CC BY
57
DOI 10.24411/2074-5036-2020-10020 УДК 611.342
Ключевые слова: ворсинки двенадцатиперстной кишки крысы, иммуногистохимия, альфа-актин, белок PGP 9.5, тирозингидроксилаза, серотонин
Key words: rat duodenal villi, immunohistochemistry, alpha actin, PGP 9.5 protein, tyrosine hydroxylase, serotonin
1,2Чумасов Е. И., 2Петрова Е. С.
НЕЙРОГУМОРАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ ВОРСИНОК ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ КРЫСЫ (ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
NEUROHUMORAL REGULATION OF RAT DUODENAL VILLI FUNCTIONS (IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY)
'Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины. Адрес: 196084, Россия, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5 1St. Petersburg State Academy of Veterinary Medicine, Adress: 196084, Russia, St. Petersburg, Chernigovskaja ul., 5 2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины» Адрес: 197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12; 2 Federal State Budgetary Scientific Institution «Institute of Experimental Medicine», Adress: 197376, Russia, St. Petersburg, ul. Akademika Pavlova, 12
Чумасов Евгений Иванович, д.б.н., профессор, Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»; E-mail: ua1ct@mail.ru
Chumasov Eugenii Ivanovich, Doctor of Biological Sciences, professor, St. Petersburg State Academy of Veterinary Medicine. Federal State Budgetary Scientific Institution «Institute of Experimental Medicine». E-mail: ua1ct@mail.ru Петрова Елена Сергеевна, к.б.н., с.н.с., Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины». E-mail: iemmorphol@yandex.ru Petrova Elena Sergeevna, PhD, senior researcher, Federal State Budgetary Scientific Institution «Institute of Experimental Medicine». E-mail: iemmorphol@yandex.ru
Аннотация. Использование иммуногистохимических маркеров: белка ПГП 9.5, синаптофизина (СФ), тирозинги-дроксилазы (ТГ) и серотонина, позволило выявить в тканях стенки двенадцатипертсной кишки крысы три нервных сплетения: миентеральное, подслизистое, эпителиально-ворсинчатое. Сравнительный ИГХ-анализ (реакции на ПГП9.5 и ТГ) показал, что ворсинки иннервируются парасимпатическими, но не симпатическими нервными волокнами. В соединительной ткани ворсинок обнаружены гладкие миоциты кровеносных и лимфатических сосудов, плазматические, энтерохромаффинные (ЕС) клетки, а в эпителии, кроме ЕС, также редкие нейроноподоб-ные клетки. Предполагается, что функции ворсинок регулируются как с помощью передачи нервных импульсов, так и гормонально с помощью серотонина.
Summary. Using immunohistochemical markers: PGP 9.5, synaptophysin, tyrosine hydroxylase, and serotonin, it was detected in the wall of the rat duodenum, except for two main (myienteral and submucosal) ganglionic plexuses, the third is the mucous epithelial-villous. A large number of terminal PGP 9.5+ parasympatical axons were found inside the connective tissue of the villi. Sympathetic nerve structures in the villi were not detected. It was established that single bipolar neuron-like cells are found in the epithelium. Additional large number of serotonin-synthesizing cells morphologically similar to enterochromaffinocytes were found in the villi. It is assumed that the activity of villi is regulated by both nerve stimuli and hormonal by serotonin.
Введение
Энтеральную нервную систему (ЭНС), наряду с парасимпатической и симпатической, на основании её характерных признаков, следует относить к метасимпатическому отделу автономной нервной системы [6, 7]. ЭНС представлена двумя известными ган-
глиозными сплетениями: миентеральным (Ауэрбахово) и подслизистым (Мейснерово), состоящих из огромного количества нервных клеток. У человека в ганглиозных сплетениях насчитываются сотни миллионов нейронов, поэтому ЭНС иногда называют «вторым мозгом» [13] или «первичным мозгом», при
сравнении «брюшной нервной цепочки» кольчатых червей (кл. Полихета) [11].
Наиболее изученной в структурном и функциональном отношении является наружная оболочка кишечной стенки. Именно, между её продольным и кольцевым мышечными слоями локализуется миентеральное или межмышечное ганглиозное сплетение (ММНС). Нейроны его регулируют моторику желудка, перистальтику, транспортную функцию, иннервацию сосудов [2, 5-8, 12]. С помощью иммуногистохимических (ИГХ) исследований последних десятилетий в нейронах и нервных волокнах ММНС были обнаружены не только основные медиаторы парасимпатической и симпатической НС (ацетилхолин - АЦХ и норадреналин - НА), но и широкий спектр регуляторных пептидов: холинацетилтрансфераза (ХАТ), тиро-зингидроксилаза (ТГ), серотонин, вещество Р, нейропептид NPY, оксид азота и другие [8, 10]. Недостаточно еще изучены иннервация тканей подслизистой и слизистой оболочек, морфология и функции подслизистого ган-глиозного нервного сплетения (ПСНС) двенадцатиперстной кишки, особенности строения и иннервации ворсинок.
Цель настоящего исследования состояла в изучении нервных структур подслизистой и слизистой оболочек двенадцатиперстной кишки крысы с обращением особого внимания на иннервацию ворсинок с использованием селективных нейроиммуногистохими-ческих методов.
Материалы и методы
Работа выполнена на крысах Вистар массой 200-250 г. (п = 12) с соблюдением международных правил Хельсинской декларации о гуманном обращении с животными и «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977г.) и одобрена ЛЭК (протокол №3, 30.11.2017). У крыс выделяли фрагменты двенадцатиперстной кишки (ДНК) и фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида [3]. Имму-ногистохимические реакции на альфа-актин и четыре нейральных маркера: белок ПГП 9.5 [4], синаптофизин (СФ) [1], тирозинги-
дроксилазу (ТГ) и серотонин проводили на парафиновых срезах. Для выявления белка ПГП 9.5 использовали поликлональные кроличьи антитела в разведении 1:200 (Spring Bioscience, США), для выявления синаптофи-зина - поликлональные кроличьи антитела к синаптофизину (MONOSAN, Нидерланды), для катехоламинергических структур симпатической нервной системы - поликлональные кроличьи антитела к ТГ в разведении 1:1000 (Abcam, Великобритания), для серотони-на - кроличьи поликлональные антитела к 5-гидроокситриптамину (Leica-Novocastra, Великобритания), для альфа-актина - моно-клональные мышиные антитела (клон 1A4, Dako, Дания). Вторичными реагентами служили реактивы из наборов Super Sensitive Polymer-HRP Detection System (Bio Genex, США) и EnVision+System Labbeled PolymerHRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания).
Результаты и обсуждение
Прежде чем перейти к изложению материала об иннервации ворсинок, двенадцатиперстной кишки (ДНК) крыс необходимо дать их краткое гистологическое описание. Ворсинка представляет собой многотканевую систему со сложной организацией. Снаружи каждая ворсинка выстлана столбчатым или цилиндрическим слизистым, каёмчатым эпителием, внутри определяется рыхлая соединительная ткань, в состав которой входят клеточные и тканевые компоненты: фибро-бласты, гистиоциты, отдельные лейкоциты, плазматические и тучные клетки, а также кровеносные и лимфатические сосуды, тонкие пучки гладкомышечной ткани.
Важно отметить, что с помощью специального иммуногистохимического метода (ИГХ) на альфа-актин нам впервые удалось выявить в ворсинках наличие большого количества гладкомышечных клеток (ГМК) (рис. 1, а). Они имеют сильно вытянутую извитую форму и интенсивно окрашиваются в темно-коричневый цвет. Толщина ГМК составляет в поперечнике, в области палочковидного ядра, 4-5 мкм, а длина - 15-35 мкм. Они встречаются в различных местах ворсинок: одни разрозненно в соединительной ткани, другие располагаются в составе
стенок кровеносных сосудов, третьи - в клапанах лимфатических сосудов (рис.1, в, г, д). На продольных срезах через ворсинку иногда можно видеть, что ГМК выстраиваются в виде цепочек вдоль длинной оси и образуют тонкие пучки. При малых разрешениях микроскопа видна непрерывная связь между пучками ГМК ворсинок с мышечной пластинкой подслизистой оболочки (рис.1, а). Гистологический и иммуногистохимический анализ строения ворсинок свидетельствует о том, что они представляют собой органные структуры слизистой кишки со своим автономным кровоснабжением, иннервацией и сходной тканевой организацией.
Как известно, в отличие от ММНС, локализующегося между продольным и кольцевым мышечными слоями кишечника, ПСНС располагается в соединительной ткани под-слизистой оболочки и окружено вплотную прилежащими многочисленными пучками коллагеновых волокон и венозными и артериальными сосудами (рис. 2 а, д). ПСНС имеет характерные особенности. Во-первых, ПСНС состоит не из крупных ганглиозных структур, как ММНС, а из микроганглиев с небольшим количеством нервных клеток (от 2 до 8) округлой и грушевидной формы, снабженных длинными отростками, которые характерны для клеток П-типа Догеля. Во-вторых, эти ганглии располагаются относительно разреженно, на определенном расстоянии друг от друга, ветви этого сплетения значительно тоньше ММНС (рис. 2, а). Нред-полагается, что они участвуют в регуляции местного гомеостаза в подслизистой, а также в поддержании водно-солевого баланса, иннервации кровеносных и лимфатических сосудов слизистой оболочек [5-8, 12]. В настоящей работе с помощью ИГХ реакции на ПГП 9.5 нередко удавалось проследить, что отходящие от нейронов микроганглиев ПСНС отростки образуют тонкие пучки. Часть из них участвует в иннервации дуоденальных желез, а большая часть безмиелиновых аксонов из подслизистой оболочки направляются в слизистую, там разветвляются и в составе артериол и сопровождающей рыхлой соединительной ткани прободают мышечную пластинку и входят в слизистую, где часть
из них формирует узкопетлистую ячеистую сеть вокруг желез и между основаниями ворсинок (рис. 2 в, г). Остальные многочисленные аксоны вступают внутрь каждой ворсинки, разветвляются и принимают участие в иннервации их тканей (рис. 2, б). При больших увеличениях хорошо видно, что ПГП 9.5+ и СФ+ терминальные аксоны состоят из четкообразных варикозных расширений и следуют вдоль ворсинок на всем их протяжении вплоть до эпителия. Так как во многих местах терминали находятся в тесной связи с клетками соединительной ткани, с эндотелием обменных капилляров, стенками сину-соидных и лимфатических сосудов, с пучками ГМК и с базальной мембраной эпителия, возникает впечатление о непосредственном контакте тех и других. На основании этих признаков можно предположить, что терминальные варикозные аксоны представляют собой дистантные парасимпатические нервные окончания типа en passant.
При использовании ИГХ реакции на ПГП 9.5 в эпителии ворсинок слизистой оболочки ДПК обнаружены необычные нейронопо-добные клетки (рис. 2, г) Эти клетки имеют треугольную или веретеновидную форму, небольшие размеры (20-25 мкм), светлые круглые ядра и иммунореактивную к белку ПГП 9.5 и СФ цитоплазму. Тела клеток находятся в тесном контакте с окружающими их энтероцитами и имеют полярность. От одного полюса клетки отходит относительно длинный отросток, который прослеживается вплоть до выхода в просвет кишки. На другом полюсе клетки наблюдается несколько коротких булавовидных выростов, окрашенных в черный цвет, которые тесно прилежат к стенке капилляра, заполненного эритроцитами. По мнению авторов, эти нейронопо-добные клетки в эпителии ворсинок представляют собой хемосенсорные элементы внутренней рефлекторной дуги ЭНС.
Для выявления структур симпатического отдела автономной нервной системы были использованы антитела к тирозингидроксилазе, маркеру, селективно выявляющему катехола-мины. Установлено, что в мышечных слоях ДПК катехоламинергические волокна встречаются значительно реже холинергических.
В мышечной стенке ДПК они проходят в смешанных пучках вместе с парасимпатическими волокнами. Те и другие представлены варикозными аксонами. Чаще ТГ+ симпатические нервные волокна и их терминальные структуры встречаются внутри ганглиозных сплетений, где образуют вокруг холинерги-ческих нейронов перицеллюлярные синапсы (рис. 2, е). ТГ+ синаптические аппараты найдены также вокруг мелких артерий и артери-ол в ММНС и ПСНС. Важно отметить, что в ворсинках слизистой оболочки ТГ+ симпатические структуры не обнаруживаются.
Следует остановится еще на одной интересной особенности структурно-функциональной организации ЭНС ДПК. С помощью ИГХ реакции на серотонин в стенке двенадцатиперстной кишки были выявлены мелкие (9-15 мкм) серотонин-содержащие клетки различной формы, снабженные короткими и длинными отростками. Большинство этих клеток локализуется в рыхлой соединительной ткани крипт, часть находится в эпителии ворсинок слизистой оболочки, а часть в самом эпителии (рис. 3, а, б, в). На некоторых срезах прослеживаются признаки миграционной активности ЕС от основания ворсинок до вершины эпителия и сквозь него в просвет кишки.
Присутствие серотонинергических клеток в различных отделах ЖКТ было показано ранее другими авторами [14, 15]. Описанные нами серотонин-содержащие клетки являются энтерохромафинными или (ЕС) клетками.
Вопросы о функции ЕС и роли серотони-на как гормона и нейротрансмиттера широко обсуждаются в литературе [10, 14]. Полагают, что трансэпителиальная сигнализация, опосредованная давлением или питательными веществами, индуцирует паракринную секрецию ЕС клетками серотонина. Последний, выступая в роли мессенджер-гормона, индуцирует моторику, секрецию, повышение проницаемости эндотелия сосудов, сенсорное восприятие, миграцию лейкоцитов, дегенерацию тучных клеток в кишечнике. Важное значение выполняет серотонин, выступая в роли нейротрансмиттера, он регулирует механизмы сложной организации рефлекторной деятельности ганглиозных сплетений ЭНС. Серотонин служит химическим
Рис. 1. Гладкомышечные клетки в ворсинках двенадцатиперстной кишки крысы. Иммуногистохимическая реакция на альфа-актин. Докраска толуидиновым синим. Ув.: х100 (а), х400 (б), х1000 (в, г)
Рис. 2. Нервные аппараты в двенадцатиперстной кишке крысы.
А - общий вид стенки кишки; б - общий вид ворсинки с СФПТ ; в, г - ворсинчатое нервное сплетение; д - ганглии и иннервация сосудов; е - симпатические терминали в микроганглиях. НК - нервные клетки микроганглия. Стрелка - нейроноподобная клетка. ИГХ реакция на белок ПГП 9.5 (в, г), синаптофизин (а, б, д) и тирозингидраксилазу (е). Подкраска толуидиновым синим (в), эозином (а, б), гематоксилином-эозином (д). Ув.: х400.
Рис. 3. Серотонин-содержащие клетки в двенадцатиперстной кишке крысы. ИГХ реакция на серотонин. До-краска толуидиновым синим (а). Ув.: х100(а), х400 (б, в.)
передатчиком импульсной активности между интернейронами нисходящих отделов миен-терального сплетения [14]. Интересно отметить, что собственно серотонинергические нейроциты и нервные волокна, аналогичные таковым в ЦНС, в ганглиозных нервных сплетений ДПК с помощью использованных ИГХ методов нами не были выявлены. Относительно ворсинок с большой определенностью можно сказать, что их функциональная активность тесно связана и с нервной и гормональной регуляцией.
Таким образом, в настоящей работе с помощью гистологических и иммуногистохимиче-ских методов установлено, что ворсинки ДПК представляют собой структурные образования с хорошо выраженной автономной тканевой организацией. Они имеют собственное кровоснабжение, иннервацию и богатый набор гастроэндокринных клеток. Предполагается, что ворсинки иннервируются парасимпатическими аксонами нейронов подслизистого ган-глиозного сплетения. Симпатические структуры в них отсутствуют. Установлено, что в рыхлой соединительной ткани и в эпителии
ворсинок двенадцатиперстном кишки постоянно выявляются многочисленные энтерох-ромаффинные клетки. В эпителии ворсинок обнаружены также неописанные ранее нейро-ноподобные клетки, содержащие белок ПГП 9.5 и синаптофизин.
Список литературы
1. Колос Е. А. Маркер синаптических контактов - синаптофизин / Е. А. Колос, И. П. Григорьев, Д. Э. Коржев-ский // Морфология. 2015. V 147. № 1. P. 78-82.
2. Колосов Н. Г. Структурная организация вегетативных ганглиев / Н. Г. Колосов, А. Я. Хабарова. Л., Наука, 1978.
3. Коржевский Д. Э. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство. / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, Е. С. Петрова и др. СПб.: СпецЛит, 2014.
4. Коржевский Д. Э. Белок PGP 9.5 и его использование в качестве функционального маркера в нейроморфо-логии / Д. Э. Коржевский, Е. А. Колос // Медицинский академический журнал. 2013. Т. 13. № 4. С. 29-35.
5. Лаврентьев Б. И. Теория строения вегетативной нервной системы / Б. И. Лаврентьев. М.: Медицина, 1983.
6. Ноздрачев А. Д. Физиология вегетативной нервной системы. / А. Д. Ноздрачев. Л.: Медицина, 1983.
7. Ноздрачев А. Д. Периферическая нервная система. / А. Д. Ноздрачев, Е. И. Чумасов. СПб.: Наука, 1999.
8. Fehér E. Ultrastructural localization of substance P, vasoactive intestinal polypeptide, somatostatin and neuropeptide Y immunoreactivity in perivascular nerve plexuses of the gut / Е. Fehér, G. Burnstock // Blood Vessels.1986. V. 23. № 3. P.125-126.
9. Foong J. P. Properties of cholinergic and non-cholinergic submucosal neurons along the mouse colon / J. P. Foong, I. R. Tough, H. M. Cox, J. C. Bornstein // J. Physiol. 2014. V. 592. № 4. P. 777-793.
10. Furness J. B. Types of neurons in the enteric nervous system / J. B. Furness // J. Auton. Nerv. Syst. 2000. V. 81. № 1-3. P. 87-96.
11. Furness J. B. The first brain: Species comparisons and evolutionary implications for the enteric and central nervous systems / J. B. Furness, M. J. Stebbing // Neurogastroenterol Motil. 2018. V 30. № 2. e13234. doi: 10.1111/nmo.13234.
12. Gabella G. Structure of the autonomic nervous system / G. Gabella. London: Chapman a. Hall. 1979.
13. Gershon M. D. The enteric nervous system: a second brain / M. D. Gershon // Hosp. Pract. 1999. V 34. № 7. P. 31-42.
14. Gershon M. D. The serotonin signaling system: from basic understanding to drug development for functional GI disorders / M. D. Gershon, J. Tack // Gastroenterology. 2007. V 132. № 1. P. 397-414.
15. Li Z. Essential roles of enteric neuronal serotonin in gastrointestinal motility and the development/survival of enteric dopaminergic neurons / Z. Li, A. Chalazonitis, Y. Y. Huang, J. J. Mann, K. G. Margolis, Q. M. Yang, D. O. Kim, F. Côté, J. Mallet, M. D. Gershon // J. Neurosci. 2011. V 31. № 24. P. 8998-9009.
