CC BY
130
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _____________________________________2008, том 51, №8___________________________________
ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
УДК 541.127:661.183.123.2
З.К.Мухидинов, А.Ш.Штанчаев, А.С.Насриддинов, Д.Т.Бобокалонов, Х.И.Тешаев, академик АН Республики Таджикистан Д.Х.Халиков НЕРАСТВОРИМЫЕ КОМПЛЕКСЫ БЕЛКОВ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ С РАЗЛИЧНЫМИ ПЕКТИНАМИ
Взаимодействия между протеинами и полисахаридами могут привести к образованию комплексов или коацерватов, которые применяются во многих областях, включая микрокап-сулирование и иммобилизацию энзимов. Однако до сих пор функциональная роль протеиново-полисахаридных взаимодействий не полностью раскрыта. Протеины и полисахариды играют ключевую роль в формировании структуры и стабилизации пищевой системы. Протеины используют в качестве эмульгаторов, а полисахариды в качестве стабилизаторов. По данным Диккинсона (Dickinson) [1], устойчивость и текстура смесей биополимеров зависит не только от их функциональных свойств, а также от природы и силы взаимодействия протеина и полисахарида. В зависимости от силы взаимодействия комплексы могут быть растворимыми или в состоянии агрегированного фазового равновесия. Взаимное притяжение может возникать за счет электростатического, гидрофобного взаимодействия или водородных связей, которые в свою очередь приводят к комплексообразованию протеинов и полисахаридов. Результирующее влияние на комплексы оказывают энтропийные факторы - природа, структура и молекулярный вес биополимеров. Другие факторы имеют энтальпийный характер, их величина зависит от соотношения протеин/полисахарид, от природы и плотности зарядов биополимеров. Показатель рН и ионная сила также существенно влияют на электростатическое взаимодействие [2]. В исследованиях [3] отмечается, что комплексы P-Lg с пектином обладают медленной кинетикой связывания, что подтверждает существование двух стадий ком-плексообразования, переходя от молекулярного в агрегированное состояние. Первая стадия соответствует образованию растворимых комплексов - интраполимеров между молекулами. Вторая включает агрегирование этих интраполимерных комплексов с образованием нерастворимых комплексов - межполимеров (теория Тайнака) [3]. Проведенные исследования носят разрозненный характер и не охватывают особенности комплексообразования белков молочной сыворотки, а именно лактоглобулинов с различными пектинами.
В связи с этим в данной работе изучено образование нерастворимых комплексов пектинов, выделенных из разного растительного сырья (яблочные выжимки, корзинки подсолнечника, кожура и мякоть цитрусовых) с белками молочной сыворотки при рН ниже изо-электрической точки (рН 3.5), методами турбидиметрии, потенциометрии и кондуктометрии.
Готовили 0.25% водный раствор цитрусового пектина (ст. этерификации 38%) и 0.25% раствор белков молочной сыворотки, представляющего собой концентрат лактоглобу-
линов, полученного методом мембранной фильтрации, в ацетатном буфере (рН 3.50). Определенное количество 0.25% раствора белков молочной сыворотки помещали в стакан, добавляли при помешивании по 1 мл к 0.25% раствора пектина. Содержимое стакана выливали в ампулу, которую помещали в измерительную ячейку турбидиметра 2100AN IS (фирма HACH, USA) и измеряли мутность Т в НТУ при X 455 нм. Параллельно определяли рН на приборе (WTW GmbH Laboratory рН meter, inoLab pH Level 1, Germany) и удельную электропроводность растворов на приборе (WTW GmbH Laboratory conductivity meter inoLab conductmeter Level 1, Germany). Обработка полученных данных проводилась по методике [4]. 0.25% водный раствор пектина имел следующие характеристики: мутность 38.5 НТУ (единица мутности), рН З.бО, х-193.5 iiS/см. У 0.25% раствора белков молочной сыворотки в ацетатном буфере: Т0 бЗ.З НТУ, pH 3.77, х 3.73 mS/см. Данные турбидиметрического, потенциометрического и кондуктометрического титрований приведены в табл. 1, где Vo 30 мл -объем 0.25% раствора сывороточного белков, у - объемная доля 0.25 % цитрусового пектина, Т1 - мутность, обусловленная комплексом, Т2 - мутность с поправкой на разбавление раствором пектина.
Из табл. 1 следует, что в выбранном интервале рН происходит образование нерастворимого пектин-белкового комплекса, заряд которого уменьшается по данным удельной электропроводности.
Таблица 1
Результаты турбидиметрического, потенциометрического и кондуктометрического титрова-
ний 0.25% раствора сывороточных белков 0.25% раствором цитрусового пектина
V, мл у= V/(V+Vg) 1-у А у рН rnS/ст Т Tl= T-Tg T2= Tl/(l-у) А T2 АT2/Ау
1 G.G3 0.97 3.66 3.65 147 S3.7 S6.5
2 0.06 0.94 0.030 3.69 3.56 240 176.7 1SS.5 102.0 3372.5
3 G.G9 0.91 G.G2S 3.69 3.49 324 260.7 2S6.S 9S.3 3459.S
4 0.12 G.SS 0.027 3.69 3.41 395 331.7 375.9 S9.2 3334.5
5 0.14 G.S6 0.025 3.69 3.33 401 337.7 394.0 1S.1 716.2
6 0.17 G.S3 0.024 3.69 3.25 525 461.7 554.0 160.1 6722.4
7 0.19 G.S1 0.023 3.69 3.17 575 511.7 631.1 77.1 3421.3
S 0.21 0.79 0.021 3.69 3.11 626 562.7 712.S S1.7 3S27.G
9 0.23 0.77 0.020 3.69 3.03 649 5S5.7 761.4 4S.7 2403.6
1G 0.25 0.75 0.019 3.69 2.97 671 607.7 S1G.3 4S.9 2540.5
11 0.27 0.73 G.G1S 3.69 2.91 671 607.7 S3G.5 20.3 1107.4
12 0.29 0.71 0.017 3.69 2.S6 661 597.7 S36.S 6.3 359.1
13 0.30 0.70 0.017 3.69 2.S 650 5S6.7 S4G.9 4.2 250.2
14 0.32 G.6S 0.016 3.69 2.75 641 577.7 S47.3 6.4 400.9
15 0.33 0.67 0.015 3.69 2.69 635 571.7 S57.6 10.3 676.9
60S
1000 -| 8000
900 - 7000
800 - - д м—*
/\ ' 6000
700 - - \ уГ
600 - - - - 5000 >
500 - - у \ . - - 4000 §
400 - - ♦ ♦ . - 3000 <
300 - - р/ \ \—♦
/ \ 1 \ ' 2000
200 - - ШГ \ \
100 - - 1000
0 - —1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1 1*1 1— - 0
0.03 0.09 0.14 0.19 0.23 0.27 0.3 0.33 —■—Интегральная кривая ^- Дифференциальная кривая
Рис.1. Интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического титрования 0.25% раствора
белка молочной сыворотки 0.25% раствором пектина
На рис. 1 представлены интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического титрования в зависимости от объемной доли раствора пектина. Как видно из рис. 1, из интегральной кривой мутность пектин-белкового комплекса с ростом объемной доли раствора пектина увеличивается и достигает предела. Дифференциальная кривая показывает, что скорость образования комплекса вначале увеличивается, затем падает. В точке максимума соотношение белок/пектин соответствует мольному соотношение 44:1, то есть на 1 моль пектина приходится 44 моля лактоглобулинов.
Было изучено методом турбидиметрии обратное титрование 0.25% раствора цитрусового пектина 0.25% раствором белков молочной сыворотки. Для этого растворяли в дистиллированной воде белок молочной сыворотки, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. После этого раствор доводили до концентрации 0.25%.
Цитрусовый пектин растворяли в 1/15 М ацетатного буфера (рН 3.50), центрифугировали при вышеуказанных условиях. Концентрация пектина составила 0.25%. Прибавляя определенное количество 0.25% раствора белков молочной сыворотки к 0.25% раствору цитрусового пектина в ацетатном буфере, измеряли мутность на турбидиметре.
Данные турбидиметрического титрования 0.25% раствора цитрусового пектина 0.25% раствором белков молочной сыворотки приведены в табл. 2, где Vo - начальный объем 0.25% раствора цитрусового пектина, равный 25 мл, То - мутность 0.25% раствора цитрусового пектина, равная 41 НТУ, мутность 0.25% раствора белков молочной сыворотки 38.3 НТУ, у -объемная доля 0.25% раствора белков молочной сыворотки.
Таблица 2
Результаты турбидиметрического титрования 0.25% раствора цитрусового пектина
0.25% раствором белков молочной сыворотки
V, мл у=У/(У+У0) 1- У А у Т Т1=Т-Т0 Т2= Т]/(1 - у) А Т2 А Т2/А у
1 0.03 0.97 84 43.0 44.4
2 0.06 0.94 0.030 119 78.2 83.4 39.0 1288.9
3 0.09 0.91 0.028 142 100.8 110.9 27.5 966.8
4 0.12 0.88 0.027 162 120.8 136.9 26.0 973.4
5 0.14 0.86 0.025 183 141.5 165.1 28.2 1117.7
6 0.17 0.83 0.024 204 162.5 195.0 29.9 1256.5
7 0.19 0.81 0.023 217 176.0 217.1 22.1 979.8
8 0.21 0.79 0.021 240 199.4 252.6 35.5 1664.1
9 0.23 0.77 0.020 261 219.5 285.4 32.8 1619.2
10 0.25 0.75 0.019 282 240.7 320.9 35.6 1850.3
12 0.29 0.71 0.036 315 273.8 383.3 62.4 1746.8
14 0.32 0.68 0.032 346 304.7 446.9 63.6 1958.1
16 0.35 0.65 0.030 375 334.0 512.1 65.2 2200.8
18 0.38 0.63 0.027 400 359.3 574.9 62.7 2309.1
20 0.40 0.60 0.025 424 382.5 637.5 62.6 2504.8
22 0.42 0.58 0.023 462 420.5 728.9 91.4 3959.2
24 0.44 0.56 0.021 470 429.3 772.7 43.9 2053.3
26 0.46 0.54 0.020 500 458.8 856.4 83.7 4217.8
28 0.48 0.52 0.018 525 484.0 935.7 79.3 4293.1
30 0.50 0.50 0.017 552 511.0 1022.0 86.3 5003.5
32 0.52 0.48 0.016 581 539.8 1115.6 93.6 5802.4
34 0.53 0.47 0.015 613 572.0 1220.3 104.7 6922.8
36 0.55 0.45 0.014 638 597.1 1313.6 93.4 6572.1
38 0.56 0.44 0.013 659 618.0 1400.8 87.2 6521.1
40 0.571 0.429 0.013 697 633.2 1477.5 76.7 6082.2
¥
—■—Интегральная кривая —♦— Дифференциальная кривая
Рис.2. Интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического титрования 0.25% раствора
пектина 0.25% раствором белка молочной сыворотки.
На рис.2 приведены интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического титрования в зависимости от объемной доли раствора белков молочной сыворотки.
Хорошо видно, что по данным интегральной кривой мутность пектин-белкового комплекса по мере увеличения объемной доли раствора белков все время растет, не образуя предела, и превышает максимальное значение мутности в рис. 1. Дифференциальная кривая показывает, что скорость образования комплекса все время увеличивается.
Такое поведение зависимости мутности пектин-белкового комплекса от объемной доли раствора белков в рис.2 делает необходимым изучить характер этой зависимости при взаимодействии любых соотношений растворов белков молочной сыворотки и пектина. Для решения данной задачи нами приготовлены водный раствор белков молочной сыворотки и растворы пектинов, выделенных из корзинок подсолнечника, выжимок яблок, кожуры и мякоти цитрусовых.
Водный раствор белков молочной сыворотки после центрифугирования при 5000 об/мин в течение 30 мин доводили до концентрации 0.1%. В данной работе использовали подсолнечный пектин, полученный из корзинок подсолнечника при температуре гидролиза 850С в течение 60 мин при рН 1.2, имевший код - 1111 85-60-1.2 (содержание галактуроновой кислоты 65%, степень этерификация (СЭ) 47.17%, молекулярный вес Mw 95000, яблочный пектин - ЯП 85-60-1.2, полученный из выжимок красных яблок, выращенных в Муминабад-ском районе (содержание галактуроновой кислоты 68%, СЭ 52%, Mw 134000) и цитрусовый пектин (ЦП120-10-2.0-0.05, полученный из апельсиновых выжимок и очищенный через мембрану с размером пор 0.05мкм (содержание галактуроновой кислоты 74%, СЭ 82.76%, Mw 226000). Пектины (подсолнечный, яблочный и цитрусовый) растворяли в 1/15 М ацетатного буфера (рН 3.50), центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. Концентрация пектинов во всех случаях после центрифугирования составляла 0.1%.
Было проведено изучение комплексообразования при взаимодействии 0.1% раствора пектина с 0.1% раствором белков молочной сыворотки. Поскольку мутность пектин - белковых комплексов с ростом объемной доли раствора белков согласно рис. 2 все время увеличивается, не давая предела в отличие от рис. 1, их готовили, добавляя раствор белков молочной сыворотки в раствор пектина. Помещали 0.1% раствор пектина в ацетатном буфере (рН 3.50) в стаканчик, приливали при помешивании 0.1% белков молочной сыворотки.
Соотношение растворов бралось таким образом, чтобы общая концентрация полимеров была равна 0.1%. Содержимое стаканчика выливали в ампулу, которую помещали в тур-бидиметр и измеряли мутность в НТУ. Параллельно проводилось определение рН и х.
В табл. 3 приведены результаты изучения комплексообразования при взаимодействии
0.1% растворов пектинов с 0.1% раствором белков молочной сыворотки методами турбиди-метрии, потенциометрии и кондуктометрии.
Как видно из табл. 3, в узком интервале рН происходит образование нерастворимых пектин-белковых комплексов, заряд которых уменьшается по данным удельной электропроводности.
Таблица 3
Характеристики растворов подсолнечного (1), яблочного (2) и цитрусового пектинов (3), белков молочной сыворотки и комплексов на их основе
у* Т (НТУ) рН X, mS/cm
1 2 3 1 2 3
0 54.4 16.5 34.1 3.6 3.15 3.25 3.19
0.1 72.7 27 74.2 3.6 2.91 3.02 3.13
0.2 87.8 60.6 97.8 3.6 2.79 2.70 2.78
0.3 98.9 165 114.7 3.6 2.49 2.49 2.44
0.4 113.2 222 131.7 3.6 2.19 2.17 2.13
0.5 147.8 243.7 167.5 3.6 1.90 1.8 1.88
0.6 167.8 441.2 166.1 3.6 1.53 1.54 1.54
0.7 197.7 857.6 111 3.6 1.23 1.24 1.24
0.8 310.1 467.3 84.5 3.6 0.90 0.85 0.90
0.9 470.9 52 48.0 3.7 0.57 0.57 0.57
1 14.5 14.5 14.5 4.5 0.15 0.15 0.15
*у =У/(У+У0) - объемная доля раствора белков.
У
—□—подсолнечный —А—яблочный —х—цитрусовый
Рис.3. Зависимость мутности комплексов на основе белка молочной сыворотки
с различными пектинами от у.
На рис. 3 представлены кривые зависимости мутности комплексов на основе исследованных пектинов и белков молочной сыворотки в зависимости от у. Видно, что с ростом объемной доли раствора белков мутность плавно увеличивается, достигая предела при неболь-
ших значениях объемной доли белков (0.5) с цитрусовым пектином, а с яблочным пектином, достигая предела при у = 0.7 и в дальнейшем уменьшается. В случае с подсолнечным пектином возрастание выхода продолжается до больших значений объемной доли (0.9), затем падает. Такая закономерность хорошо согласуется со СЭ пектинов. Чем меньше СЭ, где имеется много свободных карбоксильных групп, тем больше требуется положительно заряженных белковых молекул для образования нерастворимого комплекса.
Сравнивая кривые, приведенные на рис. З, можно отметить, что наибольшая мутность и, соответственно, выход наблюдается у комплекса на основе яблочного пектина. Вторым по величине мутности (выходу) является комплекс на основе подсолнечного пектина. Это указывает на то, что при близких значениях СЭ яблочного и подсолнечного пектинов, мутность комплекса больше на основе того пектина, у которого выше молекулярный вес. В данном случае у яблочного пектина Mw выше, чем у подсолнечного пектина. Наименьшим значением мутности (выхода) обладает комплекс на основе цитрусового пектина. Низкие значения мутности в последнем случае можно объяснить высокой степенью этерификации цитрусового пектина. Указанные выше различия в структуре подсолнечного, яблочного и цитрусового пектинов оказывают влияние на особенности их взаимодействия с белком молочной сыворотки при образовании нерастворимых комплексов. Кроме того, необходимо отметить использование турбидиметрического метода как быстрого метода характеристики нерастворимых комплексов на основе пектина и различных белков [5].
Институт химии им. В.И.Никитина Поступило 02.07.2008 г.
АН Республики Таджикистан
ЛИТЕРАТУРА
1. Dickinson E. - Food Polysaccharides and their Applications. New-York, 1995, p. 501-515.
2. Girard M, Turgeon S.L., Gauthier S. - J. Agric. Food Chem., 2003, v. 51, p. 4450-4554.
3. Tainaka K.I. - Biopolymers, 19SG, v. 19, p. 12S9-129S.
4. Практикум по высокомолекулярным соединениям. М.: Химия, 1985, 224 с.
5. Штанчаев А.Ш. и др. - ДАН РТ, 2007, т. 50, №9-10, с. 748-752.
З.К.Мухидинов, A^^TaH4aeB, A.C.Насриддинов, Д.Т.Бобокалонов, Х.И.Тешаев,
Ч,.Х.Холи^ов
КОМПЛЕКСНОЙ X,AЛНAШABAНДAИ ПЕКТИН BA CAФЕДAИ ЗAРДOБИ
ШИР
Комплексной налнашавандаи пектиннои аз себ, офтобпараст ва афлесyн бо лактоглобулиннои сафедаи зардоби шир омухта шудааст. Бо усулнои турбидиметрй,
потентсиометрй ва кондуктометрй механизми носилшавии ин комплексно нишон дода шудааст. Микдори эфирнокй ва массаи молекулаи пектинно ба механизми комплексносилшавй вобастагии зич дорад.
Z.K.Muhidinov, A.Sh.Shtanchaev, A.S.Nasriddinov, D.T.Bobokalonov, Kh.I.Teshaev,
D.Kh.Khalikov
STUDY OF COMPLEX FORMATION BETWEEN DIFFERENT PECTINS AND WHEY LACTOGLOBULINS
This study describes the complex formation of different pectins obtained from apple pomace, sunflower head and citruses pectin at the low pH. The insoluble complexes formed were investigated using turbidimeric, potentiometric and conductometric methods. The nature of resulted complexes manly depends on the pectin methyl etheriflcation pattern and molecular weight.
