерация НСЮ-под действием МПО [30], или поры, образованию которых помогает гасдермин D [36], и гибель ней-трофила [9, 29].

В деконденсации хроматина также принимает участие пептидиларгинин-деиминаза 4 (PAD4) —

фермент, который конвертирует положительно заряженный аргинин гистонов в нейтрально заряженный цитруллин, изменяя тем самым общий заряд молекул и способствуя диссоциации гистонов и ДНК [37]. Однако роль PAD4 в NOX-зависимом формировании НВЛ остается предметом спора [29]: данные одних исследователей свидетельствуют, что цитруллинация гистонов не является необходимым событием NADPH-оксидаза-зависимого образования НВЛ [29, 38, 39], в то время как результаты, полученные другими учеными, доказывают обратное [29, 40, 41]. В одной из последних работ, опубликованных в 2020 г., H.R. Thiam и соавторы установили, что при нетозе происходит цепь последовательных клеточных событий, которая сохраняется у разных видов (у человека, мышей), при этом ядерная локализация и цитруллинирующая активность PAD4 являются необходимыми условиями для деконден-сации и высвобождения ДНК [37].

Ионофоры кальция (иономицин, А23187), некоторые цитокины, фосфолипидные медиаторы воспаления, кристаллы мочевой кислоты могут запускать NOX-независимый механизм формирования НВЛ [29, 30, 42-47]. Приток и повышение уровня Ca2+ в цитозоле нейтрофила, с одной стороны, активирует кальцийзависимые калиевые каналы и выработку митохондриальных АФК [29, 30, 39]; а с другой стороны, вызывает активацию PAD4 и ее транслокацию в ядро с последующей цитруллина-цией гистонов и деконденсацией хроматина [29].

Нейтрофильные внеклеточные ловушки и биопленки Pseudomonas aeruginosa

Хроническая биопленочная инфекция дыхательных путей, вызванная Pseudomonas aeruginosa, у пациентов с муковисцидозом (МВ) является наиболее хорошо изученной и описанной биопленочной инфекцией в медицине [12]. При МВ происходят мутации гена, кодирующего синтез регулятора трансмембранной проводимости муковис-цидоза (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator — CFTR), белка, участвующего в транспорте бикарбонатных ионов и ионов хлора через мембрану [47]. CFTR экспрессируется во многих органах, включая эпителиальные клетки дыхательных путей, поджелудочной железы, а также клетки врожденного иммунитета, в частности нейтрофилы [47, 48]. Мутации гена CFTR приводят к нарушению нормального транспорта ионов и жидкости через эпителий дыхательных путей, образованию толстого слоя вязкой слизи, нарушению мукоцилиарно-го клиренса, развитию воспаления и хронических бактериальных инфекций, приводящих к нарушению функции легких и дыхательной недостаточности [47]. P. aeruginosa инфицирует респираторный тракт пациентов с МВ в раннем возрасте и становится персистирующим патогеном в последующие

ОБЗОРЫ

годы, что обусловлено ее способностью образовывать биопленки [47, 49].

В элиминации P. aeruginosa, в том числе из дыхательных путей, ключевую роль играют нейтрофильные гранулоциты. Наиболее эффективными способами борьбы являются классический фагоцитоз и последующий внутриклеточный киллинг, причем P. aeruginosa устойчива к кислородзависи-мым механизмам и чувствительна к действию таких кислороднезависимых факторов, как НЭ, лизоцим, кателицидины, дефензины [49]. Однако при МВ мигрирующие в большом количестве в легкие нейтрофилы не могут эффективно уничтожать бактерии, проявляя дисфункциональный фенотип, вызывая повреждение тканей легких и нарушение их функции [47, 49, 50].

Первоначально считалось, что основной формой гибели нейтрофилов в дыхательных путях при МВ является вторичный некроз, т.е. некроз после апоптоза вследствие несвоевременного удаления апоптозных клеток [49]. В работах 2005 [51] и 2009 гг. [52] группой американских ученых установлено, что комплекс ДНК и белка актина, выделяющихся при некрозе нейтрофилов, значительно усиливает биопленкообразование P. aeruginosa штамма PAO1 в условиях in vitro, что, вероятно, имеет место в респираторных путях у больных МВ. Похожие результаты были получены в работе и другой группы ученых из США 2011 г. по изучению взаимоотношений биопленкообразующей активности P. aeruginosa штамма 6294 и нейтрофилов при развитии кератита вследствие ношения контактных линз [53]. Авторы установили, что каркас из F-ак-тина и ДНК, выделяющихся из некротизированных нейтрофилов, успешно используется бактериями для адгезии и дальнейшего формирования биопленки на поверхности контактной линзы [53].

Однако ряд исследований показал, что нейтрофилы также массово подвергаются нетозу с выделением НВЛ, которые в большом количестве определяются в дыхательных путях и мокроте больных МВ [27, 28, 47, 49].

Одним из мощных индукторов образования НВЛ является мобильность P. aeruginosa, обусловленная флагеллиновыми жгутиками, поэтому превалирование подвижных планктонных немукоид-ных форм бактерий на ранних стадиях заболевания вызывает активный нетоз [27, 28, 49, 54]. Еще одним триггером НВЛ-формирования является экзотоксин P. aeruginosa пиоцианин [55]. Его индукция посредством передачи QS-сигналов коррелирует со стадией роста биопленки P. aeruginosa. Хотя пио-цианин обладает широким спектром токсических эффектов, предполагаемой основой его токсичности является проникновение через мембрану клетки и окисление NADPH (т.е. пиоцианин является неферментной NADPH-оксидазой) с образованием

супероксид-аниона и других АФК внутри клетки, что приводит к развитию в клетках-мишенях окислительного стресса [56-58]. Однако в 2013 г. был установлен новый механизм действия пиоци-анина — индукция образования НВЛ через окислительный стресс (посредством АФК, ферментов JNK и PI3K и аутофагии), но вызванный не прямым окислением NADPH, а активацией NADPH-оксида-зы нейтрофила [55].

Находясь в дыхательных путях, P. aeruginosa индуцируют выработку нейтрофилами фактора ин-гибирования миграции макрофагов — провоспали-тельного цитокина, обладающего аутокринной и па-ракринной активностью, который, в свою очередь, вызывает активацию нейтрофильной митогенакти-вируемой протеинкиназы и последующее образование АФК внутри нейтрофила, также потенцируя нетоз и ингибируя при этом апоптоз [27].

У P. aeruginosa имеется несколько QS-систем, при этом система Las занимает самое высокое место в иерархии, регулируя нижестоящие системы Rhl и Pqs [59, 60]. Индукторами нетоза являются такие важные факторы вирулентности P. aeruginosa, контролируемые QS-системой LasR, как ферменты LasA-протеаза и LasB-эластаза, а также экзотоксины, выделяемые с помощью системы секреции III типа (T3SS) [60].

Важно отметить, что разные генетические варианты P. aeruginosa индуцируют различные механизмы, участвующие в образовании НВЛ: одни запускают NOX-зависимые пути, другие — АФК-не-зависимые; влияние одних приводит к цитруллина-ции гистонов при нетозе, другим не требуется PAD4 и цитруллинация для высвобождения НВЛ [60]. Кроме того, было обнаружено, что в составе НВЛ, индуцируемых разными вариантами P. aeruginosa, обязательно присутствует белок, усиливающий бактерицидное действие нейтрофилов, специфически нацеленный на грамотрицательные бактерии, такие как P. aeruginosa, а НЭ и МПО — не всегда [60].

Таким образом, ряд прямых и опосредованных P. aeruginosa факторов способствуют нетозу и выбросу большого количества НВЛ, начиная с ранних стадий заболевания. Однако секвестрация P. aeruginosa ловушками при сублитической концентрации антимикробных НВЛ-ассоциированных белков не приводит к полному уничтожению бактерий, а, наоборот, способствует их микроколонизации, образованию агрегатов и в итоге биопленкообразо-ванию [28]. В процессе формирования биопленки P. aeruginosa экзополисахариды Psl внеклеточного матрикса взаимодействуют с внеклеточной ДНК не только самих бактерий, но и НВЛ, используя их в качестве «строительных лесов», т.е. каркаса для дальнейшего биопленкообразования и колонизации слизистой [17, 18, 27, 28, 61]. Удержание P. aeruginosa в остове ловушек и влияние на них

REVIEWS

некоторых компонентов НВЛ, например белка LL-37, способствует мутагенезу бактерий [28, 62]. По мере прогрессирования болезни пребывание P. aeruginosa в дыхательных путях сопровождается генетическими изменениями и конверсией ряда признаков, в том числе трансформацией в неподвижные мукоидные формы, образующие биопленки. При этом и утрата жгутиков, и продукция альгинатсодержащей слизи сохраняет, но снижает способность P. aeruginosa индуцировать нетоз [54, 61], а слизеобразование также подавляет захват и уничтожение бактерий НВЛ, т.е. снижает эффективность защиты [27, 28, 49].

Интересно, что у 63% пациентов с МВ при хронической синегнойной инфекции формируются мутантные формы P. aeruginosa с инактивацией QS-системы LasR [60, 63], однако появление таких штаммов ассоциируется с ухудшением функции легких и у детей, и у взрослых с МВ [60, 64]. Данный парадокс свидетельствует о том, что P. aeruginosa компенсирует потерю факторов вирулентности другими патогенными механизмами, в частности путем ускользания от нейтрофил-опосредованных бактерицидных функций с помощью снижения интенсивности формирования НВЛ [60].

Таким образом, приведенные данные демонстрируют сложные динамические взаимоотношения НВЛ и биопленочной инфекции P. aeruginosa в дыхательных путях больных МВ, одновременно подчеркивая потенциальные недостатки НВЛ-мо-дели защиты в контексте данной инфекции [28]. НВЛ, формируемые под действием бактериальных триггеров, осуществляют захват P. aeruginosa, однако неспособность уничтожить секвестрированные бактерии, с одной стороны, способствует биоплен-кообразованию последних, а с другой — запускает процесс их патоадаптации [27, 28], приводящей к формированию ещё большей устойчивости к НВЛ-опосредованной бактерицидной активности.

В 2019 г. были опубликованы результаты изучения влияния НВЛ на биопленкообразование P. aeruginosa штамма PAO1 на модели бактериального кератита у мышей [65]. Использование муль-тифотонной микроскопии, 3D-реконструкции в сочетании с электронной микроскопией и окраской глазных биоптатов по Граму выявило, что уже через 24 ч после заражения P. aeruginosa формировали толстую экзополисахарид Psl-содержащую биопленку на поверхности роговицы, а мигрирующие через периферическую лимбальную сосудистую сеть нейтрофилы собирались под этим бактериальным слоем, образуя видимый «щит». При этом между слоем нейтрофилов (снизу) и слоем бактерий (сверху) обнаруживалась «мертвая зона», заполненная ДНК в сочетании с белками-гистонами, НЭ и МПО, т.е. НВЛ. Важным является тот факт, что у животных 3 групп, нокаутных по PAD4, нейтро-фильной эластазе и катепсину C и характеризую-

щихся нарушением НВЛ-образующей способности, отсутствовала «мертвая зона» в сочетании с утратой структурированной биопленки P. aeruginosa, выявляемой у мышей дикого типа, что позволило авторам предположить, что присутствие НВЛ обусловливало формирование биопленки высокореплика-тивными планктонными бактериями. При этом у всех 3 групп нокаутных животных через 7 дней после инокуляции на роговицу P. aeruginosa обнаруживались в головном мозге, вероятно проходя через канал зрительного нерва, исходя из чего авторы сделали вывод, что нейтрофилы формируют НВЛ-ба-рьер для сдерживания бактерий снаружи в виде биопленки и предотвращения их распространения в мозг, «принося в жертву» глаз, т.к. планктонные бактерии гораздо более подвижны, чем биопленочные. Таким образом, формирование НВЛ, вероятно, является эволюционно полезным механизмом для защиты мозга от инфекций, распространяющихся через глазной путь [65]. При этом авторы обратили особое внимание на то, что изучаемые ими нейтро-филы — это клетки, естественным путем мигрировавшие в ткани, а не выделенные из крови, поэтому исследованная ими система in vivo отражает истинный комплекс взаимоотношений нейтрофилов и P. aeruginosa. При инфицировании роговицы глаза P. aeruginosa бактериальная система T3SS высвобождает токсин ExoS в направлении накопления нейтрофилов и, с одной стороны, останавливает их под слоем бактерий, давая возможность биопленке созреть, а с другой стороны, побуждает их к формированию НВЛ, которые, в свою очередь, способствуют переходу P. aeruginosa из планктонной формы в биопленочную. Образование непроницаемой биопленки помогает бактериям формировать устойчивость к антибиотикам, но при этом сдерживает их инвазию и распространение в мозг. Внутривенное введение животным биспецифичных антител — против T3SS и экзополисахарида Psl — способствует переходу от НВЛ-опосредованной программы уничтожения бактерий к фагоцитозу и внутриклеточному протеазоопосредованному механизму их киллинга, препятствуя образованию биопленок. Сочетанное введение антител с местным лечением антибиотиками демонстрирует эффективную ликвидацию инфекции и уменьшение воспаления глаз у мышей со сформированной биопленкой [65].

В 2020 г. группой ученых из Дании и США были опубликованы интересные результаты по исследованию взаимоотношений нейтрофилов и биопленок P. aeruginosa in vivo [66]. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии авторы выявили плотный контакт между нейтрофила-ми и биопленкой P. aeruginosa, сформированной на силиконовом имплантате, через 24 и 48 ч после его введения в брюшную полость мышей. Используя специальные красители совместно с техноло-

ОБЗОРЫ

гией Click-iT® для маркировки внеклеточной ДНК (вкДНК) in vivo и конфокальной сканирующей лазерной микроскопией, ученые показали, что нити вкДНК нейтрофильного происхождения локализуются вокруг биопленки P. aeruginosa, но не внутри нее, т.е. не являются ее частью. Исследование срезов легочной ткани больных МВ методом флюоресцентной гибридизации in situ с использованием специфичных красителей также выявило, что фибриллы вкДНК нейтрофилов располагаются снаружи, окружая биопленки P. aeruginosa. Имму-ногистохимические методы исследования таких компонентов НВЛ, как гистоны Н3, цитруллиниро-ванные гистоны Н3 (citH3) и НЭ, и в материале от мышей, и в срезах легочной ткани человека показали, что citH3 (основной маркер НВЛ) отсутствуют внутри биопленок P. aeruginosa; H3 локализуются снаружи, т.е. вокруг, по периферии биопленки, но не совместно с ней, а НЭ колокализуется с бактериями в биопленке. Исходя из этого, авторы выдвинули гипотезу, что бактериальные биопленки P. aeruginosa in vivo не используют вкДНК хозяина в качестве каркаса, а скорее, экстрацеллюлярная нейтрофильная ДНК выполняет функцию своего рода оболочки вокруг биопленки (вторичный матрикс), ограничивая диссеминацию бактерий (что частично совпадает с результатами работы A. Thanabalasuriar и соавт. [65]), но и защищая ее от фагоцитоза. При этом основным источником вкДНК является некротический лизис нейтрофи-лов, а нетоз вносит весьма скромный вклад в этот процесс. В заключение авторы отметили, что данное исследование является первым, в котором изучается прямое распределение вкДНК хозяина и бактерий при хронических бактериальных инфекциях in vivo. В отличие от индукции in vitro, стимуляция нейтрофилов бактериальными биопленками во время хронических инфекций in vivo, по-видимому, не вызывает активного формирования НВЛ; однако некротизированные нейтрофилы действительно высвобождают вкДНК, гистоны H3 и антибактериальные ферменты, такие как НЭ [66].

Нейтрофильные внеклеточные ловушки и биопленки S. aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) — известный человеческий патоген, который может вызывать широкий спектр заболеваний — от инфекций кожи и подкожной жировой клетчатки до опасных для жизни инвазивных нозокомиальных инфекций. При хронизации стафилококковых инфекций наблюдается образование биопленок как на имплантированных конструкциях (сердечные клапаны, катетеры, суставные протезы), так и на человеческих тканях [67-71].

В 2018 г. группой ученых из США установлено, что в условиях in vitro биопленки метицил-

линрезистентного штамма S. aureus USA300, по сравнению с бактериями в планктонном состоянии, резко снижают жизнеспособность нейтрофилов и способствуют их гибели путем нетоза за счет своих секреторных белков [72]. Основную роль в индукции нетоза биопленочными бактериями играет продукция таких факторов вирулентности стафилококков, как лейкоцидин Пантона-Валентайна и у-гемолизин AB (лейкоцидиновый гемолизин). При этом образующиеся НВЛ не влияют на биомассу биопленки и выживаемость бактерий в ней, т.е. оказываются неэффективными в уничтожении биопленочных бактерий. Полученные in vitro результаты были подтверждены авторами в модели хронической ожоговой раневой инфекции у свиней, демонстрируя, что лейкоцидины S. aureus индуцируют нетоз и способствуют персистенции бактерий при хронических инфекциях in vivo. Одной из возможных причин устойчивости S. aureus к бактерицидной активности НВЛ, как отметили авторы, может быть продукция термонуклеазы Nuc, расщепляющей ДНК ловушек [72].

В 2019 г. группой ученых из Нидерландов были опубликованы данные о взаимоотношениях биопленок разных штаммов S. aureus и их фермента термонуклеазы 1 (Nucí) с нейтрофилами in vitro [73]. Одним из важнейших компонентов внеклеточного биопленочного матрикса S. aureus является вкДНК, формированию которой способствует ауто-лиз бактериальных клеток, имитирующий апоптоз эукариотических клеток [74], и которая, как полагают, играет решающую роль в стабилизации структуры биопленок [75]. Однако, как установили авторы, уже с ранних стадий биопленкообразования S. aureus (через 1, 2, 4 ч) в IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium) — среде для культивирования клеток млекопитающих — стафилококки продуцируют Nuc1, фермент, разрушающий ДНК, что, по логике, должно вызывать дестабилизацию и ре-моделирование биопленки. Однако в проведенных экспериментах увеличение количества Nuc1 происходило параллельно с устойчивым формированием биопленки. Это совпадает с данными других исследований, показывающих, что на ранних этапах биопленкообразования S. aureus не чувствительны к ДНКазе I [76, 77]. Авторы сделали вывод, что формирование биопленки S. aureus в среде IMDM, в отличие от триптического соевого бульона — классической среды для культивирования бактерий, не зависит от вкДНК [73].

Также было выявлено, что S. aureus-биоплен-коиндуцированный нетоз является АФК-независи-мым [73]. При этом после 90-минутной коинкуба-ции свежевыделенных нейтрофилов крови человека и 3-часовых, т.е. раннестадийных, биопленок стафилококков авторы наблюдали минимальные количества НВЛ в ответ на S. aureus дикого типа, в то

REVIEWS

время как nuc-мутантный штамм, не образующий термонуклеазу 1, индуцировал массивное образование НВЛ. Полученные данные, с одной стороны, подтверждают, что раннестадийные биопленки S. aureus являются индукторами нетоза; с другой стороны, учитывая выявленную способность биопленочных бактерий уже с первых часов продуцировать термонуклеазу, разрушающую ДНК НВЛ, подобно планктонным формам S. aureus, свидетельствуют о способности стафилококков активно уклоняться от антимикробного влияния нейтрофилов. Требуются дальнейшие исследования для выяснения механизмов регуляции баланса между индукцией нетоза и деградацией НВЛ биопленками S. aureus, которые могут быть связаны с продукцией не только Nuc, но и других иммуномодулирующих факторов стафилококков [73].

Нейтрофильные внеклеточные ловушки и биопленки Candida spp.

Candida albicans (C. albicans) является широко распространенным внутрибольничным грибковым патогеном. На сосудистых, мочевых катетерах, зубных протезах и других медицинских устройствах, а также на слизистых оболочках C. albicans ведет биопленочный образ жизни, что способствует его устойчивости к противогрибковым средствам и защитным факторам макроорганизма, значительно снижая эффективность лечения кандидоза [7, 7880]. Учитывая, что, с одной стороны, высвобождение НВЛ является основным способом контроля гифальных, но не дрожжевых, форм C. albicans, которые не могут быть фагоцитированы из-за своего размера [81], и что, с другой стороны, в биопленках C. albicans находится в агрегированном состоянии, допустимо предположить, что ловушкообразование может быть идеальным методом борьбы с биопленочными C. albicans [79].

Однако в 2016 г. группой ученых из США, изучавших взаимоотношения нейтрофилов и биопленок C. albicans гифального штамма SC5314 in vitro и in vivo (на модели биопленочной инфекции сосудистого катетера у крыс), установлено, что биопленочные формы C. albicans, в отличие от планктонных, подавляют высвобождение НВЛ [78]. Так, после 4-часовой коинкубации нейтрофи-лов и биопленок C. albicans не наблюдалось образования НВЛ, несмотря на активную миграцию и адгезию нейтрофилов к гифам гриба, в то время как планктонные формы вызывали 20-кратное повышение свободной ДНК в комплексе с цитрулли-нированными гистонами, оказываясь опутанными сетеподобными фибриллярными структурами. Биопленки C. albicans нарушали даже ФМА-инду-цированное ловушкообразование. Авторы впервые определили, что ключевой механизм подавления высвобождения НВЛ биопленками C. albicans свя-

зан с ингибированием NADPH-оксидазы и генерации АФК у нейтрофилов такими компонентами внеклеточного биопленочного матрикса, как полисахариды а-маннаны, но не растворимыми молекулами. Кроме того, биопленочный матрикс, возможно, маскирует эпитопы клеточной стенки C. albicans, распознаваемые рецепторами нейтро-филов и необходимые для запуска формирования НВЛ. Таким образом, биопленочный стиль жизни позволяет C. albicans избегать НВЛ-опосредован-ного киллинга, способствуя выживаемости и резистентности биопленок к атаке нейтрофилов [78]. Помимо этого, ингибирование НВЛ может иметь более широкие последствия in vivo, учитывая их роль в предотвращении диссеминации микробов, «разоблачении» эпитопов для распознавания грибов, рекрутировании дополнительных воспалительных клеток [78, 82, 83].

В следующем своем исследовании 2017 г. эта же группа ученых изучала реакцию нейтрофилов на 4 клинических изолята (штамма) C. albicans, отобранных по их различиям в биопленкообразующей способности, архитектуре формируемых биопленок и степени филаментации: SC5314 (как и в предыдущем исследовании [78]), 3153, 98-210 и 98-17 [79]. Штамм 3153 демонстрировал биопленочную архитектуру, аналогичную контрольному штамму SC5314, образуя плотную биопленку с внешним слоем, состоящим почти целиком из гифальных клеток. Заметно более низкая степень образования гиф наблюдалась у биопленок, сформированных штаммами 98-210 и особенно 98-17, которые содержали преимущественно дрожжевые формы на поверхности биопленки. Толщина биопленок коррелировала со способностью к гифообразова-нию: штаммы, демонстрирующие высшую степень филаментации, — SC5314 и 3153 — формировали самые толстые биопленки. При этом было установлено, что биопленки C. albicans, вне зависимости от штамма, после 4-часовой инкубации с нейтро-филами не вызывают ловушкообразования, ингиби-руя нетоз, в то время как планктонные формы всех 4 изучаемых изолятов индуцируют образование НВЛ. Полученные данные позволили авторам предположить, что гифальная архитектура биопленок не имеет решающего значения для ингибирования высвобождения НВЛ и даже биопленки, состоящие преимущественно из дрожжевых морфотипов, сохраняют способность нарушать функции нейтро-филов, что подтверждает большую значимость в угнетении ловушкообразования других специфичных для биопленки компонентов, таких как внеклеточный матрикс [79]. В то время как предыдущее исследование выявило ингибирование биопленкой штамма SC5314 продукции АФК нейтрофилов [78], текущее исследование показало, что данная супрессия является штаммзависимой [79]. Так, биопленка,

ОБЗОРЫ

образованная штаммом 98-210, в отличие от других изолятов, вызывала образование АФК у нейтрофи-лов. Сохранение при этом НВЛ-подавляющей активности биопленки данного штамма C. albicans указывает на возможное расхождение путей инги-бирования формирования АФК и НВЛ, индуцированных биопленками. Для дальнейшего изучения этих сложных ингибирующих путей необходимы дополнительные исследования [79].

В 2018 г. той же группой ученых было установлено, что предварительная обработка биопленок C. albicans препаратами из группы эхинокандинов (анидулафунгин, каспофунгин, микафунгин) способствует образованию НВЛ [80], что, вероятно, может служить проявлением синергичного действия нейтрофилов и лекарственных средств данного класса в борьбе с кандидозом [80, 84]. Эхиноканди-ны нарушают целостность клеточной стенки грибковых патогенов, вызывая демаскировку Р-глюкана, провоспалительного полисахарида, который может служить триггером для ловушкообразования ней-трофилов [80, 85].

В 2019 г. польскими учеными были опубликованы результаты по изучению влияния 3 ауторегу-ляторных QS-молекул C. albicans (фарнезола, фар-незиловой кислоты и тирозола) на ловушкообразо-вание нейтрофилов [24]. Интересно, что, с одной стороны, фарнезол, вырабатывающийся у грибков в ответ на повышение плотности клеток, предотвращает образование биопленок и блокирует переход из бластоспор в гифы [86]. С другой стороны, бла-стоспоры, как частицы более мелких размеров, чем гифы, индуцируют нетоз в меньшей степени [81]. Возможно, таким образом, что грибы используют фарнезол, ингибируя свою филаментацию и прогрессию инфекции, как способ избежать внимания нейтрофилов и выжить в среде, инфильтрированной ими [24]. Однако польскими учеными было впервые установлено, что фарнезол, но не фарнезиловая кислота и тирозол, вызывает активацию АФК-за-висимого пути нетоза нейтрофилов и усиливает их хемотаксис через CD11b/CD18- и ^К2-рецепторы. Таким образом, нейтрофилы все-таки «слышат» QS-язык грибов, что способствует защите организма от C. albicans [24].

Помимо C. albicans были исследованы взаимоотношения биопленочных форм C. glabrata (одного из наиболее часто встречающихся возбудителей не-albicans кандидоза) и НВЛ [7]. C. glabrata образует только относительно небольшие (1-4 мкм) дрожжевые формы, в отличие от C. albicans, формирующего более крупные (4-7 мкм) дрожжевые морфотипы, а также нитевидные формы (псевдогифы и гифы). После 4-часового совместного культивирования ней-трофилов с 24-часовыми биопленками C. glabrata из овоидных дрожжевых клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии были визуали-

зированы сетчатые структуры, исходящие из грану-лоцитов, что указывало на образование НВЛ, однако интенсивность и динамика формирования НВЛ были значимо ниже, чем в ответ на планктонные формы C. glabrata. Из этого авторы заключили, что отсроченное и нарушенное высвобождение НВЛ является потенциальным механизмом эвазии биопленок C. glabrata от врожденного иммунитета [7].

Использование дифенилен-йодония, фармакологического ингибитора NADPH-оксидазы [32], не влияло на нетоз, индуцированный биопленочными формами C. glabrata, предполагая участие альтернативного, АФК-независимого пути высвобождения НВЛ. При этом авторы установили, что как биопленочные, так и планктонные формы C. glabrata индуцируют высвобождение НВЛ через фагоцитоз-зависимый путь, отличный от механизма индукции ФМА. Данный процесс включает фагоцитоз дрожжевых клеток с последующей экструзией ДНК с цитруллинированными гистонами и гибелью нейтрофила. В то время как гифальные формы C. albicans являются более мощным триггером для высвобождения НВЛ, чем дрожжевые [81, 87], индукция нетоза с помощью дрожжевых морфотипов C. glabrata указывает на различия нейтрофильного ответа и подчеркивает важность индивидуального для каждого вида изучения взаимодействий хозяина и патогена [7]. В основе различий НВЛ-формирова-ния в ответ на биопленки C. albicans и C. glabrata могут лежать отличия в структуре биопленочной архитектуры и/или внеклеточного матрикса. Таким образом, несмотря на то, что биопленки C. glabrata, в отличие от C. albicans, «дозволяют» НВЛ высвобождаться, хотя и в меньшей степени, чем планктонные формы, ингибирующая НВЛ-модифици-рующая активность и нарушение функций нейтро-филов — это общая черта биопленок разных видов Candida, служащая для избежания нейтрофильной атаки [7].

Заключение

Влияние биопленочных микроорганизмов на функции нейтрофилов, в частности на формирование НВЛ, неоднозначно, порой разнонаправленно и зависит от ряда факторов, включая как особенности самого возбудителя, так и условия проведения экспериментальных исследований in vitro и in vivo. Однако не вызывает сомнений, что микробные биопленки, являясь целью нейтрофилов, пытаются не только «разоружить» противника, но и использовать его оружие для достижения своих целей. Дальнейшее детальное изучение взаимоотношений микробов в биопленках и НВЛ поможет не только расширить наши представления о механизмах пер-систенции возбудителей биопленочных инфекций, но и, возможно, разработать новые подходы к их лечению.

REVIEWS

ЛИТЕРАТУРА

1. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhle-mann Y., Weiss D.S., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004; 303(5663): 1532-5. https://doi.org/10.1126/science.1092385

2. Brinkmann V. Neutrophil extracellular traps in the second decade. J. Innate Immun. 2018; 10(5-6): 414-21. https://doi.org/10.1159/000489829

3. Saitoh T., Komano J., Saitoh Y., Misawa T., Takahama M., Kozaki T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 2012; 12(1): 109-16. https://doi.org/10.1016/j.chom.2012.05.015

4. Jenne C.N., Wong C.H.Y., Zemp F.J., McDonald B., Rahman M.M., Forsyth P.A., et al. Neutrophils recruited to sites of infection protect from virus challenge by releasing neutrophil extracellular traps. Cell Host Microbe. 2013; 13(2): 169-80. https://doi.org/10.1016/j.chom.2013.01.005

5. Nel J.G., Theron A.J., Pool R., Durandt C., Tintinger G.R., Anderson R. Neutrophil extracellular traps and their role in health and disease. South Afr. J. Sci. 2016; 112(1/2). https://doi.org/10.17159/sajs.2016/20150072

6. Schönrich G., Raftery M.J. Neutrophil extracellular traps go viral. Front. Immunol. 2016; 7: 366. https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.00366

7. Johnson C.J., Kernien J.F., Hoyer A.R., Nett J.E. Mechanisms involved in the triggering of neutrophil extracellular traps (NETs) by Candida glabrata during planktonic and biofilm growth. Sci. Rep. 2017; 7: 13065. https://doi.org/10.1038/s41598-017-13588-6

8. Seki M. The role of neutrophil extracellular traps in infectious diseases. J. Infect. Dis. Ther. 2017; 5(3). https://doi.org/10.4172/2332-0877.1000321

9. Burgener S.S., Schroder K. Neutrophil extracellular traps in host defense. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2019; 12(7): a037028. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a037028

10. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284(5418): 1318-22.

https://doi.org/10.1126/science.284.5418.1318

11. Meyle E., Stroh P., Günther F., Hoppy-Tichy T., Wagner C., Hänsch G.M. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation. Int J. Artif. Organs. 2010; 33(9): 608-20. https://doi.org/10.1177/039139881003300906

12. H0iby N., Bjarnsholt T., Moser C., Jensen P.0., Kolpen M., Qvist T., et al. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients. APMIS. 2017; 125(4): 339-43. https://doi.org/10.1111/apm.12689

13. Khatoon Z., McTiernan C.D., Suuronen E.J., Mah T.F., Alar-con E.I. Bacterial biofilm formation on implantable devices and approaches to its treatment and prevention. Heliyon. 2018 4(12): e01067. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2018.e01067

14. Борисова М.И., Лазакович Д.Н., Сидорова Н.А., Савуш-кин А.И. Биопленкообразующая активность и феномен пер-систенции микроорганизмов. Journal of Biomedical Technologies. 2015; (2): 28-35.

15. Чеботарь И.В. Механизмы антибиопленочного иммунитета. Вестник Российской академии медицинских наук. 2012: 67(12): 22-9.

16. Zarnowski R., Westler W.M., Lacmbouh G.A., Marita J.M., Bothe J.R., Bernhardt J., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. mBio. 2014; 5(4): e01333-14. https://doi.org/10.1128/mBio.01333-14

17. Wang S., Liu X., Liu H., Zhang L., Guo Y., Yu S., et al. The exopolysaccharide psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Mi-crobiol. Rep. 2015; 7(2): 330-40.

https://doi.org/10.! 111/1758-2229.12252;

18. Lee K., Yoon S.S. Pseudomonas aeruginosa biofilm, a programmed bacterial life for fitness. J. Microbiol. Biotechnol. 2017; 27(6): 1053-64. https://doi.org/10.4014/jmb.1611.11056

19. Ray V.A., Hill P. J., Stover C.K., Roy S., Sen C.K., Yu L., et al. Anti-psl targeting of Pseudomonas aeruginosa bioflms for neu-trophilmediated disruption. Sci. Rep. 2017; 7(1): 16065. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16215-6

20. Galdiero E., Lombardi L., Falanga A., Libralato G., Guida M., Carotenuto R. Biofilms: novel strategies based on antimicrobial peptides. Pharmaceutics. 2019; 11(7): 322. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11070322

21. Geddes-McAlister J., Kugadas A., Gadjeva M. Tasked with a challenging objective: why do neutrophils fail to battle Pseudomonas aeruginosa biofilms. Pathogens. 2019; 8(4): 283. https://doi.org/10.3390/pathogens8040283

22. Deng B., Ghatak S., Sarkar S., Singh K., Das Ghatak P., Mathew-Steiner S.S., et al. Novel bacterial diversity and fragmented eDNA identified in hyperbiofilm-forming Pseudomonas aeruginosa rugose small colony variant. iScience. 2020; 23(2): 100827. https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100827

23. Omar A., Wright J.B., Schultz G., Burrell R., Nadworny P. Microbial biofilms and chronic wounds. Microorganisms. 2017; 5(1): 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms5010009

24. Zawrotniak M., Wojtalik K., Rapala-Kozik M. Farnesol, a quorum-sensing molecule of Candida albicans triggers the release of neutrophil extracellular traps. Cells. 2019; 8(12): 1611. https://doi.org/10.3390/cells8121611

25. Urban C.F., Ermert D., Schmid M., Abu-Abed U., Goosmann C., Nacken W., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog. 2009; 5(10): e1000639. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000639

26. Khandpur R., Carmona-Rivera C., Vivekanandan-Giri A., Gi-zinski A., Yalavarthi S., Knight J.S., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci. Transl.Med. 2013; 5(178): 178ra40. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3005580

27. Dwyer M., Shan Q., D'Ortona S., Maurer R., Mitchell R., Olesen H., et al. Cystic fibrosis sputum DNA has NETosis characteristics and neutrophil extracellular trap release is egulated by macrophage migration-inhibitory factor. J. Innate Immun. 2014; 6(6): 765-79. https://doi.org/10.1159/000363242

28. Rahman S., Gadjeva M. Does NETosis contribute to the bacterial pathoadaptation in cystic fibrosis? Front. Immunol. 2014; 5: 378. https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00378

29. Ravindran M., Khan M.A., Palaniyar N. Neutrophil extracellular trap formation: physiology, pathology, and pharmacology. Biomolecules. 2019; 9(8): 365. https://doi.org/10.3390/biom9080365

30. Takishita Y., Yasuda H., Shimizu M., Matsuo A., Morita A., Tsutsumi T., et al. Formation of neutrophil extracellular traps in mitochondrial DNA-deficient cells. J. Clin. Biochem. Nutr. 2020; 66(1): 15-23. https://doi.org/10.3164/jcbn.19-77

31. Kaplan M.J., Radic M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J. Immunol. 2012; 189(6): 2689-95. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1201719

32. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., Hurwitz R., Schulze I., Wahn V., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 2007; 176(2): 231-41. https://doi.org/10.1083/jcb.200606027

33. Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Нейтро-фильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.; 2009.

34. Papayannopoulos V., Metzler K.D., Hakkim A., Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J. Cell. Biol. 2010; 191(3): 677-91. https://doi.org/10.1083/jcb.201006052

35. Долгушин И.И., Савочкина А.Ю., Курносенко И.В., Долгушина В.Ф., Савельева А.А., Самусева И.В. и др. Участие

ОБЗОРЫ

внеклеточных ДНК-ловушек в защитных и патологических реакциях организма. Российский иммунологический журнал. 2015; 9(2): 164-70.

36. Sollberger G., Choidas A., Bum G.L., Habenberger P., Di Lu-crezia R., Kordes S., et al. Gasdermin D plays a vital role in the generation of neutrophil extracellular traps. Sci. Immunol. 2018; 3(26): eaar6689. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aar6689

37. Thiam H.R., Wong S.L., Qiu R., Kittisopikul M., Vahabi-kashi A., Goldman A.E., et al. NETosis proceeds by cytoskeleton and endomembrane disassembly and PAD4-mediated chroma-tin decondensation and nuclear envelope rupture. PNAS. 2020; 117(13): 7326-37. https://doi.org/10.1073/pnas.1909546117

38. Neeli I., Radic M. Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release. Front. Immunol. 2013; 4: 38. https://doi.org/10.3389/fimmu.2013.00038

39. Douda D.N., Khan M.A., Grasemann H., Palaniyar N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-in-dependent NETosis induced by calcium influx. PNAS. 2015; 112(9): 2817-22. https://doi.org/10.1073/pnas.1414055112

40. Li P., Li M., Lindberg M.R., Kennett M.J., Xiong N., Wang Y. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 2010; 207(9): 1853-62. https://doi.org/10.1084/jem.20100239

41. Tatsiy O., McDonald P.P. Physiological stimuli induce PAD4-de-pendent, ROS-independent NETosis, with early and late events controlled by discrete signaling pathways. Front. Immunol. 2018; 9: 2036. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02036

42. Parker H., Dragunow M., Hampton M.B., Kettle A.J., Winter-bourn C.C. Requirements for NADPH oxidase and myeloperoxidase in neutrophil extracellular trap formation differ depending on the stimulus. J. Leukoc. Biol. 2012; 92(4): 841-9. https://doi.org/10.1189/jlb.1211601

43. Kenny E.F., Herzig A., Krüger R., Muth A., Mondal S., Thompson P.R., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. ELife. 2017; 6: e24437. https://doi.org/10.7554/elife.24437

44. Naffah de Souza C., Breda L.C.D., Khan M.A., de Almeida S.R., Camara N.O.S., Sweezey N., et al. Promotes NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation: a matter of mitochondrial reactive oxygen species generation and citrullination and cleavage of histone. Front. Immunol. 2017; 8: 1849. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01849

45. Chatfield S.M., Grebe K., Whitehead L.W., Rogers K.L., Nebl T., Murphy J.M., et al. Monosodium urate crystals generate nuclease-resistant neutrophil extracellular traps via a distinct molecular pathway. J. Immunol. 2018; 200(5): 1802-16. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1701382

46. Khan M.A., Pace-Asciak C., Al-Hassan J.M., Afzal M., Liu Y.F., Oommen S., et al. Furanoid f-acid F6 uniquely induces NETosis compared to C16 and C18 fatty acids in human neutro-phils. Biomolecules. 2018; 8(4): 144. https://doi.org/10.3390/biom8040144

47. Khan M.A., Ali Z.S., Sweezey N., Grasemann H., Palaniyar N. Progression of cystic fibrosis lung disease from childhood to adulthood: neutrophils, neutrophil extracellular trap (NET) formation, and NET degradation. Genes. 2019; 10(3): 183. https://doi.org/10.3390/genes10030183

48. Zhou Y., Song K., Painter R.G., Aiken M., Reiser J., Stanton B.A., et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator recruitment to phagosomes in neutrophils. J. Innate Immun. 2013; 5(3): 219-30. https://doi.org/10.1159/000346568

49. Rada B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 2017; 6(1): 10. https://doi.org/10.3390/pathogens6010010

50. Hayes E., Pohl K., McElvaney N.G., Reeves E.P. The cystic fibrosis neutrophil: a specialized yet potentially defective cell. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 2011; 59(2): 97-112. https://doi.org/10.1007/s00005-011-0113-6

51. Walker T.S., Tomlin K.L., Worthen G.S., Poch K.R., Lieber J.G., Saavedra M.T., et al. Enhanced Pseudomonas aerugino-sa biofilm development mediated by human neutrophils. Infect. Immun. 2005; 73(6): 3693-701. https://doi.org/10.1128/IAI.73.6.3693-3701.2005

52. Parks Q.M., Young R.L., Poch K.R., Malcolm K.C., Vasil M.L., Nick J.A. Neutrophil enhancement of Pseudomonas aerugino-sa biofilm development: human f-actin and DNA as targets for therapy. J. Med. Microbiol. 2009; 58(4): 492-502. https://doi.org/10.1099/jmm.0.005728-0

53. Robertson D.M., Parks Q.M., Young R.L., Kret J., Poch K.R., Malcolm K.C., et al. Disruption of contact lens-associated Pseudomonas aeruginosa biofilms formed in the presence of neutrophils. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 2011; 52(5): 2844-50. https://doi.org/10.1167/iovs.10-6469

54. Floyd M., Winn M., Cullen C., Sil P., Chassaing B., Yoo D.G., et al. Swimming motility mediates the formation of neutrophil extracellular traps induced by flagellated Pseudomonas aerugi-nosa. PLoSPathog. 2016; 12(11): e1005987. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005987

55. Rada B., Jendrysik M.A., Pang L., Hayes C.P., Yoo D.G., Park J.J., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 2013; 8(1): e54205. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0054205

56. Rada B., Lekstrom K., Damian S., Dupuy C., Leto T.L. The pseudomonas toxin pyocyanin inhibits the dual oxidase-based antimicrobial system as it imposes oxidative stress on airway epithelial cells. J. Immunol. 2008; 181(7): 4883-93. https://doi.org/10.4049/jimmunol.181.7.4883

57. Rada B., Leto T.L. Redox warfare between airway epithelial cells and pseudomonas: dual oxidase versus pyocyanin. Immunol. Res. 2009; 43(1-3): 198-209. https://doi.org/10.1007/s12026-008-8071-8

58. Rada B., Gardina P., Myers T.G., Leto T.L. Reactive oxygen species mediate inflammatory cytokine release and EGFR-depen-dent mucin secretion in airway epithelial cells exposed to Pseudomonas pyocyanin. Mucosal Immunol. 2011; 4(2): 158-71. https://doi.org/10.1038/mi.2010.62

59. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. Pseudomonas aeruginosa: пато-генность, патогенез и патология. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015; 17(3): 170-86.

60. Skopelja-Gardner S., Theprungsirikul J., Lewis K.A., Hammond J.H., Carlson K.M., Hazlett H.F., et al. Regulation of Pseudomonas aeruginosa-mediated neutrophil extracellular traps. Front. Immunol. 2019; 10: 1670. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01670

61. Young R.L., Malcolm K.C., Kret J.E., Caceres S.M., Poch K.R., Nichols D.P., et al. Neutrophil extracellular trap (NET)-media-ted killing of Pseudomonas aeruginosa: evidence of acquired resistance within the CF airway, independent of CFTR. PLoS One. 2011; 6(9): e23637. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023637

62. Limoli D.H., Rockel A.B., Host K.M., Jha A., Kopp B.T., Hol-lis T., et al. Cationic antimicrobial peptides promote microbial mutagenesis and pathoadaptation in chronic infections. PLoS Pathog. 2014; 10(4): e1004083. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004083

63. Feltner J.B., Wolter D.J., Pope C.E., Groleau M.C., Smalley N.E., Greenberg E.P., et al. LasR variant cystic fibrosis isolates reveal an adaptable quorum-sensing hierarchy in Pseudomonas aeruginosa. mBio. 2016; 7(5): e01513-6. https://doi.org/10.1128/mBio.01513-16

64. Hoffman L.R., Kulasekara H.D., Emerson J., Houston L.S., Burns J.L., Ramsey B.W., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J. Cyst. Fibros. 2009; 8(1): 66-70. https://doi.org/10.1016/jjcf.2008.09.006

REVIEWS

65. Thanabalasuriar A., Scott B.N.V., Peiseler M., Willson M.E., Zeng Z., Warrener P., et al. Neutrophil extracellular traps confine Pseudomonas aeruginosa ocular biofilms and restrict brain invasion. Cell Host Microbe. 2019; 25(4): 526-36. https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.02.007

66. Alhede M., Qvortrup K., Kragh K.N., Jensen P.0., Stewart P.S., Bjarnsholt T. The origin of extracellular DNA in bacterial biofilm infections in vivo. Pathogens Dis. 2020; 78(2): ftaa018. https://doi.org/10.1093/femspd/ftaa018

67. Lew D.P., Waldvogel F.A. Osteomyelitis. Lancet. 2004; 364(9431): 369-79.

https://doi.org/10.1016/S0140-6736(04)16727-5

68. Brady R.A., Leid J.G., Calhoun J.H., Costerton J.W., Shirt-liff M.E. Osteomyelitis and the role of biofilms in chronic infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008; 52(1): 13-22. https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2007.00357.x

69. Ashong C.N., Raheem S.A., Hunter A.S., Mindru C., Barsh-es N.R. Methicillin-resistant staphylococcus aureus in foot osteomyelitis. Surg. Infect. 2017; 18(2): 143-8. https://doi.org/10.1089/sur.2016.165

70. Ferrando A., Part J., Baeza J. Treatment of cavitary bone defects in chronic osteomyelitis: biogactive glass S53P4 vs. calcium sulphate antibiotic beads. J. Bone Jt. Infect. 2017; 2(4): 194-201. https://doi.org/10.7150/jbji.20404

71. de Vor L., Rooijakkers S.H.M., van Strijp J.A.G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBSLett. 2020; 594(16): 2556-69. https://doi.org/10.1002/1873-3468.13767

72. Bhattacharya M., Berends E.T.M., Chan R., Schwab E., Roy S., Sen C.K., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leuko-cidins to elicit extracellular trap formation and evade neutro-phil-mediated killing. PNAS. 2018; 115(28): 7416-21. https://doi.org/10.1073/pnas.1721949115

73. Sultan A.R., Hoppenbrouwers T., Lemmens-den Toom N.A., Snijders S.V., van Neck J.W., Verbon A., et al. During the early stages of Staphylococcus aureus biofilm formation, induced neutrophil extracellular traps (NETs) are degraded by autolo-gous thermonuclease. Infect. Immun. 2019; 87(12): e00605-19. https://doi.org/10.1128/IAI.00605-19

74. Montanaro L., Poggi A., Visai L., Ravaioli S., Campoccia D., Speziale P., et al. Extracellular DNA in biofilms. Int. J. Artif. Organs. 2011; 34(9): 824-31. https://doi.org/10.5301/ijao.5000051

75. Whitchurch C.B., Tolker-Nielsen T., Ragas P.C., Mattick J.S. Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science. 2002; 295(5559): 1487. https://doi.org/10.1126/science.295.5559.1487

76. Grande R., Nistico L., Sambanthamoorthy K., Longwell M., Iannitelli A., Cellini L., et al. Temporal expression of agrB, cidA, and alsS in the early development of Staphylococcus au-reus UAMS-1 biofilm formation and the structural role of extracellular DNA and carbohydrates. Pathog. Dis. 2014; 70(3): 414-22. https://doi.org/10.1111/2049-632x.12158

77. Moormeier D.E., Bose J.L., Horswill A.R., Bayles K.W. Temporal and stochastic control of Staphylococcus aureus biofilm development. mBio. 2014; 5(5): e01341-14. https://doi.org/10.1128/mBio.01341-14

78. Johnson C.J., Cabezas-Olcoz J., Kernien J.F., Wang S.X., Bee-be D.J., Huttenlocher A., et al. The extracellular matrix of Candida albicans biofilms impairs formation of neutrophil extracellular traps. PLoSPathog. 2016; 12(9): e1005884. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005884

79. Kernien J.F., Johnson C.J., Nett J.E. Conserved inhibition of neutrophil extracellular trap release by clinical Candida albi-cans biofilms. J. Fungi. 2017; 3(3): 49. https://doi.org/10.3390/jof3030049

80. Hoyer A.R., Johnson C.J., Hoyer M.R., Kernien J.F., Nett J.E. Echinocandin treatment of candida albicans biofilms enhances neutrophil extracellular trap formation. Antimicrob. Agents

Chemother. 2018; 62(9): e00797-18. https://doi.org/10.1128/AAC.00797-18

81. Branzk N., Lubojemska A., Hardison S.E., Wang Q., Gutierrez M.G., Brown G.D., et al. Neutrophils sense microbe size and selectively release neutrophil extracellular traps in response to large pathogens. Nat. Immunol. 2014; 15(11): 1017-25. https://doi.org/10.1038/ni.2987

82. Uppuluri P., Chaturvedi A.K., Srinivasan A., Banerjee M., Ramasubramaniam A.K., Köhler J.R., et al. Dispersion as an important step in the candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 2010; 6(3): e1000828. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000828

83. Hopke A., Nicke N., Hidu E.E., Degani G., Popolo L., Wheeler R.T. Neutrophil attack triggers extracellular trap-dependent Candida cell wall remodeling and altered immune recognition. PLoSPathog. 2016; 12(5): e1005644. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005644

84. Katragkou A., Kruhlak M.J., Simitsopoulou M., Chatzimo-schou A., Taparkou A., Cotten C.J., et al. Interactions between human phagocytes and candida albicans biofilms alone and in combination with antifungal agents. J. Infect. Dis. 2010; 201(12): 1941-9. https://doi.org/10.1086/652783

85. ByrdA.S., O'Brien X.M., Johnson C.M., Lavigne L.M., Reichner J.S. An extracellular matrix-based mechanism of rapid neu-trophil extracellular trap formation in response to Candida albi-cans. J. Infect. Dis. 2010; 201(12): 1941-49. https://doi.org/10.1086/652783

86. Шпаков А.О. Внутри- и межвидовая хемокоммуникация у грибов. Микология и фитопатология. 2009; 43(6): 490-505.

87. Kenno S., Perito S., Mosci P., Vecchiarelli A., Monari C. Auto-phagy and reactive oxygen species are involved in neutrophil extracellular traps release induced by C. albicans morphotypes. Front. Microbiol. 2016; 7: 879. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00879

REFERENCES

1. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhle-mann Y., Weiss D.S., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004; 303(5663): 1532-5. https://doi.org/10.1126/science.1092385

2. Brinkmann V. Neutrophil extracellular traps in the second decade. J. Innate Immun. 2018; 10(5-6): 414-21. https://doi.org/10.1159/000489829

3. Saitoh T., Komano J., Saitoh Y., Misawa T., Takahama M., Kozaki T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 2012; 12(1): 109-16. https://doi.org/10.1016/jxhom.2012.05.015

4. Jenne C.N., Wong C.H.Y., Zemp F.J., McDonald B., Rahman M.M., Forsyth P.A., et al. Neutrophils recruited to sites of infection protect from virus challenge by releasing neutrophil extracellular traps. Cell Host Microbe. 2013; 13(2): 169-80. https://doi.org/10.1016/jxhom.2013.01.005

5. Nel J.G., Theron A.J., Pool R., Durandt C., Tintinger G.R., Anderson R. Neutrophil extracellular traps and their role in health and disease. South Afr. J. Sci. 2016; 112(1/2). https://doi.org/10.17159/sajs.2016/20150072

6. Schönrich G., Raftery M.J. Neutrophil extracellular traps go viral. Front. Immunol. 2016; 7: 366. https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.00366

7. Johnson C.J., Kernien J.F., Hoyer A.R., Nett J.E. Mechanisms involved in the triggering of neutrophil extracellular traps (NETs) by Candida glabrata during planktonic and biofilm growth. Sci. Rep. 2017; 7: 13065. https://doi.org/10.1038/s41598-017-13588-6

8. Seki M. The role of neutrophil extracellular traps in infectious diseases. J. Infect. Dis. Ther. 2017; 5(3). https://doi.org/10.4172/2332-0877.1000321

ОБЗОРЫ

9. Burgener S.S., Schroder K. Neutrophil extracellular traps in host defense. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2019; 12(7): a037028. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a037028

10. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284(5418): 1318-22.

https://doi.org/10.1126/science.284.5418.1318

11. Meyle E., Stroh P., Günther F., Hoppy-Tichy T., Wagner C., Hänsch G.M. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation. Int J. Artif. Organs. 2010; 33(9): 608-20. https://doi.org/10.1177/039139881003300906

12. H0iby N., Bjarnsholt T., Moser C., Jensen P.0., Kolpen M., Qvist T., et al. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients. APMIS. 2017; 125(4): 339-43. https://doi.org/10.1111/apm.12689

13. Khatoon Z., McTiernan C.D., Suuronen E.J., Mah T.F., Alar-con E.I. Bacterial biofilm formation on implantable devices and approaches to its treatment and prevention. Heliyon. 2018 4(12): e01067. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2018.e01067

14. Borisova M.I., Lazakovich D.N., Sidorova N.A., Savushkin A.I. Biofilm-forming activity and the phenomenon of persistense in microorganisms. Journal of Biomedical Technologies. 2015; (2): 28-35. (in Russian)

15. Chebotar' I.V. Mechanisms of antibiofilm immunity. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk. 2012: 67(12): 22-9. (in Russian)

16. Zarnowski R., Westler W.M., Lacmbouh G.A., Marita J.M., Bothe J.R., Bernhardt J., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. mBio. 2014; 5(4): e01333-14. https://doi.org/10.1128/mBio.01333-14

17. Wang S., Liu X., Liu H., Zhang L., Guo Y., Yu S., et al. The exopolysaccharide psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in pseudomonas aeruginosa. Environ Mi-crobiol. Rep. 2015; 7(2): 330-40. https://doi.org/10.1111/1758-2229.12252;

18. Lee K., Yoon S.S. Pseudomonas aeruginosa biofilm, a programmed bacterial life for fitness. J. Microbiol. Biotechnol. 2017; 27(6): 1053-64. https://doi.org/10.4014/jmb.1611.11056

19. Ray V.A., Hill P. J., Stover C.K., Roy S., Sen C.K., Yu L., et al. Anti-psl targeting of pseudomonas aeruginosa bioflms for neu-trophilmediated disruption. Sci. Rep. 2017; 7(1): 16065. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16215-6

20. Galdiero E., Lombardi L., Falanga A., Libralato G., Guida M., Carotenuto R. Biofilms: novel strategies based on antimicrobial peptides. Pharmaceutics. 2019; 11(7): 322. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11070322

21. Geddes-McAlister J., Kugadas A., Gadjeva M. Tasked with a challenging objective: why do neutrophils fail to battle pseudomonas aeruginosa biofilms. Pathogens. 2019; 8(4): 283. https://doi.org/10.3390/pathogens8040283

22. Deng B., Ghatak S., Sarkar S., Singh K., Das Ghatak P., Ma-thew-Steiner S.S., et al. Novel bacterial diversity and fragmented eDNA identified in hyperbiofilm-forming pseudomonas aeruginosa rugose small colony variant. iScience. 2020; 23(2): 100827. https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100827

23. Omar A., Wright J.B., Schultz G., Burrell R., Nadworny P. Microbial biofilms and chronic wounds. Microorganisms. 2017; 5(1): 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms5010009

24. Zawrotniak M., Wojtalik K., Rapala-Kozik M. Farnesol, a quorum-sensing molecule of candida albicans triggers the release of neutrophil extracellular traps. Cells. 2019; 8(12): 1611. https://doi.org/10.3390/cells8121611

25. Urban C.F., Ermert D., Schmid M., Abu-Abed U., Goosmann C., Nacken W., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog. 2009; 5(10): e1000639. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000639

26. Khandpur R., Carmona-Rivera C., Vivekanandan-Giri A., Giz-inski A., Yalavarthi S., Knight J.S., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci. Transl. Med. 2013; 5(178): 178ra40. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3005580

27. Dwyer M., Shan Q., D'Ortona S., Maurer R., Mitchell R., Olesen H., et al. Cystic fibrosis sputum DNA has NETosis characteristics and neutrophil extracellular trap release is egulated by macrophage migration-inhibitory factor. J. Innate Immun. 2014; 6(6): 765-79. https://doi.org/10.1159/000363242

28. Rahman S., Gadjeva M. Does NETosis contribute to the bacterial pathoadaptation in cystic fibrosis? Front. Immunol. 2014; 5: 378. https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00378

29. Ravindran M., Khan M.A., Palaniyar N. Neutrophil extracellular trap formation: physiology, pathology, and pharmacology. Biomolecules. 2019; 9(8): 365. https://doi.org/10.3390/biom9080365

30. Takishita Y., Yasuda H., Shimizu M., Matsuo A., Morita A., Tsutsumi T., et al. Formation of neutrophil extracellular traps in mitochondrial DNA-deficient cells. J. Clin. Biochem. Nutr. 2020; 66(1): 15-23. https://doi.org/10.3164/jcbn.19-77

31. Kaplan M.J., Radic M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J. Immunol. 2012; 189(6): 2689-95. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1201719

32. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., Hurwitz R., Schulze I., Wahn V., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 2007; 176(2): 231-41. https://doi.org/10.1083/jcb.200606027

33. Dolgushin I.I., Andreeva Yu.S., Savochkina A.Yu. Neutrophil Extracellular Traps and Methods for Evaluating the Functional Status of Neutrophils [Neytrofil'nye vnekletochnye lovushki i metody otsenki funktsional'nogo statusa neytrofilov]. Moscow; 2009. (in Russian)

34. Papayannopoulos V., Metzler K.D., Hakkim A., Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation ofneutrophil extracellular traps. J. Cell. Biol. 2010; 191(3): 677-91. https://doi.org/10.1083/jcb.201006052

35. Dolgushin I.I., Savochkina A.Yu., Kurnosenko I.V., Dolgushi-na V.F., Savel'eva A.A., Samuseva I.V. i dr. Participation of extracellular dna traps in protective and pathological reactions of the organism. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2015; 9 (2): 164-70. (in Russian)

36. Sollberger G., Choidas A., Burn G.L., Habenberger P., Di Lu-crezia R., Kordes S., et al. Gasdermin D plays a vital role in the generation of neutrophil extracellular traps. Sci. Immunol. 2018; 3(26): eaar6689. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aar6689

37. Thiam H.R., Wong S.L., Qiu R., Kittisopikul M., Vahabi-kashi A., Goldman A.E., et al. NETosis proceeds by cytoskeleton and endomembrane disassembly and PAD4-mediated chroma-tin decondensation and nuclear envelope rupture. PNAS. 2020; 117(13): 7326-37. https://doi.org/10.1073/pnas.1909546117

38. Neeli I., Radic M. Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release. Front. Immunol. 2013; 4: 38. https://doi.org/10.3389/fimmu.2013.00038

39. Douda D.N., Khan M.A., Grasemann H., Palaniyar N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-in-dependent NETosis induced by calcium influx. PNAS. 2015; 112(9): 2817-22. https://doi.org/10.1073/pnas.1414055112

40. Li P., Li M., Lindberg M.R., Kennett M.J., Xiong N., Wang Y. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 2010; 207(9): 1853-62. https://doi.org/10.1084/jem.20100239

41. Tatsiy O., McDonald P.P. Physiological stimuli induce PAD4-de-pendent, ROS-independent NETosis, with early and late events controlled by discrete signaling pathways. Front. Immunol. 2018; 9: 2036. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02036

REVIEWS

42. Parker H., Dragunow M., Hampton M.B., Kettle A.J., Winter-bourn C.C. Requirements for NADPH oxidase and myelopero-xidase in neutrophil extracellular trap formation differ depending on the stimulus. J. Leukoc. Biol. 2012; 92(4): 841-9. https://doi.org/10.1189/jlb.1211601

43. Kenny E.F., Herzig A., Krüger R., Muth A., Mondal S., Thompson P.R., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. ELife. 2017; 6: e24437. https://doi.org/10.7554/elife.24437

44. Naffah de Souza C., Breda L.C.D., Khan M.A., de Almeida S.R., Camara N.O.S., Sweezey N., et al. Promotes NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation: a matter of mitochondrial reactive oxygen species generation and citrullination and cleavage of histone. Front. Immunol. 2017; 8: 1849. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01849

45. Chatfield S.M., Grebe K., Whitehead L.W., Rogers K.L., Nebl T., Murphy J.M., et al. Monosodium urate crystals generate nuclease-resistant neutrophil extracellular traps via a distinct molecular pathway. J. Immunol. 2018; 200(5): 1802-16. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1701382

46. Khan M.A., Pace-Asciak C., Al-Hassan J.M., Afzal M., Liu Y.F., Oommen S., et al. Furanoid f-acid F6 uniquely induces NETosis compared to C16 and C18 fatty acids in human neutrophils. Biomolecules. 2018; 8(4): 144. https://doi.org/10.3390/biom8040144

47. Khan M.A., Ali Z.S., Sweezey N., Grasemann H., Palaniyar N. Progression of cystic fibrosis lung disease from childhood to adulthood: neutrophils, neutrophil extracellular trap (NET) formation, and NET degradation. Genes. 2019; 10(3): 183. https://doi.org/10.3390/genes10030183

48. Zhou Y., Song K., Painter R.G., Aiken M., Reiser J., Stanton B.A., et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator recruitment to phagosomes in neutrophils. J. Innate Immun. 2013; 5(3): 219-30. https://doi.org/10.1159/000346568

49. Rada B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 2017; 6(1): 10. https://doi.org/10.3390/pathogens6010010

50. Hayes E., Pohl K., McElvaney N.G., Reeves E.P. The cystic fibrosis neutrophil: a specialized yet potentially defective cell. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 2011; 59(2): 97-112. https://doi.org/10.1007/s00005-011-0113-6

51. Walker T.S., Tomlin K.L., Worthen G.S., Poch K.R., Lieber J.G., Saavedra M.T., et al. Enhanced Pseudomonas aeru-ginosa biofilm development mediated by human neutrophils. Infect. Immun. 2005; 73(6): 3693-701. https://doi.org/10.1128/IAI.73.6.3693-3701.2005

52. Parks Q.M., Young R.L., Poch K.R., Malcolm K.C., Vasil M.L., Nick J.A. Neutrophil enhancement of Pseudomonas aerugino-sa biofilm development: human f-actin and DNA as targets for therapy. J. Med. Microbiol. 2009; 58(4): 492-502. https://doi.org/10.1099/jmm.0.005728-0

53. Robertson D.M., Parks Q.M., Young R.L., Kret J., Poch K.R., Malcolm K.C., et al. Disruption of contact lens-associated Pseudomonas aeruginosa biofilms formed in the presence of neutrophils. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 2011; 52(5): 2844-50. https://doi.org/10.1167/iovs.10-6469

54. Floyd M., Winn M., Cullen C., Sil P., Chassaing B., Yoo D.G., et al. Swimming motility mediates the formation of neutrophil extracellular traps induced by flagellated Pseudomonas aeruginosa. PLoS Pathog. 2016; 12(11): e1005987. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005987

55. Rada B., Jendrysik M.A., Pang L., Hayes C.P., Yoo D.G., Park J.J., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 2013; 8(1): e54205. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0054205

56. Rada B., Lekstrom K., Damian S., Dupuy C., Leto T.L. The Pseudomonas toxin pyocyanin inhibits the dual oxidase-based antimicrobial system as it imposes oxidative stress on airway

epithelial cells. J. Immunol. 2008; 181(7): 4883-93. https://doi.org/10.4049/jimmunol.181.7.4883

57. Rada B., Leto T.L. Redox warfare between airway epithelial cells and pseudomonas: dual oxidase versus pyocyanin. Immunol. Res. 2009; 43(1-3): 198-209. https://doi.org/10.1007/s12026-008-8071-8

58. Rada B., Gardina P., Myers T. G., Leto T.L. Reactive oxygen species mediate inflammatory cytokine release and EGFR-depen-dent mucin secretion in airway epithelial cells exposed to pseudomonas pyocyanin. Mucosal Immunol. 2011; 4(2): 158-71. https://doi.org/10.1038/mi.2010.62

59. Lazareva A.V., Chebotar' I.V., Kryzhanovskaya O.A., Che-botar' V.I., Mayanskiy N.A. Pseudomonas aeruginosa: patho-genicity, pathogenesis and diseases. Klinicheskaya mikrobiolo-giya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2015; 17(3): 170-86. (in Russian)

60. Skopelja-Gardner S., Theprungsirikul J., Lewis K.A., Hammond J.H., Carlson K.M., Hazlett H.F., et al. Regulation of Pseudomonas aeruginosa-mediated neutrophil extracellular traps. Front. Immunol. 2019; 10: 1670. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01670

61. Young R.L., Malcolm K.C., Kret J.E., Caceres S.M., Poch K.R., Nichols D.P., et al. Neutrophil extracellular trap (NET)-media-ted killing of pseudomonas aeruginosa: evidence of acquired resistance within the CF airway, independent of CFTR. PLoS One. 2011; 6(9): e23637. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023637

62. Limoli D.H., Rockel A.B., Host K.M., Jha A., Kopp B.T., Hol-lis T., et al. Cationic antimicrobial peptides promote microbial mutagenesis and pathoadaptation in chronic infections. PLoS Pathog. 2014; 10(4): e1004083. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004083

63. Feltner J.B., Wolter D.J., Pope C.E., Groleau M.C., Smal-ley N.E., Greenberg E.P., et al. LasR variant cystic fibrosis isolates reveal an adaptable quorum-sensing hierarchy in Pseudomonas aeruginosa. mBio. 2016; 7(5): e01513-6. https://doi.org/10.1128/mBio.01513-16

64. Hoffman L.R., Kulasekara H.D., Emerson J., Houston L.S., Burns J.L., Ramsey B.W., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J. Cyst. Fibros. 2009; 8(1): 66-70. https://doi.org/10.1016/jjcf.2008.09.006

65. Thanabalasuriar A., Scott B.N.V., Peiseler M., Willson M.E., Zeng Z., Warrener P., et al. Neutrophil extracellular traps confine pseudomonas aeruginosa ocular biofilms and restrict brain invasion. Cell Host Microbe. 2019; 25(4): 526-36. https://doi.org/10.1016/jxhom.2019.02.007

66. Alhede M., Qvortrup K., Kragh K.N., Jensen P.0., Stewart P.S., Bjarnsholt T. The origin of extracellular DNA in bacterial biofilm infections in vivo. Pathogens Dis. 2020; 78(2): ftaa018. https://doi.org/10.1093/femspd/ftaa018

67. Lew D.P., Waldvogel F.A. Osteomyelitis. Lancet. 2004; 364(9431): 369-79.

https://doi.org/10.1016/S0140-6736(04)16727-5

68. Brady R.A., Leid J.G., Calhoun J.H., Costerton J.W., Shirt-liff M.E. Osteomyelitis and the role of biofilms in chronic infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008; 52(1): 13-22. https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2007.00357.x

69. Ashong C.N., Raheem S.A., Hunter A.S., Mindru C., Bar-shes N.R. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in foot osteomyelitis. Surg. Infect. 2017; 18(2): 143-8. https://doi.org/10.1089/sur.2016.165

70. Ferrando A., Part J., Baeza J. Treatment of cavitary bone defects in chronic osteomyelitis: biogactive glass S53P4 vs. calcium sulphate antibiotic beads. J. Bone Jt. Infect. 2017; 2(4): 194-201. https://doi.org/10.7150/jbji.20404

71. de Vor L., Rooijakkers S.H.M., van Strijp J.A.G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and

ОБЗОРЫ

forming biofilms. FEBSLett. 2020; 594(16): 2556-69. https://doi.org/10.1002/1873-3468.13767

72. Bhattacharya M., Berends E.T.M., Chan R., Schwab E., Roy S., Sen C.K., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leuko-cidins to elicit extracellular trap formation and evade neutro-phil-mediated killing. PNAS. 2018; 115(28): 7416-21. https://doi.org/10.1073/pnas.1721949115

73. Sultan A.R., Hoppenbrouwers T., Lemmens-den Toom N.A., Snijders S.V., van Neck J.W., Verbon A., et al. During the early stages of staphylococcus aureus biofilm formation, induced neutrophil extracellular traps (NETs) are degraded by autolo-gous thermonuclease. Infect. Immun. 2019; 87(12): e00605-19. https://doi.org/10.1128/IAI.00605-19

74. Montanaro L., Poggi A., Visai L., Ravaioli S., Campoccia D., Speziale P., et al. Extracellular DNA in biofilms. Int. J. Artif. Organs. 2011; 34(9): 824-31. https://doi.org/10.5301/ijao.5000051

75. Whitchurch C.B., Tolker-Nielsen T., Ragas P.C., Mattick J.S. Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science. 2002; 295(5559): 1487. https://doi.org/10.1126/science.295.5559.1487

76. Grande R., Nistico L., Sambanthamoorthy K., Longwell M., Iannitelli A., Cellini L., et al. Temporal expression of agrB, cidA, and alsS in the early development of Staphylococcus aureus UAMS-1 biofilm formation and the structural role of extracellular DNA and carbohydrates. Pathog. Dis. 2014; 70(3): 414-22. https://doi.org/10.1111/2049-632x.12158

77. Moormeier D.E., Bose J.L., Horswill A.R., Bayles K.W. Temporal and stochastic control of Staphylococcus aureus biofilm development. mBio. 2014; 5(5): e01341-14. https://doi.org/10.1128/mBio.01341-14

78. Johnson C.J., Cabezas-Olcoz J., Kernien J.F., Wang S.X., Bee-be D.J., Huttenlocher A., et al. The extracellular matrix of candida albicans biofilms impairs formation of neutrophil extracellular traps. PLoS Pathog. 2016; 12(9): e1005884. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005884

79. Kernien J.F., Johnson C.J., Nett J.E. Conserved inhibition of neutrophil extracellular trap release by clinical Candida albi-cans biofilms. J. Fungi. 2017; 3(3): 49. https://doi.org/10.3390/jof3030049

80. Hoyer A.R., Johnson C.J., Hoyer M.R., Kernien J.F., Nett J.E. Echinocandin treatment of Candida albicans biofilms enhances neutrophil extracellular trap formation. Antimicrob. Agents Chemother. 2018; 62(9): e00797-18. https://doi.org/10.1128/AAC.00797-18

81. Branzk N., Lubojemska A., Hardison S.E., Wang Q., Gutierrez M.G., Brown G.D., et al. Neutrophils sense microbe size and selectively release neutrophil extracellular traps in response to large pathogens. Nat. Immunol. 2014; 15(11): 1017-25. https://doi.org/10.1038/ni.2987

82. Uppuluri P., Chaturvedi A.K., Srinivasan A., Banerjee M., Ra-masubramaniam A.K., Köhler J.R., et al. Dispersion as an important step in the candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 2010; 6(3): e1000828. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000828

83. Hopke A., Nicke N., Hidu E.E., Degani G., Popolo L., Wheeler R.T. Neutrophil attack triggers extracellular trap-dependent candida cell wall remodeling and altered immune recognition. PLoS Pathog. 2016; 12(5): e1005644. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005644

84. Katragkou A., Kruhlak M.J., Simitsopoulou M., Chatzimo-schou A., Taparkou A., Cotten C.J., et al. Interactions between human phagocytes and Candida albicans biofilms alone and in combination with antifungal agents. J. Infect. Dis. 2010; 201(12): 1941-9. https://doi.org/10.1086/652783

85. Byrd A.S., O'Brien X.M., Johnson C.M., Lavigne L.M., Reichner J.S. An extracellular matrix-based mechanism of rapid neu-trophil extracellular trap formation in response to Candida albi-cans. J. Infect. Dis. 2010; 201(12): 1941-49. https://doi.org/10.1086/652783

86. Shpakov A.O. Intra- and interspecies chemocommunication in fungi. Mikologiya i fitopatologiya. 2009; 43(6): 490-505. (in Russian)

87. Kenno S., Perito S., Mosci P., Vecchiarelli A., Monari C. Auto-phagy and reactive oxygen species are involved in neutrophil extracellular traps release induced by C. albicans morphotypes. Front. Microbiol. 2016; 7: 879. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00879

Информация об авторах

Долгушин Илья Ильич — д.м.н., проф., президент, зав. каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО ЮУГМУ, 454092, Челябинск, Россия.

ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-0901-8042. E-mail: dol-ii@mail.ru

Мезенцева Елена Анатольевнаш — к.м.н., доц. каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО ЮУГМУ, 454092, Челябинск, Россия. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0001-9155-2334. E-mail: alena_mez_75@mail.ru

Участие авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.

Information about the authors

Ilya I. Dolgushin — D. Sci. (Med.), Prof., President, Head, Department of microbiology, virology, immunology and clinical laboratory diagnostics, South-Ural State Medical University, 454092, Chelyabinsk, Russia. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-0901-8042. E-mail: dol-ii@mail.ru

Elena A. MezentsevaM — Cand. Sci. (Med.), Assoc. Prof., Department of microbiology, virology, immunology and clinical laboratory diagnostics, South-Ural State Medical University, 454092, Chelyabinsk, Russia. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0001-9155-2334. E-mail: alena_mez_75@mail.ru

Contribution: the authors contributed equally to this article.