CC BY
13
DOI: 10.34617/tyd5-z704 УДК 639.4:578.232
НЕСТРУКТУРНЫЙ БЕЛОК ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ КУР ИМЕЕТ СХОДСТВО С БЕЛКАМИ ФАГОВ
СЕМЕЙСТВА MICRO VIRIDAE THE NON-STRUCTURAL PROTEIN OF THE INFECTIOUS ANEMIA VIRUS VIRUS IS SIMILAR TO THE PROTEINS OF PHAGES OF THE FAMILY OF MICROVIRIDAE
Зимин Андрей Антонович1, канд. биол. наук
Скобликов Николай Эдуардович2, канд. мед. наук
1 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г. К. Скрябина РАН - обособленное подразделение ФГБНУ
«Пущинский научный центр биологических исследований»
РАН, г. Пущино, Российская Федерация
2ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии
и ветеринарии», г. Краснодар, Российская Федерация
Zimin Andrey Antonovich1, PhD. Biol.
1G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of
Microorganisms of the Russian Academy of Sciences, Russian
Federation, Pushchino
Skoblikov Nikolay Edvardovich2, PhD. Med. 2Krasnodar Scientific Center for Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Krasnodar, Russian Federation
Аннотация: в данном эволюционном исследовании проведен поиск гомологов неструктурного белка вируса CAV, на следующем этапе построено филогенетическое дерево гомологов этого белка у бактериофагов семейства Microviridae. Показано, что белок CAV находится в центре дерева его гомологов из вирусов бактерий, что указывает на возможность ложноположи-тельных ответов при иммуноферментном обнаружении вируса за счет взаимодействия антител к вирусу с белками фагов-микровирусов.
Ключевые слова: неструктурный белок вируса CAV; филогенетическое дерево гомологов; бактериофаги семейства Mi-
croviridae; ложноположительный ответ ИФА; белки фагов-микровирусов.
Abstract: in this evolutionary study, a search was made for the homologs of the non-structural protein of the CAV virus; at the next stage, a phylogenetic tree of the homologs of this protein was constructed in bacteriophages of the Microviridae family. It has been shown that the CAV protein is located in the center of the tree of its homologs from the bacterial virus, which indicates the possibility of false-positive responses during enzyme-linked immunosorbent assay of the virus due to the interaction of antibodies to the virus with proteins of Microviridae phages.
Key words: non-structural protein of the CAV virus; phyloge-netic tree of homologs; bacteriophages of the Microviridae family; false-positive ELISA; phage-microvirus proteins.
Введение. Одной из наиболее интересных и интригующих задач биологии является расшифровка происхождения и эволюции вирусов. Вирусы - это корпускулярная форма жизни, которая в отличие от клеточной формы жизни может быть весьма примитивной. Вероятно, самыми примитивными вирусами в свою очередь являются представители семейства Circoviridae, имеющие геном длиной около 2000 нуклеотидов, кодирующий два - три белка. В тоже время эти вирусы являются значимыми патогенами в сельском хозяйстве, вызывая цирковирусную инфекцию свиней (вирус PCV-2 - postweaning multisystemic wasting syndrome) и вирусную анемию (грипп) у цыплят (вирус - CAV -Chicken anemia virus).
Вирус CAV относится к роду Gyrovirus семейства Circoviridae. Он является этиологическим агентом инфекционной анемии кур. CAV инфицирует клетки костного мозга, что приводит к тяжелой анемии и иммуносупрессии у молодых цыплят или тяжелой коррекции иммунного ответа у половозрелых птиц. Исследования по молекулярной эпидемиологии CAV у больных кур проводятся довольно широко во всем мире. Например, в Китае с 2014 по 2015 годы было обнаружено, что CAV-положительный ответ составил 13,30 %. В этой же стране в те годы было выделено 15 новых штаммов CAV. Самые различные методы используются для анализа заболевшей птицы: это
непрямой иммунофлуоресцентный анализ, вестерн-блоттинг и ПЦР. Филогенетический анализ полученных последовательностей, доступных в GenBank, позволил разделить штаммы CAV на четыре различные группы (A - D) [1]. Для создания филогенетических деревьев обычно используются предсказанные последовательности вирусного белка (VP) [1]. Альтернативное использование неструктурного белка тоже может дать весьма интересные результаты. Но в обоих случаях возникает вопрос - не могут ли белки других вирусов или даже бактериофагов дать ложноположительные ответы.
Цель исследования. В царстве вирусов обнаруживают сходства структуры белков у весьма удаленных представителей корпускулярной формы жизни. В этой работе мы поставили задачу поиска в базах данных последовательностей белков бактериофагов гомологов и сходных последовательностей с неструктурным белком вируса куриной анемии - CAV и задачу последующего филогенетического анализа полученных хитов.
Методика. Методы биоинформатики, использованные в работе, и тактика анализа. С помощью алгоритма BLASTp [2] проводили сравнение аминокислотной последовательностей неструктурного белка вируса кур CAV с базой данных белковых последовательностей Genbank на сервере NCBI [3].
Использовали разделы БД Genbank, таксиды, включающие фаги, имеющие отростки и микровириды, по отдельности.
Нами было введено ограничение на уровень достоверности результатов - Е-value < 7.
Найденные последовательности использовали для последующего филогенетического исследования. Последовательности сохраняли в виде текстового файла, содержащего полные аминокислотные последовательности белков-аналогов.
Был осуществлен филогенетический анализ гомологов белка нуклеокапсида денсовируса SSaDV.
Для этого предварительно были проведены выравнивания последовательностей с помощью программы Muskul [4], филогенетическое дерево строилось с помощью пакета программ Mega6 [4]. Длина неструктурного белка нуклеокапсида гирови-руса CAV 222 аминокислотных остатка.
Рис. 1 - Карта генома вируса CAV. Стрелками обозначены рамки трансляции вируса, кодирующие его белки: VP1, VP2, VP3.
(Модифицировано из [1]).
Результаты исследований и их обсуждение. Поиск гомологов неструктурного белка вируса CAV среди последовательностей белков фагов семейства Microviridae.
Программным средством BLASTp было найдено 10 гомологов NSP CAV при значении статистической характеристики Е < 7.
Остальные параметры сравнения были следующие: длина слова (Word size) - 6, матрица синонимических замен -BLOSUM80, штраф на открытие бреши - 11, на расширение - 1, фильтры и маски не использовались. Использовался таксид (подБД) - микровирусы.
Для того чтобы понять основы сходства NSP CAV в эволюции денсовирусов беспозвоночных мы предприняли филогенетический анализ.
Филогенетическое исследование гомологов неструктурного белка вируса CAV и его гомологов из семества фагов Microviridae.
Эволюционная история была выведена и филогенетическое дерево было построено с помощью метода максимального правдоподобия (Maximum Likelihood), основанного на матричной модели JTT [5]. Статистический бутстрап-анализ проведен путем 1000 итераций [6].
Рис. 2 - Молекулярно-филогенетический анализ гомологов структурного белка гировируса из семейства фагов Micro-viridae максимального правдоподобия (Maximum Likelihood).
На рисунке 2 показано дерево с самым высоким логарифмическим правдоподобием (-11578,0225). Ветви, в которые связанные таксоны сгруппированы вместе, статистически оценены в процентах устойчивости при бутстрап-анализе. Процент показан рядом с ветвями. Исходное дерево для эвристического поиска были получено автоматически с использованием метода Maximum Parsimony. Дерево построено в масштабе, при котором длина ветвей измеряется числом замен на сайт.
В анализе были использованы 11 аминокислотных последовательностей. Все позиции, содержащие пробелы и делеции, были исключены. В итоговом наборе данных было 64 позиций. Эволюционный анализ был проведен в MEGA6 [9]. Аминокислотная последовательность неструктурного белка гировируса кур отмечена черным квадратом и выделена шрифтом ArialBold, микровирусы бактерии Cellulophaga algicola - серыми ромбами, последовательности из фагов, ассоциированных с позвоночными
животными: капибарой и черепахой - черными квадрватами, остальные аминокислотные последовательности микровимрусов - серыми кружками.
Выводы. Последовательность белка из вируса CAV находится среди радиации последовательностей гомологов из микро-вирид. Это указывает на реальную возможность узнавания белков бактериофагов семейства Microviridae антителами, полученными против белка вируса, вызывающего анемию и коррекцию иммунной системы цыплят.
Работа была поддержана для Скобликова Н.Э. проектом РФФИ 19-44-230040 р_а.
Список литературы
1. Virus Taxonomy: The Classification and Nomenclature of Viruses. The 9th Report of the ICTV (2011) https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_9th_report/ Дата обращения 11.09.2019
2. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Mille,r W., Lipman, D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.
3. Сайт http//www.ncbi.nlm.nih.gov Дата обращения 09_09_2019.
4. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., and Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. // Mol. Biol. and Evol. 2013. V. 30. P. 2725-2729.
5. Jones, D.T., Taylor, W.R., and Thornton, J.M. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences. // Computer Appl. in the Biosciences. 1992. V. 8. P. 275-282.
6. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. // Evolution. 1985. V. 39. P. 783-791.
