CC BY
79
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:576.895.122
НЕРВНАЯ И МЫШЕЧНАЯ СИСТЕМА ЦЕРКАРИЙ И ВЗРОСЛЫХ ФОРМ ТРЕМАТОД Cryptocotyle lingua и C. concavum (Heterophyidae)
Н.Б. ТЕРЕНИНА доктор биологических наук О.О. ТОЛСТЕНКОВ кандидат биологических наук
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, e-mail: terenina_n@mail.ru М. ГУСТАФССОН доцент
Отдел биологии Университета г. Турку, Финляндия О.С. ОСИПОВА студент
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова В.В. КУКЛИН, М.М. КУКЛИНА кандидаты биологических наук
Мурманский морской биологический институт Кольского научного центра РАН
С помощью иммуноцитохимического метода и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии исследовано наличие и локализация нейромедиаторов се-ротонина и нейропептида FMRF амида в нервной системе двух видов трематод семейства Heterophyidae — Cryp-tocotyle lingua и C. concavum. Исследуемые нейроме-диаторы выявлены в центральных и периферических отделах нервной системы взрослых форм и церкарий. Наличие серотонинергических и пептидергических нервных волокон вблизи мышечных элементов предполагает, что исследуемые нейромедиаторы принимают участие в регуляции сократительной активности мышц стенки тела, прикрепительных органов и репродуктивной системы трематод.
Ключевые слова: трематоды, нервная система, ней-ромедиаторы, серотонин, нейропептиды.
Результаты исследований ряда паразитических плоских червей свидетельствуют о том, что в деятельности их нервной системы принимают участие ряд нейрональных сигнальных веществ, включая серотонин, нейропептиды [5]. Предполагают, что функциональное значение этих нейромедиаторов связано с регуляцией сократительной активности мышц паразитов. Сведения о нейрохимических механизмах жизнедеятельности паразитических червей имеют не только общебиологическое, но и практическое значение, поскольку могут служить основой для поиска новых антигельминтных препаратов, целенаправленно влияющих на нервную систему паразитов. С целью дальнейшего исследования нейромедиаторов у гельминтов в настоящей работе с помощью иммуноцитохимического метода изучали наличие и распределение серотонинергических и пептидергических (БМКРамидергических) компонентов в нервной системе трематод на различных стадиях их развития. Были исследованы церкарии и взрослые формы двух представителей трематод
семейства Heterophyidae - Cryptocotyle lingua Creplin,1925 и C. concavum Creplin,1825 - паразитов птиц Баренцева моря.
Материалы и методы
Гельминтов C. concavum и C. lingua извлекали из кишечника серебристой чайки Larus argentatus (район Баренцева моря). Церкарии были получены от брюхоногих моллюсков - Littorina littorea (C. lingua) и Hydrobia ulvae (C. concavum) (Белое море). Материал фиксировали в 4%-ном параформаль-дегиде в 0,1 М фосфатном буферном растворе faH 7,4) при 4 оС и затем сохраняли в 10%-ной сахарозе, приготовленной на 0,1 М фосфатном буфере. Локализацию серотонинергических и пептидергических (FMRFамидергичес-ких) компонентов определяли иммуноцитохимически в соответствии с методом Coons et al. [4]. Образцы инкубировали в первичной антисыворотке (Incstar, USA, в разведении 1 : 500) при температуре +4 °C; затем во вторичной антисыворотке (FITC, DAKO, в разведении 1 : 50). Для исследования взаимоотношения выявляемых нейромедиаторов с мышечными элементами одновременно проводили окраску мышечных волокон, используя связанный с флуорофором фаллоидин. Мышцы окрашивали тетраметилродамин изотио-цианат меченым фаллоидином (в разведении 1 : 200) в соответствии с методом, описанным Wahlberg [10]. Препараты исследовали с помощью Leica TCS 4D конфокального сканирующего лазерного микроскопа, соединенного с Leitz Aristoplan флуоресцентным микроскопом.
Результаты и обсуждение
C. concavum (взрослая форма). Длина тела гельминта составляет 0,7691,000 мм, ширина - 0,678-0,791 мм. Размер ротовой присоски - 0,064-0,079 х 0,074-0,084 мм. Брюшная присоска (0,054 х 0,067 мм) недоразвита и лежит в передней стенке гениального синуса, в котором находится половая присоска. В центре половой присоски открывается половое отверстие [1]. Ширина кольцевых, продольных и диагональных мышц стенки тела трематоды примерно 1-2 мкм. Расстояние между кольцевыми мышцами около 2 мкм, между продольными - 4 мкм, между диагональными - примерно 10 мкм. Хорошо выражены радиальные мышечные волокна ротовой присоски, глотки, а также кольцевые мышцы пищевода (рис. 1А, Б).
Серотонинергические нервные клетки (диаметром 5-10 мкм) и волокна выявлены в области головных ганглиев; в волокнах, идущих к ротовой присоске; в продольных нервных стволах; в области полового отверстия (рис. 1 Б). Также хорошо видны интенсивно окрашенные серотонинергические волокна и клетки (диаметром около 7 мкм), расположенные вблизи протоков репродуктивной системы (рис. 1 Г). Сеть из серотонинергических волокон наблюдается в стенке тела паразита.
FMRFамидергические отделы нервной системы окрашены более интенсивно, чем серотонинергические (рис.1 В). Положительная окраска обнаружена в клетках и нервных волокнах головных ганглиев, церебральной комис-суре, связывающей их, продольных нервных стволах. От головных ганглиев к ротовой присоске идут положительно окрашенные волокна. Вдоль наиболее мощных главных продольных нервных стволов расположены нервные клетки, диаметр которых составляет около 7 мкм. Продольные нервные стволы связаны комиссурами.
C. concavum (церкарии). Размер тела церкарий C. concavum составляет 124 х 60 мкм. Самые тонкие и плотно расположенные - кольцевые мышцы (7 волокон на 7 мкм), расстояние между ними менее 1 мкм. Продольные мышцы более толстые и расположены более редко; расстояние между ними составляет 2-3 мкм. Диагональные мышечные волокна еще более редкие, чем продольные, и находятся на расстоянии 8-15 мкм друг от друга (рис. 1 Д).
Ширина хвоста в средней части составляет 17-20 мкм. Мышцы хвоста у церкарий C. concavum состоят из кольцевых волокон и четырех лент продольных мышц, толщина каждой из которых равна 4-6 мкм. Иногда четко видна спиральная направленность продольных мышечных волокон. В начальной части хвоста, помимо плотно расположенных кольцевых мышц, видны редко расположенные поперечные структуры, имеющие вид кольцевых мышечных волокон (рис. 1 Д).
Окраска на серотонин на препаратах церкарий C. concavum была выражена довольно слабо. Тем не менее можно было видеть контуры слабо окрашенных головных ганглиев, комиссуры, связывающих их, и вентральные нервные стволы.
Наиболее интенсивную окраску наблюдали у церкарий на РМЯРами-дергические элементы (рис. 1 Е). Положительная реакция отмечена в нервных клетках и волокнах головных ганглиев, мозговой комиссуре, в нервных волокнах, идущих к ротовой присоске. По ходу главных продольных нервных стволов имеются нервные клетки, расположенные как в средней, так и задней части тела церкарии. В месте соединения хвоста и тела церкарии имеется группа мелких БМИБамидергических клеток. Вдоль оси хвоста церкарии C. concavum проходят два нервных волокна, иммунореактивных к БМИБамиду.
C. Lingua (взрослая форма). Длина тела паразита составляет 0,60-2,112 мм, ширина 0,528-0,624 мм. Диаметр ротовой присоски - 0,064-0,096 мм. Брюшная присоска располагается в передней части генитального синуса, диаметр ее 0,064-0,096 мм, радиальные мышцы брюшной присоски развиты хорошо. Позади брюшной присоски в генитальном синусе располагается хорошо развитая половая присоска, достигающая 0,74-0,096 мм в диаметре [1].
Мышцы стенки тела (кольцевые, продольные и диагональные) хорошо развиты (рис. 2 А, Б). Кольцевые мышечные волокна тоньше, чем продольные и более плотно расположены. Расстояние между продольными волокнами составляет 1-3 мкм, между диагональными - от 5-7 до 20 мкм. Хорошо окрашены кольцевые и радиальные мышцы глотки, продольные и кольцевые мышцы кишечника, мышцы протоков половой системы, а также мышечные волокна ротовой, брюшной и половой присосок (рис. 2 В, Г).
Серотонинергические нервные волокна наиболее четко выявлялись в области головных ганглиев (рис. 2 Б), а также в продольных нервных стволах и в области генитального синуса.
Окраска на БМИБамидергические нервные структуры более выражена по сравнению с таковой на серотонинергические элементы и отмечена в головных ганглиях, комиссуре, связывающих их, в волокнах, идущих от головных ганглиев к ротовой присоске, в продольных нервных стволах и комиссурах, связывающих их (рис. 2 В). Обильная нервная сеть из БМИБамидергических волокон наблюдается в области конечных отделов репродуктивной системы и полового отверстия (рис. 2 Г).
C. Lingua (церкарии). Длина тела церкарии составляет 100-190 мкм, ширина 70-100 мкм, ширина хвоста в средней части - от 12 до 23 мкм. Кольцевые, продольные и диагональные мышечные волокна стенки тела хорошо развиты (рис. 2 Д). Довольно плотно расположенные кольцевые мышечные волокна (примерно шесть волокон на 5-7 мкм) являются очень тонкими. Продольные волокна шириной около 1 мкм расположены более редко и расстояние между ними составляет приблизительно 1 мкм. Диагональные мышцы (шириной около 1 мкм) расположены относительно редко, расстояние между ними равно 4-11 мкм. В конце тела на границе с хвостом продольные мышечные волокна собираются в пучок.
Как и у церкарий C. concavum, у церкарий C. lingua мышцы хвоста состоят из кольцевых и продольных мышц. Помимо тонких кольцевых волокон, расположенных снаружи очень плотно, в начальном отделе хвоста обнаружено несколько редко расположенных (через 7-20 мкм) поперечно идущих
Рис.1. Cryptocotyle concavum: А. Мышечные волокна стенки тела; Б. Иммунореактивность к серотонину в нервных клетках и волокнах в области головных ганглиев; в волокнах, иннервирующих ротовую присоску, в продольных нервных стволах; В. Положительная окраска на FMRFамид в клетках и нервных волокнах головных ганглиев, церебральной комиссуре, продольных нервных стволах, в комис-сурах, связывающих их. Иммунореактивные к FMRFамиду нервные волокна иннервируют ротовую присоску; Г. Серотонинергические волокна и клетки вдоль протоков репродуктивной системы; Д. Мышцы стенки тела и хвоста церкарии; Е. Положительная реакция на FMRFамид в нервных клетках и волокнах головных ганглиев, мозговой комиссуре, в нервных волокнах, идущих к ротовой присоске церкарии. (Здесь и далее окраска мышечных волокон -красная, иммунореактивность к серотонину или FMRF амиду - зеленая)
Рис.2. Cryptocotyle lingua: А. Мышечные волокона стенки тела, ротовой присоски и глотки; Б. Иммунореактивность к серотонину в продольных нервных стволах; В. Иммунореактивность к FMRF амиду в головных ганглиях, в волокнах, идущих к ротовой присоске, в продольных нервных стволах; Г. FMRF амид иммунореактивные нервные волокна в конечных отделах репродуктивной системы и области полового отверстия; Д. Мышечные волокна стенки тела церкарии; Е. Иммунореактивность к серотонину в нервных волокнах области брюшной присоски церкарии; Ж. FMRF амид иммунореактивные нервные клетки и волокна в головных ганглиях, центральной комиссуре, в волокнах, иннервирующих ротовую присоску, в продольных нервных стволах, в комиссурах, связывающих их; З. Иммунореактивные к серотонину две нервные клетки в хвосте церкарии
окрашенных структур, имеющих вид кольцевых мышечных волокон (рис. 2 Д). Продольные мышечные волокна в хвосте идут в виде четырех лент, толщина которых составляет 4-10 мкм (рис. 2 З). В ряде случаев мышечные волокна в хвосте имели вид спирально идущих волокон. Серотонинергические нервные клетки и волокна выявлены в области расположения головных ганглиев, комиссуре, соединяющих их, в продольных нервных стволах и в комис-сурах между ними. От нервных клеток, расположенных примерно в средней части главных нервных стволов идут серотонинергические волокна к области тела, где в дальнейшем формируется брюшная присоска (рис. 2 Е). В этой же области наблюдается несколько мелких нервных клеток. В хвосте церкарии видны два тонких нервных ствола, идущие вдоль оси хвоста. Две нервные клетки (диаметром 6 мкм), содержащие серотонин, расположены в средней части хвоста церкарии (рис. 2 З).
Окраска нервных элементов, содержащих нейропептид БМКРамид, по сравнению с реакцией на серотонин, у церкарий более выражена. Положительная окраска видна в головных ганглиях, комиссуре, связывающих их, в волокнах, идущих от головных ганглиев к ротовой присоске, в продольных нервных стволах, два из которых являются более мощными, и в комиссурах, связывающих их, а также в нервных клетках по ходу продольных нервных стволов. Несколько мелких БМКРергических нервных клеток обнаружено на границе хвоста и тела. В хвосте церкарий проходят четыре тонких продольных нервных ствола, содержащих БМКРамид.
Полученные результаты показали, что стенка тела взрослых форм трематод C.concavum и C. lingua представлена хорошо развитыми мышцами, состоящими из кольцевых, продольных и диагональных мышечных волокон, что согласуется с данными, полученными в отношении других представителей трематод [5]. Самыми тонкими и более плотно расположенными являются наружные кольцевые мышечные волокна; продольные мышцы несколько толще и расстояние между ними большее, чем между кольцевыми. Более редко расположенными являются диагональные волокна. Можно отметить некоторые различия в размере мышечных волокон и их количестве у различных представителей трематод.
Исследование мышц церкарий C. concavum и С. lingua показывает, что у церкарий, как и у взрослых форм, мышцы стенки тела, представленные кольцевыми, продольными и диагональными волокнами, хорошо развиты. Размер мышечных волокон и расстояние между ними у исследованных церкарий несколько различается.
При сравнении мышц церкарий и взрослых форм можно отметить, что у взрослых гельминтов размер и расстояние между мышечными волокнами увеличивается по сравнению с соответствующими показателями у личиночных форм.
Мышцы хвоста церкарий у обоих видов исследованных трематод представлены кольцевыми и продольными мышечными волокнами, идущими вдоль оси хвоста в виде четырех лент, иногда спирально направленных. В начальном отделе хвоста церкарий, помимо кольцевых мышц, довольно плотно расположенных с наружной стороны, наблюдают редкие поперечно направленные структуры, имеющие вид мышечных волокон (рис. 1 Д, 2 Д).
Полученные нами данные показали, что в центральных и периферических отделах нервной системы исследованных трематод, содержатся серотонинерги-ческие и РМЯРамидергические элементы. Исследуемые нейромедиаторные вещества обнаружены в головных ганглиях, церебральной комиссуре, продольных нервных стволах и комиссурах, соединяющих их. Отмечена иннервация ротовой и брюшной присосок, области расположения полового отверстия, а также половых протоков. В целом, полученные данные о наличии в нервной системе исследованных трематод серотонина и нейропептида БМКРамида согласуются с литературными сведениями по этому вопросу, имеющимися в отношении других представителей трематод [2, 5-8 и др.]. В то же время можно отметить некото-
рые различия в наличии исследуемых нейромедиаторов у разных представителей трематод, которые касаются некоторых деталей, относящихся, например, к общему числу нервных клеток и их расположению у того или иного вида.
Результаты, полученные нами, и данные литературы [3, 7-9 и др.] свидетельствуют, что исследуемые нейромедиаторы выявляются у личиночных стадий трематод. При этом общий план строения нервной системы, выявленный у церкарий, сохраняется и у взрослых форм. Следует отметить, что у церкарий окраска на FMRFамид, как правило, наиболее интенсивная, по сравнению с таковой на серотонин. Представляется интересным отметить тот факт, что, несмотря на недостаточную морфологическую выраженность брюшной присоски у церкарий C. lingua, к области, где находится ее зачаток, уже подходят нервные волокна, содержащие исследуемые нейромедиаторы. У взрослых стадий трематод появляется иннервация протоков половой системы и ее конечных отделов. Полученные данные указывают на то, что исследуемые нейромедиаторные вещества принимают участие в регуляции мышечной активности стенки тела, прикрепительных органов и органов репродуктивной системы паразитов.
Анализ данных о положительной реакции на серотонин и нейропептид FMRFамид, обнаруженные в хвосте церкарий, а также в месте прикрепления хвоста к телу личинки, дает основание предположить, что исследуемые ней-рональные сигнальные вещества имеют важное значение в регуляции двигательной активности хвоста свободноживущей личинки трематод.
Работа поддержана грантом РФФИ - 08-04-00271а.
Литература
1. Скрябин К.И. Трематоды животных и человека. - 1952 . - Т. 6.
2. Толстенков О.О., Теренина Н.Б., Шалаева Н.М. и др. Организация мышечной системы и распределение NO-ергических и серотонинергических элементов у трематод Allocreadium isoporum Looss, 1894 (Allocreadiidae) и Paramphistomum cervi Zeder, 1790 (Paramphistomatidae) // Зоология беспозвоночных. - М., 2007. - Т. 4 (2). - С.139-149.
3. Шишов Б.А. Аминергические и холинергические элементы в нервной системе гельминтов // Тр. зоол. ин-та. - Санкт-Петербург, 1991. - Т. 241. - С. 112-137.
4. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies of antibody production. 1. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study for the hiperimmune rabbit // J. Exper. Med. - 1955. - V. 102. - Р. 49-60.
5. Halton D.W., Maule A.G. Flatworm nerve-muscle: structural and functional analysis // Can. J. Zool. - 2003. - V. 82. - Р. 316-333.
6. McKay D.M., Halton D.W., Johnston C.F. et al. Occurrence and distribution of putative neurotransmitters in the frog-lung parasite Haplometra cylindracea (Trematoda: Digenea) // Parasitol. Res. - 1990. -V. 76, № 6. - Р. 509-517.
7. Sebelova S., Stewart M., Mousley A. et al. The musculature and associated innervations of adult and intramolluscan stages of Echinostoma caproni (Tremato-da) visualized by confocal microscopy // Parasitol. Res. - 2004. - V. 93. - P. 196206.
8. Terenina N.B., Tolstenkov O.O., Fagerholm H.-P. et al. The spatial relationship between the musculature and the NADPH-diaphorase activity, 5-HT and FMRFamide immunoreactivities in redia, cercaria and adult Echinoparyphium aconiatum // Tissue and Cell. - 2006. - V. 38. - P. 151-157.
9. Tolstenkov O.O, Terenina N.B., Gustafsson M.K.S. et al. The pattern of serotonin and FMRFamide in cercaria from different taxonomic groups - a preliminary study // Acta Biologica Hungarica. - 2008. - V. 59 (Suppl.). - P. 221-225.
10. WahlbergM.H. The distribution of F-actin during the development of Diphyl-lobothrium dendriticum (Cestoda) // Cell and Tissue Research. - 1998. - V. 291. - Р. 561-570.
Nerve-muscle system of cercariae and adult of trematodes Cryptocotyle lingua и C. concavum (Heterophyidae)
N.B. Terenina, O.O. Tolstenkov, M.K.S. Gustafsson, V.V. Kuklin, M.M. Kuklina
Serotoninergic and neuropeptidergic components of the nervous system were examined in cercaria and adult Cryptocotyle lingua и C. concavum using immunocy-tochemical method and confocal scanning laser microscopy. TRITC-conjugated phalloidin was used to stain the musculature. The presence of serotonin- and neu-ropeptide (FMRFamid)-ergic components were revealed in central and peripheral nerve system of cercariae and adults. Localization of serotonin and neuropeptide-ergic nerves in close association with muscle fibers suggests the probable role of investigated neurotransmitters in the regulation of contraction activity of muscles of body wall, digestive and reproduction systems.
Keywords: trematodes, nervous system, neuromediators, serotonin, neuropeptides.
