CC BY
28
© В. А. Михайлова,
О. М. Овчинникова, Я. С. Онохина,
О. Н. Аржанова,
С. А. Сельков, Д. И. Соколов
ЭКСПРЕССИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ МАРКЕРОВ НА НЕйТРОФИЛАХ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И ПРИ ГЕСТОЗЕ
НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН
УДК: 618.2+618.3-008.6]-07
■ Целью работы было проведение оценки фенотипических характеристик ней-трофилов периферической крови при беременности в норме и при гестозе.
У женщин при физиологической беременности и при гестозе по сравнению с небеременными женщинами в периферической крови присутствует повышенное количество CD119+ нейтрофилов. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ ГК №02.740.11.0711 и грантов Президента РФ № НШ-3594.2010.7, МД-150.2011.7.
■ Ключевые слова: нейтрофилы; беременность; гестоз.
Введение
Нейтрофилы постоянно присутствуют в эндометрии, где выполняют в первую очередь защитную функцию [3]. Одними из основных хемокинов для привлечения нейтрофилов являются IL-8 и MCP-1 [3, 5], продукция которых свойственна клеткам эндометрия [12]. При беременности продукция этих хемокинов характерна для ткани плаценты [1]. Однако начиная со второго триместра при физиологическом течении беременности происходит подавление хемотаксиса и адгезии нейтрофилов [3]. Отмечено, что непосредственно сам контакт нейтрофилов с клетками трофобласта приводит к ингибированию активности нейтрофилов [23]. Подавление активности этой популяции лейкоцитов при физиологической беременности может происходить не только in situ, но развиваться и на системном уровне, что подтверждается данными о снижении продукции активных радикалов кислорода и перекиси водорода нейтрофилами периферической крови при физиологическом течении беременности [11]. Однако, по другим данным активность нейтрофилов при беременности может не меняться и даже усиливаться [2]. Установлено, что фагоцитарная активность нейтрофилов у женщин с физиологическим течением беременности возрастает по сравнению с фагоцитарной активностью нейтрофилов у небеременных женщин [8]. Таким образом, данные об изменении функционального состояния нейтрофилов при беременности неоднозначны, что затрудняет понимание физиологических механизмов протекания при беременности.
Присутствие нейтрофилов в фетоплацентарном комплексе связано с процессом воспаления в ткани плаценты и развитием осложнений беременности [14, 13, 21], в том числе и гестоза. При прохождении зоны маточно-плацентарного кровотока при гестозе нейтрофилы периферической крови активируются, о чем свидетельствует повышенная интенсивность экспрессии адгезионных молекул CD11a, CD11b, CD11c ней-трофилами, выделенными из крови маточной вены [6]. Под влиянием секретируемых тканью плаценты цитокинов при гестозе наблюдается активация нейтрофилов периферической крови, что выражается в повышении продукции нейтрофила-ми активных радикалов кислорода [19]. Установлена интенсификация трансмиграции нейтрофилов через монослой эндоте-лиальных клеток под действием факторов, присутствующих в плазме крови беременных с гестозом [24]. Также при гестозе нейтрофилы периферической крови адгезируют к эндотели-альным клеткам капилляров и, таким образом, способствуют нарушению микроциркуляции [9], что приводит к развитию гипоксии ткани плаценты. Экспрессия поверхностных рецеп-
Таблица 1
Экспрессия хемокиновых рецепторов нейтрофилами периферической крови
Показатели экспрессии хемокиновых рецепторов нейтрофилами периферической крови в группах:
Я я я & И Здоровые небеременные женщины (n=27) Женщины с физиологическим течением беременности (n = 22) Женщины с гестозом (n=24)
я u § & Относительное количество, % Средняя интенсивность флюоресценции, отн. ед. Относительное количество, % Средняя интенсивность флюоресценции, отн. ед. Относительное количество, %о Средняя интенсивность флюоресценции, отн. ед.
CD184 0,7 ± 0,2 37 ± 12 0,6 ± 0,2 91± 43 1,4 ± 0,2 49 ± 12
CD119 8,4 ± 2,4 1026±66 22,7 ± 4,0** 1533 ± 97*** 31,8 ± 4,6^" 1337 ± 68"
CD192 0,5 ± 0,1 73 ± 10 1,3 ± 0,3 104 ± 12 0,6 ± 0,1 83 ± 6
CD196 1,2 ± 0,3 366 ± 40 3,9±1,2 483 ± 72 1,3 ± 0,2 259 ± 58
CD197 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1
CD185 0,5 ± 0,1 253 ± 28 1,8 ± 0,4 534 ± 56 0,9 ± 0,1 428 ± 51
CD116 0,2 ± 0,1 45 ± 10 0,2 ± 0,1 1 ± 0,4 0,2 ± 0,1 5 ± 3
** — р < 0,01, *** — р < 0,001 (группа женщин с физиологическим течением беременности достоверно отличается от группы здоровых небеременных женщин); •• — р < 0,01; ••• — р < 0,001 (группа женщин с гестозом отличается от группы здоровых небеременных женщин)
торов и, в особенности, адгезионных молекул определяет функциональные свойства лейкоцитов. Однако в литературе присутствуют весьма разрозненные данные о характере экспрессии адгезионных молекул и других фунциональных рецепторов нейтрофилами периферической крови при гестозе [6, 16, 19, 20]. Целью настоящего исследования была оценка экспрессии различных адгезионных молекул, хемокиновых рецепторов и рецепторов к ростовым факторам нейтрофила-ми периферической крови при гестозе.
Материалы и методы
Обследовано 73 женщины: 27 небеременных женщин без признаков воспалительных процессов и иных признаков патологий на момент исследования, 22 беременные женщины с физиологическим течением беременности на сроке 38-39 недель, 24 беременные женщины с гестозом на сроке 38-39 недель. Возраст обследованных женщин находился в интервале от 18 до 37 лет и в среднем составил 31,6 ± 4,2 года. Критериями исключения являлись сахарный диабет I типа, многоводие, маловодие, урогенитальная инфекция, острая инфекция или обострение хронической инфекции, гипертоническая болезнь и заболевания системы кровообращения. Материалом для исследования являлась периферическая кровь пациенток, забор которой осуществлялся в пробирки с антикоагулянтом Na2ЭДТА. Получено информированное согласие пациенток на обследование. Окраску клеток цельной периферической крови антителами осуществляли в соответствии с указаниями производителя (BD, США). В исследовании применяли антитела к адгезионным молекулам —
CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD49d, CD31, CD44, CD47, CD54, CD58, CD62L, CD62P, integrin P7; антитела к хемокиновым рецепторам и ростовым факторам — CD192 (CCR2), CD196 (CCR6), CXCR5, CD197(CCR7), CD119 (рецептор к IFNy), CD184 (CXCR4) (BD, США), CD116 (рецептор к GM-CSF). В качестве контроля неспецифического связывания использовали изотипические антитела. Анализ флюоресценции нейтрофилов проводили при помощи проточного цитофлюориметра FACS Canto II (BD, США). Статистический анализ проводили при помощи компьютерной программы AtteStat 12.1.7, используя непараметрический критерий Манна-Уитни.
Результаты
В ходе оценки экспрессии нейтрофилами периферической крови поверхностных маркеров было проанализировано как количество нейтрофилов, экспрессирующих те или иные рецепторы, так и интенсивность экспрессии нейтрофи-лами этих молекул. Установлено, что у женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами повышено количество нейтрофилов, экспрессирующих рецептор к IFNy (CD119). Интенсивность экспрессии CD119 на нейтрофилах была также повышена у здоровых беременных по сравнению с небеременными женщинами. Эти показатели были повышены и у пациенток, течение беременности которых осложнялось гестозом, в сравнении с небеременными женщинами, не отличаясь при этом от аналогичных показателей у женщин с физиологической беременностью (табл. 1). Экспрессия нейтрофилами других проанализированных рецепторов к хемо-
Таблица 2
Экспрессия адгезионных молекул нейтрофилами периферичсекой крови
Адгезионные молекулы Показатели экспрессии адгезионных молекул нейтрофилами периферической крови в группах:
Здоровые небеременные женщины (п=27) Женщины с физиологическим течением беременности (п=22) Женщины с гестозом (п=24)
Относительное количество, % Средняя интенсивность флюоресценции, отн. ед. Относительное количество, % Средняя интенсивность флюоресценции, отн. ед. Относительное количество, %о Средняя интенсивность флюоресценции, отн. ед.
СБ11с 88,2 ± 2,9 5465 ± 243 88,8 ± 2,6 5900 ± 450 95,9 ± 0,5 5676 ± 363
СБ54 41,0 ± 3,7 1119± 54 55,2 ± 3,1* 1233 ± 71 52,4 ± 3,0^ 1163±51
СБ11а 0,7 ± 0,1 573 ± 53 0,4 ± 0,1 322 ± 43 0,3 ± 0,1 430 ± 33
СБ18 44,4 ± 5,7 1187±93 52,0 ± 6,9 1244±128 42,1 ± 6,0 1021± 113
СБ62Ь 3,6 ± 0,8 612 ± 94 1,8 ± 0,7 279 ± 69 2,2 ± 0,6 309 ± 53
СБ62Р 23,5 ± 2,9 1223±181 35,5 ± 4,6 1356±194 33,3 ± 3,9 1282±192
СБ47 30,1 ± 3,4 2160 ± 220 30,3 ± 2,9 2117±129 42,2 ± 3,5 1977 ± 168
Integrmp7 0,5 ± 0,1 3 ± 1 0,4 ± 0,1 6 ± 2 0,3 ± 0,1 2 ± 1
СБ11Ь 96,8 ± 0,8 8103 ± 463 96,9±0,7 7965±486 98,2 ± 0,3 7241±553
СБ44 2,4 ± 0,7 166 ± 22 2,5 ± 0,5 183 ± 21 1,7 ± 0,4 127 ± 16
СБ58 97,8 ± 0,7 6108 ± 143 95,7±1,7 5789 ± 136 89,0 ± 2,4^" 5278± 197"
СБ29 10,8 ± 2,3 822 ± 75 15,7 ± 4,0 947 ± 70 12,2 ± 1,4 797 ± 67
CD49d 1,9 ± 0,2 88 ± 11 1,9 ± 0,2 93 ± 14 1,4 ± 0,1 71 ± 9
СБ31 95,4 ± 1,0 7053±264 94,5±1,6 6088 ± 332 79,4 ± 5,5ТТ" 5932 ± 283^
* — р < 0,05 (группа женщин с физиологическим течением беременности достоверно отличается от группы здоровых небеременных женщин); ^ — р < 0,05, Ц — р < 0,01 (группа женщин с гестозом достоверно отличается от группы женщин с физиологическим течением беременности); • — р < 0,05; •• — р < 0,01; ••• — р < 0,001 (группа женщин с гестозом отличается от группы здоровых небеременных женщин)
кинам и ростовым факторам достоверно не разли-чилась между группами (табл. 1).
При анализе экспрессии нейтрофилами адгезионных молекул установлено, что у женщин с физиологическим течением беременности по сравнению с небеременными женщинами в периферической крови присутствует большее количество нейтро-филов, экспрессирующих CD54 (1САМ-1). В то же время интенсивность экспрессии CD54 нейтрофи-лами в группах здоровых небеременных женщин и женщин с физиологической беременностью не различалась. Количество CD54+ нейтрофилов у беременных женщин с гестозом также повышено по сравнению со здоровыми небеременными женщинами. При этом интенсивность экспрессии CD54 нейтрофилами не различалась между обследованными группами женщин (табл. 2).
Установлено, что количество нейтрофилов, экспрессирующих адгезионные молекулы CD58 (LFA-3) и CD31 (РЕСАМ-1), снижено при гестозе по сравнению с физиологической беременностью. Интенсивность экспрессии CD58 и CD31 была одинаковой у женщин с физиологической беременностью и женщин с гестозом. При сравнении группы женщин с гестозом и здоровых небеременных женщин также выявленно сниженное количество нейтрофилов периферической крови, экспрессиурющих CD58 и CD31. Интенсивность экспрессии CD58 и CD31 нейтрофилами у беременных женщин с гестозом была снижена по
сравнению со здоровыми небеременными женщинами (табл. 2). Экспрессия нейтрофилами периферической крови других исследуемых адгезионных молекул не различалась между всеми обследованными группами (табл. 2).
Обсуждение
Физиологическое течение беременности и развитие плода обусловлено модулированием функций клеток ткани плаценты и клеток иммунной системы матери. Одним из цитокинов, изменяющих функциональные характеристики лейкоцитов, является №N7, секреция которого характерна для ткани плаценты как при физиологическом течении беременности, так и при гестозе [1]. Установленное нами увеличенное количество нейтрофилов периферической крови, экспрес-сирующих рецептор №N7 (CD119) и повышенная интенсивность экспрессии этими клетками CD119 как при физиологической беременности, так и при гестозе по сравнению с небеременными женщинами, указывает на повышенную способность нейтрофилов отвечать на стимуляцию №N7 и готовность этих клеток к реализации неспецифической защитной реакции.
Как при неосложненной беременности, так и беременности, осложненной гестозом, в ткани плаценты присутствуют NK-клетки, являющиеся основными продуцентами №N7 При физиологической беременности их цитотоксическая актив-
ность подавляется [15], в то время как при гестозе NK-клетки активированы [15], что сопровождается изменением экспрессии поверхностных молекул [4]. Активированные NK-клетки способствуют поддержанию жизнеспособности нейтрофилов и влияют на функциональное состояние нейтрофилов как с помощью цитокинов (IFNy), так и непосредственно, образуя прямой контакт. Ранее показано, что в результате совместного культивирования нейтрофилов и активированных NK-клеток происходило уменьшение количества нейтрофилов, ушедших в апоптоз, повышение экспрессии нейтрофилами CD64 и CDllb [18]. Также предшествовавший контакт с активированными NK-клетками вызывал повышенную продукцию нейтрофилами сипероксид-анионов в ответ на белковые антигены бактерий [18]. В модельной системе установлено, что NK-клетки образуют контакт с клетками-мишенями, экспрессирующими CD58 (LFA-3), и в особенности совместно экспрессирующими CD58 и CD54 (ICAM-1) [7]. Таким образом, обнаруженное нами высокое содержание нейтро-филов, экспрессирующих CD58 и CD54, как при физиологической беременности, так и при гестозе определяет готовность нейтрофилов к взаимодействию с NK-клетками. Однако при физиологической беременности инфильтрация нейтрофилами децидуальной ткани и ткани плаценты отсутствует [14], поэтому взаимодействие NK-клеток и нейтрофилов в зоне маточно-плацентарного ложа маловероятно. При гестозе нейтрофилы присутствуют в децидуальной ткани и ткани плаценты [14], что определяет возможность их контакта с другими клетками децидуальной ткани. Поскольку активация нейтрофилов происходит с участием адгезионных молекул CD54 [22], за счет установленной высокой экспрессии CD58 и CD54 нейтрофилы при гестозе могут активироваться in situ NK-клетками и способствовать развитию воспалительной реакции. Ткань плаценты при гесто-зе секретирует провоспалительные цитокины [1]. Проходя зону маточно-плацентарного кровотока предактивированные CD119+ нейтрофилы подвергаются влиянию провоспалительных цитокинов, что может способствовать повышению экспрессии адгезионных молекул на этих клетках и являться причиной установленной ранее повышенной адгезии нейтрофилов к эндотелию капилляров при гестозе [9]. В свою очередь взаимодействие эн-дотелиальных клеток и нейтрофилов при гестозе способствует нарушению микроциркуляции, продукции нейтрофилами активных форм кислорода и развитию эндотелиальной дисфункции.
По данным, описанным в литературе, адгезионная молекула PECAM-1 (CD31) определяет активацию [17] и трансэндотелиальную мигра-
цию нейтрофилов [10]. Однако в настоящем исследовании нами отмечено снижение количества CD31+ нейтрофилов периферической крови при гестозе по сравнению с физиологической беременностью. Принципиальных различий экспрессии других адгезионных молекул и рецепторов к хемокинам между обследованными группами женщин выявлено не было.
Таким образом, нейтрофилы периферической крови в целом при беременности характеризуются повышенной экспрессией рецепторов к IFNy. Высокий уровень экспрессии CD119 нейтрофилами свидетельствует об их повышенной способности отвечать на стимуляцию IFNy, продукция которого при гестозе увеличена локально в области маточно-плацентарного кровотока. Экспрессия рецепторов к IFNy, а также высокий уровень экспрессии CD58 и CD54 определяют готовность нейтрофилов к реализации неспецифической воспалительной реакции и отражает метаболические изменения в организме женщины, происходящие при физиологической беременности и при гестозе.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ ГК №02.740.11.0711 и грантов Президента РФ № НШ-3594.2010.7, МД-150.2011.7.
Литература
1. Роль цитокинов в контроле развития плаценты в норме и при гестозе / Соколов Д. И. [и др.] // Иммунология. —
2009. — №1. — С. 22-27.
2. Сельков С. А., ПруцкийВ. Ю., ЯрмолинскаяМ. И. Метаболическая активность моноцитов и нейтрофилов при некоторых формах патологии беременности // Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины: материалы XXI научной сессии НИИ АИГ Д. И. Отта. — СПб.,1992. — C. 15-18.
3. Ширшев С. В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий. — Екатеринбург: УрО РАН, 2009. — 582 с.
4. Экспрессия адгезионных молекул и хемокиновых рецепторов NK-клетками периферической крови при беременности / Михайлова В. А. [и др.] // Иммунология. — 2011. — Т. 32, №2. — С. 78-81.
5. ЯрилинА. А. Иммунология: Учебник. — М.: ГЭОТАР-Медиа.
2010. — 752 с.
6. Activation of Leukocytes During the Uteroplacental Passage in Preeclampsia / Mellembakken J. R. [et al.] // Hypertension. — 2002. — Vol. 39. — P. 155-160.
7. BarberD. F., LongE. O. Coexpression of CD58 or CD48 with Intercellular Adhesion Molecule 1 on Target Cells Enhances Adhesion of Resting NK Cells // J. Immunol. — 2003. — Vol. 170. — P. 294-299.
8. Barriga C., Rodriguez A. B., Ortega E. Increased phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes during pregnancy //
European J. Obst. Gynecol. Reprod. Biol. — 1994. — Vol. 57, №1. — P. 43-46.
9. Cadden K. A., Walsh S. W. Neutrophils, but not Lymphocytes or Monocytes, Infiltrate Maternal Systemic Vasculature in Women with Preeclampsia // Hypertens Pregnancy. — 2008. — Vol. 27, №4. — P. 396-405.
10. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells / N. Thin Luua [et al.] // J. Vasc. Res. — 2003. — Vol. 40. — P. 467-479.
11. Crouch S. P., Crocker I. P., Fletcher J. The effect of pregnancy on polymorphonuclear leukocyte function // J. Immunol. — 1995. — Vol. 155, N 11. — P. 5436-5443.
12. Cytokines, chemokines and growth factors in endometrium related to implantation / Dimitriadis E. [et al.] // Human Reprod. Update. — 2005. — Vol. 11, №. 6. — P. 613-630.
13. Histologic Chorioamnionitis and Preterm Delivery / Holzman C. [et al] // Am. J. Epidemiol. — 2007. — Vol. 166, N 7. — P. 786-794.
14. Immunocytochemical localization of neutrophil elastase in term placenta decidua and myometrium in pregnancy-induced hypertension / Butterworth B. H. [et al.] // Br. J. Obstet. Gynaecol. — 1991. — Vol. 98, N 9. — P. 929-933.
15. Kopcow H. D., Karumanchi S. A. Angiogenic Factors and Natural Killer (NK) Cells in the Pathogenesis of Preeclampsia // J. Reprod. Immunol. — 2007. — Vol. 76, №1-2. — P. 23-29.
16. Leik C. E., Walsh S. W. Systemic activation and vascular infiltration of neutrophils with term labor // J. Soc. Gynecol. Investig. — 2006. — Vol. 13, N 6. — P. 425-429.
17. Ligation of CD31/PECAM-1 modulates the function of lymphocytes, monocytes and neutrophils / Elias C. G. [et al.] // Eur. J. Immunol. —1998. — Vol. 28, N 6. — P. 19481958.
18. Neutrophil activation and survival are modulated by interaction with NK cells / Costantini C. [et al.] // International Immunology. — 2010. — Vol. 22, N 10. — P. 827-838.
19. Neutrophil activation induced by placental factors in normal and pre-eclamptic pregnancies in vitro /
■ Адреса авторов для переписки-
Михайлова Валентина Анатольевна — научный сотрудник лаборатории иммунологии
Овчинникова Ольга Михайловна — студентка Санкт-Петербургского государственного университета
Онохина Яна Сергеевна — студентка Санкт-Петербургского государственного университета
Аржанова Ольга Николаевна — д м н, профессор, заведующая дородовым отделением
Сельков Сергей Алексеевич — д м н, профессор, заведующий лабораторией иммунологии
Соколов Дмитрий Игоревич — д б н, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИАГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН
199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: [email protected].
Wanga Y. [et al.] // Placenta. — 2001. — Vol. 22. — P. 560-565.
20. Parameters of peripheral whole blood neutrophil activity in women with pregnancy induced hypertension / Wieczorek A. [et al.] // Ginekol. Pol. — 2001. — Vol. 72, N 12. —P. 1222-1227.
21. Placental structure and inflammation in pregnancies associated with obesity / Robertsa K. A. [et al.] // Placenta. — 2011. — Vol. 32, N 3. — P. 247-254.
22. Takashi S., Okubo Y., Horie S. Contribution of CD54 to human eosinophil and neutrophil superoxide production // J. Appl. Physiol. — 2001. — Vol. 91. — P. 613-622.
23. Trophoblast Contact Deactivates Human Neutrophils / Petty H. R. [et al.] // J. Immunology. — 2006. — Vol. 176. — P. 3205-3214.
24. Walsh S. W. Plasma from Preeclamptic Women Stimulates Transendothelial Migration of Neutrophils // Reprod. Sci. — 2009. — Vol. 16, N 3. — P. 320-325
Статья представлена И. М. Кветным, НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН,
Санкт-Петербург
NEUTROPHILS EXPRESSION OF SURFACE MARKERS IN CASE OF HEALTHY PREGNANCY
Mikhaylova V. A., Ovchinnikova O. M., Onohina Y. S., Arghanova O. N., Selkov S. A., Sokolov D. I.
■ Summary: The aim of the study was to assess phenotype characteristics of peripheral blood neutrophils in case of normal pregnancy and preeclampsia. The amount of CD119+ neutrophils was elevated in peripheral blood in case of normal pregnancy and preeclampsia comparing with healthy nonpregnant women. This study was supported by grants НШ-3594.2010.7, ГК №02.740.11.0711, МД-150.2011.7.
■ Key words: neutrophils; pregnancy; preeclampsia.
Mikhaylova Valentina Anatolevna — researcher of laboratory of immunology
Ovchinnikova Olga Mikhaylovna — student of Saint-Petersburg State University
Onohina Yana Sergeevna — student of Saint-Petersburg State University
Arghanova Olga Nikolaevna — PhD, MD, chief of Obstetrics Department
Selkov Sergey Alekseevich — PhD, MD, chief of laboratory of immunology
Sokolov Dmitriy Igorevich — PhD, chief researcher of laboratory of immunology
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. 3, Mendeleyevskaya Line, 199034, St. Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
