CC BY
118
УДК 616-092.9
© А.В. Симаненкова, А.А. Жигалова, А.Г. Шумеева, С.Г. Чефу, М.Э. Колпакова, Е.Н. Остроухова, Т.Д. Власов, 2014
А.В. Симаненкова, А.А. Жигалова, А.Г. Шумеева, С.Г. Чефу, М.Э. Колпакова, Е.Н. Остроухова, Т.Д. Власов НЕЙРОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ АГОНИСТА РЕЦЕПТОРА ГЛЮКОГОНОПОДОБНОГО ПЕПТИДА-1
ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург
Цель настоящего исследования - изучить нейропротективный эффект лираглутида при ишемии головного мозга. Для этого крысам экспериментальной группы вводился лираглутид подкожно в дозе 1 мг/кг 7 дней, крысам контрольной группы - 0,2 мл 0,9% раствора NaCl. Ежедневно измерялись гликемия, вес животных и корма. Затем производилось моделирование транзиторной фокальной ишемии мозга. Через 48 часов реперфузии оценивались неврологический дефицит и объем некроза.
Результаты исследования показали, что гликемия в экспериментальной группе не снижались по сравнению с контрольной (6,0 (5,7;6,1) и 6,5 (6,2;6,6) ммоль/л соответственно). У крыс экспериментальной группы не произошло физиологического увеличения массы, снизилось потребление корма по сравнению с контролем. На фоне введения лираглутида неврологический дефицит и объем некроза мозга были значимо меньше по сравнению с контролем (4,8 (4,2; 5,0) и 7,7 (7,6;7,8); 3,6 (2,7; 9,1%) и 26,4 (22,8;29,8) соответственно).
Таким образом, лираглутид в дозе, превышающей среднетерапевтическую, не вызывает гипогликемии. Лираглутид вызывает анорексигенный эффект за счет снижения объема потребляемой пищи. Лираглутид оказывает нейропротективный эффект при ишемии головного мозга.
Ключевые слова: сахарный диабет, инсульт, агонист глюкагоноподобного пептида-1, нейропротекция.
A.V. Simanenkova, A.A. Zhigalova, A.G. Shumeeva, S.G. Chefu, M.E. Kolpakova, E.N. Ostroukhova, T.D. Vlasov NEUROPROTECTIVE EFFECT OF GLUCAGON LIKE PEPTIDE-1 RECEPTOR AGONIST
Aim: to investigate liraglutide neuroprotective effect in brain ischemia. Materials and methods: rats of experimental group were treated with liraglutide 1 mg/kg subcutaneously for 7 days, rats of control group - with 0.2 ml of 0.9 % NaCl. Glycemia, body and food weight were measured daily. Then transient focal brain ischemia was modeled. After 48 hours of reperfusion neurological deficit and necrosis volume were evaluated.
Results: glycemia didn't decrease in experimental group, comparing with the control one ( 6.0 (5.7; 6.1) and 6.5 (6.2; 6.6) mmol/l, respectively). Rats of experimental group didn't have physiological body weight increase, they demonstrated smaller food consuming, comparing with the control group. Liraglutide-treated rats had significantly smaller neurologuical deficit and brain necrosis volume, comparing the control ones (4.8 (4.2; 5.0) and 7.7 (7.6; 7.8); 3.6 (2.7; 9.1%) and 26.4 (22.8; 29.8), respectively).
Conclusions: liraglutide in dose exceeding middle therapeutic one does not cause hypoglycemia. Liraglutide has anorexigenic effect realized through decreased food intake. Liraglutide has neuroprotective effect in brain ischemia.
Key words: diabetes mellitus, insult, glucagon like peptide-1 agonist, neuroprotection
Сахарный диабет (СД) 2-го типа является одной из ведущих проблем современного здравоохранения. Принимая во внимание то, как стремительно растет число пациентов с СД, эксперты Международной диабетической Федерации прогнозируют, что к 2025 году это число увеличится в 1,5 раза и достигнет 380 млн. человек [1].
Особую опасность представляют острые осложнения СД, среди которых одну из лидирующих позиций занимает ишемический инсульт. У пациентов с СД 2-го типа риск развития ишемического инсульта в два раза выше, чем в общей популяции [2]. Это делает необходимым поиск лекарственных средств, обладающих наряду с сахароснижающим действием дополнительным защитным эффектом в отношении головного мозга.
В последние годы на фармацевтическом рынке появились препараты для лечения СД из класса инкретинов. Эндогенные инкрети-ны - это гормоны желудочно-кишечного тракта, вырабатывающиеся в ответ на поступ-
ление пищи и обеспечивающие до 70% пост-прандиальной секреции инсулина [1]. При СД 2-го типа наблюдается снижение выработки данных гормонов, прежде всего глюкагонопо-добного пептида-1 (ГПП-1) [3], что делает перспективным применение препаратов -агонистов рецепора ГПП-1.
В ряде работ продемонстрирован кар-диопротективный эффект этих препаратов на моделях животных [4,5]. Показано, что при использовании агонистов рецептора ГПП-1 уменьшается размер инфаркта миокарда, улучшаются параметры постишемической гемодинамики, а также потребление глюкозы миокардом [5]. Однако данные о возможном нейропротективном эффекте агонистов ГПП-1 крайне скудны. В то же время появились работы, подтверждающие возможность препаратов пептидной природы оказывать нейропротек-тивное действие при ишемии головного мозга [6]. Это послужило поводом изучения защитных свойств лираглутида, аналога ГПП-1, в отношении головного мозга у животных.
Ранее в экспериментальных исследованиях было доказано, что СД сам по себе может обладать некоторым защитным действием при ишемическом-реперфузионном повреждении, являясь примером метаболического преконди-ционирования [7]. Данный феномен был продемонстрирован на модели инфаркта миокарда, что не позволяет исключить возможность аналогичного влияния при ишемии головного мозга. В связи с этим предметом нашего исследования стал возможный нейропротектив-ный эффект агониста ГПП-1 при ишемии головного мозга у здоровых животных.
Материал и методы
Исследование проводилось на крысах-самцах линии Wistar массой 200-250 г, которые были разделены две группы: животным контрольной группы (n=4) подкожно вводился 0,9% раствор NaCl 1 раз в сутки в течение 7 дней, животным экспериментальной группы (n=10) подкожно вводился лираглутид в дозе 1 мг/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней. Животные находились в условиях свободного потребления корма и воды. Ежедневно измерялся вес крыс обеих групп, а также определялся вес оставшегося корма. Кроме того, производилось ежедневное определение уровня гликемии при помощи глюкометра Accu-Chek Performa.
Через 5 часов после последнего введения препарата животным под хлоралгидрат-ным наркозом (430 мг/кг внутрибрюшинно) воспроизводилась ишемия головного мозга транзиторной окклюзией левой средней мозговой артерии по методике Koizumi J., 1986 [8]. Время ишемии составляло 30 минут. Ранее нами было показано, что эти сроки ишемии и реперфузии являются достаточными для формирования ишемического повреждения в области стриатума [9,10]. Данная методика позволяет наиболее достоверно воспроизвести объем, локализацию и характер изменений, происходящих при ишемическом инсульте, и неоднократно использовалась нами
для изучения неиропротективных свойств различных агентов [11,12,13]. Через 48 часов реперфузии оценивался неврологический дефицит по шкале Garcia J.H., 1995 [14] и объем инфаркта мозга при помощи окраски срезов мозга 0,1 % раствором трифенилтетразолия хлорида.
Статистический анализ проводился с помощью программного пакета StatSoft Statis-tica v6.0 Multilingual. Значимость различий между группами оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок, внутри одной группы -с помощью непараметрического критерия Вилкоксона для зависимых переменных. Все показатели были представлены в виде медианы (25%; 75%). Значения Р меньше 0,05 рассматривались как значимые.
Результаты и обсуждение
Введение лираглутида в дозе 1 мг/кг, превышающей среднетерапевтическую, не вызывало снижения уровня гликемии по сравнению с контролем. Уровень глюкозы крови не отличался в течение 7 дней измерения и составил 6,5 (6,2;6,6) ммоль/л в контрольной и 6,0 (5,7;6,1) ммоль/л в экспериментальной группах (р>0,05). Полученные данные подтверждают, что секреция инсулина под воздействием как эндогенного ГПП-1, так и его аналога, является глюкозозависимой [1], и риска гипогликемии при применении данного лекарственного средства нет.
Введение 0,9% раствора NaCl в течение 7 дней не изменяло пищевого поведения крыс, что сопровождалось естественной прибавкой массы тела. На фоне применения лираглутида наблюдались отсутствие естественной прибавки массы тела (р<0,05) (табл. 1) и даже первоначальное снижение массы (р<0,05), наиболее выраженное на второй день. Данное явление сопровождалось снижением потребления корма в экспериментальной группе по сравнению с контролем (р<0,05).
Таблица 1
Динамика веса и потребления корма в контрольной и экспериментальной группах
Группа Показатель День 1-й День 2-й День 3-й День 4-й День 5-й День 6-й День 7-й
Вес 244,5 248,5 253 260 264 262 262,5
Контроль (239;247,5) (233,5;250,5) (247,5;256) (253,5;261) (258;265) (256;267) (257,5;268)
Корм 100 77 71,6 59 47 30 15,5
(100;100) (71,9;82,7) (60,4;79) (53,5;66) (36;75,5) (18,5;42,5) (8;22,5)
Вес 248 232 230 230 239 239 242
Лираглутид (245;251) (227;236)*§ (227;236)*§ (227;237)*§ (232;244)*§ (233;245)*§ (236;250)*§
Корм 100 97 88,4 74,2 67,4 58 51
(100;108) (95,4;100,6) (85;92,8)* (70;85)* (59,4;71,6)* (53;66,6)* (50;57)*
* По сравнению с контролем, р<0,05. § - с исходным уровнем, р<0,05.
Вышеописанные феномены, вероятнее всего, обусловлены воздействием препарата на рецепторы центра голода и насыщения в гипоталамусе. Кроме того, агонисты рецепто-
ра ГПП-1 замедляют моторику желудка и уменьшают объем потребляемой пищи [1].
Неврологический дефицит в экспериментальной группе был значимо меньше, чем
в контрольной, - 4,8 (4,2;5,0) и 7,7 (7,6;7,8) балла соответственно. В экспериментальной группе объем некроза был значимо меньше, по сравнению с контролем - 3,6 (2,7; 9,1%) и 26,4% (22,8;29,8) от общего объема мозга соответственно (р<0,05) (рис. 1).
| 40 i
J
= 10
J
Контроль 26.35 (22.75.29.S)
Лираглутид
3,55 С2,7:9Д)
Рис. 1. Объем некроза (в % от общего объема мозга). *р<0,05 по сравнению с контролем
Механизм нейропротективного действия ГПП-1 имеет несколько аспектов. ГПП-1 и его аналоги снижают оксидативный стресс, блокируют образование активных форм кислорода, уменьшают перекисное окисление липидов и воспалительный ответ при повреждении головного мозга [15].
ГПП-1 реализует свои эффекты через повышение внутриклеточного уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ).
Увеличение содержания цАМФ сопровождается уменьшением образования супероксида и пероксида водорода [14]. Кроме того, усиление продукции цАМФ может запускать фос-форилирование цАМФ-зависимого элемент-связывающего белка, что приводит к экспрессии нейропротективных генов [15].
Другим важным аспектом защитного действия ГПП-1 является стимуляция клеточной пролиферации и подавление апоптоза за счет уменьшения экспрессии проапоптотиче-ского белка Вах и усиления экспрессии анти-апоптотического белка Вс1-2 [16].
Выводы
Лираглутид в дозе, превышающей сред-нетерапевтическую, не вызывает гипогликемии. Применение лираглутида вызывает ано-рексигенный эффект за счет снижения объема потребляемой пищи. Введение лираглутида в дозе 1 мг/кг в течение 7 дней животным без диабета оказывает нейропротективный эффект при фокальной транзиторной ишемии головного мозга, заключающийся в уменьшении выраженности неврологического дефицита и объема повреждения мозга.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 14-04-32385 мол а.
Сведения об авторах статьи:
Симаненкова Анна Владимировна - клинический ординатор кафедры терапии факультетской с курсом эндокринологии, кардиологии и функциональной диагностики им. Г.Ф. Ланга с клиникой ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8. E-mail: annasimanenkova@mail.ru. Жигалова Анна Александровна - студентка 4 курса ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8. E-mail: annlighter@mail.ru.
Шумеева Александра Геннадьевна - студентка 4 курса ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8.
Чефу Светлана Григорьевна - к.б.н., старший научный сотрудник Центра лазерной медицины ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8.
Колпакова Мария Эдуардовна - к.м.н., доцент кафедры патофизиологии с курсом клинической патофизиологии ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8. E-mail: patho@yandex.ru.
Остроухова Елена Николаевна - к.м.н., доцент кафедры терапии факультетской с курсом эндокринологии, кардиологии и функциональной диагностики им. Г.Ф. Ланга с клиникой ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8.
Власов Тимур Дмитриевич - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии с курсом клинической патофизиологии ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8. Email: tvlasov@yandex.ru.
ЛИТЕРАТУРА
Дедов, И.И. Инкретины: новая веха в лечении сахарного диабета 2-го типа / И.И. Дедов, М.В. Шестакова. - М., 2010. - С.55-62. Banerjee C. [et al.] "Duration of diabetes and risk of ischeamic stroke. The Northern Manhattan Study," Stroke, vol. 43, pp. 1212-1217, 2012.
Hoist J.J. The physiology and pharmacology of incretins in type 2 diabetes mellitus / J.J. Hoist // Journal Compilation № 2008 Blackwell Publishing Ltd Diabetes, Obesity and metabolism. - 10 (Suppl. 3). - 2008. - Р. 14-21.
Albiglutide, a long lasting glucagon-like peptide-1 analog, protects the rat heart against ischemia/reperfusion injury: evidence for improving cardiac metabolic efficiency / W. Bao [et al.] // PLoS ONE. - Aug 2011. - Vol. 6. Issue 8. - Р. 23570. GLP-1R agonist liraglutide activates cytoprotective pathways and improves outcomes after experimental myocardial infarction in mice / Noyan-Ashraf M.H. [et al.] // Diabetes. - 2009. - № 58 (4). - P. 975-983.
Динамика экспрессии мозгового нейротрофического фактора (BDNF) в коре головного мозга крыс и влияние препарата "Се-макс" на его продукцию при моделировании ишемического инсульта / Е. А. Кулага [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2013. - № 3(47). - С. 39-46.
The effect of metformin on the myocardial tolerance to ischemia-reperfusion injury in the rat model of diabetes mellitus type II // E. Kravchuk [et al.] // Experimental Diabetes Research. - 2011. - Volume 2011. - 5 p.
Experimental studies of ischemic brain edema: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area // J. Koizumi [et al.] // Stroke. - 1986. - Vol.8. - P. 1-8.
3.
4
5
6.
7
8.
9. Моделирование одностороннего ишемического повреждения нейронов стриатума с помощью непродолжительной окклюзии средней мозговой артерии / Д.Э. Коржевский [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - № 147 (2). - С. 217-219.
10. Структурная организация микроглиоцитов стриатума после транзиторной фокальной ишемии / Д.Э. Коржевский [и др.] // Морфология. - 2012. - № 141 (2). - С. 28-32.
11. Механизмы нейропротективного эффекта компонента зеленого чая - L-теанина / М. А. Зухурова [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2010. - N° 4(36) - С. 67-71.
12. Катехоламинергические структуры переднего мозга крыс после транзиторной ишемии / И. П. Григорьев [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2012. - № 2(42) - С. 57-60.
13. Гипоксическое и фармакологическое прекондиционирование как механизмы защиты при фокальной ишемии головного мозга крысы / М. А. Зухурова [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2010. - № 3(35) - С. 84-89.
14. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats / Garcia G.H. [et al.] // Statistical validation. Stroke. - 1995. - Vol.26. №4. - Р.627-634.
15. Kitagawa K. CREB and cAMP response element-mediated gene expression in the ischemic brain / K. Kitagawa // FEBS J. - 2007. - № 274. - Р. 3210-7
16. Li Y. Enhancing the GLP-1 receptor signaling pathway leads to proliferation and neuroprotection in human neuroblastoma cells / Y. Li // J Neurochem. - 2010. - June; № 113(6). - Р. 1621-1631.
УДК 616-092.9: 612.57: 612.112.3
© И.А. Кривошапкин, А.В. Ефремов, Е.Н. Самсонова, М.Г. Пустоветова, 2014
И.А. Кривошапкин, А.В. Ефремов, Е.Н. Самсонова, М.Г. Пустоветова ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Новосибирск
В настоящем исследовании было проведено определение содержания CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ лимфоцитов у 60 крыс-самцов линии Вистар. Отмечалось снижение количества иммунокомпетентных клеток на 1-е сутки постгипер-термического периода с восстановлением к 3-м суткам. Далее количество СD3+, СМ+, СD20+ лимфоцитов продолжало повышаться. Содержание СМ+ и CD16+ лимфоцитов оставалось в пределах контрольных значений.
Ключевые слова: иммунокомпетентные клетки, CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ лимфоциты, общая гипертермия.
I.A. Krivoshapkin, A.V. Efremov, E.N. Samsonova, M.G. Pustovetova FEATURES OF IMMUNE RESPONSE AFTER GENERAL HYPERTHERMIA
ON EXPERIMENTAL ANIMALS
This study was carried out to determine CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD16 +, CD20 + lymphocytes in 60 male Wistar rats. We noted a decrease in the number of immune cells in 1 st day of posthyperthermic period with the restoration by the 3rd day. Then the number of Cd3 +, CD4 +, Cd20 + cells continued to rise. Content of CD4 + and CD16 + cells remained within the reference values. Key words: immune cells, CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD16 +, CD20 + cells, general hyperthermia.
В настоящее время гипертермия как локальная, так и общая, находится в центре внимания врачей различного профиля, особенно онкологов [1,2,3,4]. Локальная гипертермия в форме терморадио-, термохимио- и термора-диохимиотерапии применяется при лечении онкологических больных в самостоятельном виде или в рамках неоадъювантной и адъ-ювантной терапии. В применении искусственной управляемой гипертермии в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией скрыты немалые резервы, в частности при многокомпонентном лечении больных с далеко зашедшими злокачественными новообразованиями (первичные местнораспространенные, рецидивные и/или метастатические опухоли), а также с локализованными, но крайне неблагоприятными формами заболевания [5,6].
В научной литературе идет активная дискуссия о механизмах действия локальной и общей гипертермии на организм человека и
ее влиянии на патогенез различных заболеваний [7,8]. Состояние общей гипертермии тела представляет собой один из вариантов тяжелого стресса, адаптация к которому лежит за пределами физиологических возможностей организма. Характер развития стресс-реакции во многом определяется функциональным состоянием лимфоидной ткани, макрофагов и ретикулоэндотелиальной системы [9, 10]. Клинические и экспериментальные работы, посвященные влиянию общей гипертермии на организм человека, в подавляющем большинстве проводились в диапазоне температур 37-42°С. Вместе с тем известно, что гибель опухолевых клеток происходит только при температуре более 43°С [11].
Поскольку основными областями применения общей гипертермии являются онкология и инфектология, то наибольший интерес представляют вопросы влияния гипертермии на состояние иммунной системы.
