CC BY
12
УДК 543.544:543.25
НЕПРЕРЫВНЫЙ КОНТРОЛЬ рН ЭФФЛЮЕНТА В ХРОМАТОГРАФИИ С ГРАДИЕНТОМ рН
А. В. Иванов, А. Б. Тессман
(кафедра аналитической химии)
Предложена проточная ячейка простой конструкции для непрерывного контроля рН в потоке эффлюента. Ее можно использовать как в варианте хроматографии в системе низкого давления на препаративнык колонках, так и в варианте ВЭЖХ. Градиенты рН, полученные при не-прерытном контроле и при измерении в собранных фракциях эффлюента, совпадают. На профиле градиентов рН наблюдали все известные из литературы эффекты.
Среди основных параметров подвижной фазы в жидкостной хроматографии, влияющих на процесс разделения, следует выделить рН подвижной фазы. При условии постоянства рН при изократическом элюировании не всегда удается достичь полного разделения компонентов анализируемой пробы за приемлемое время. В таком случае используют изменение рН подвижной фазы в процессе хроматографического разделения по определенному правилу, т.е. элюирование с градиентом рН [1, 2]. Градиенты рН вызывают все больший интерес как в аналитической, так и в препаративной жидкостной хроматографии, поскольку наряду с улучшением разрешающей способности системы позволяют повысить нагрузочные характеристики хроматографической колонки [1-3]. В настоящее время градиенты рН используют для разделения высокомолекулярных белков или лекарственных (биоактивных) препаратов, низкомолекулярных аминокислот, некоторых азокра-сителей, органических многоосновных анионов и гумино-вых кислот на ионообменных сорбентах, а переходных металлов - на хелатообразующих сорбентах [2-5].
С одной стороны, градиенты рН можно отнести к концентрационным, поскольку в основе их лежит изменение концентрации протонов (или гидроксония) в подвижной фазе; с другой стороны, в отличие от обычных концентрационных градиентов концентрация протонов изменяется в пределах двух и более порядков [3, 4]. Градиент концентрации кислоты/основания и градиент рН не обязательно симбатны [3], особенно в том случае, когда функциональные группы ионообменного сорбента обладают буферной емкостью и влияют на рН эффлюента [2, 3]. Таким образом, необходим контроль рН эффлюента на выходе из колонки, особенно при оптимизации условий элюирования и разделения. В препаративной ионообменной хроматографии обычно собирают фракции эффлюен-та через равные промежутки времени и измеряют рН в собранных фракциях [5-7]. Этот способ контроля рН трудоемок, а для аналитической высокоэффективной хроматографии практически неприемлем. В ВЭЖХ для непре-
рывного контроля рН эффлюента применяют рН-метры, оборудованные проточными ячейками с комбинированными электродами [8]. Однако такие устройства достаточно дороги, что заставляет исследователей разрабатывать свои конструкции ячеек и электродов [9, 10].
Цель данной работы состояла в создании проточной ячейки для измерения рН эффлюента, пригодной как в препаративной, так и аналитической хроматографии.
Экспериментальная часть
Аппаратура. Работу выполняли в хроматографической системе низкого давления, состоящей из сосуда с краном для элюента (LKB-Bromma, Швеция), четыреххо-дового крана-дозатора, стеклянной хроматографической колонки 300x9 мм, заполненной сорбентом Dien-SiO2 на основе Силохрома С-120 (100-160 мкм) с привитыми группами диэтилентриамина, перистальтического насоса «Multiperpex-2115» (LKB-Bromma) или в системе ВЭЖХ, состоящей из насоса высокого давления «Beckman-114M» (США), петлевого дозатора «Rheodyne-7125» (США) с объемом петли 100 мкл, стальной колонки 250x4.6 мм, заполненной сорбентом Tetren-SiO2 на основе Силасорба Si-600 (7.5 мкм) с привитыми группами тетраэ-тиленпентамина. К выходу колонки присоединяли проточную ячейку с рабочим объемом 3-4 мл, соединенную с перистальтическим насосом «Varioperpex 2120» (LKB-Bromma). Для измерения рН использовали рН-метр «рН-340» (ЗИП, СССР). Выходной сигнал регистрировали на самописце (LKB-Bromma).
Реагенты. Использовали растворы Трис-HCl, уксусной и щавелевой кислот, приготовленные из препаратов квалификации «ч.д.а.» (Merck, Германия); буферный элюент «Polybuffer-74», приготовленный разбавлением препарата фирмы Pharmacia (Швеция).
Методика эксперимента. Для формирования градиента рН внутри хроматографической колонки использовали технику хроматофокусирования [2, 3]: колонку уравновешивали стартовым буферным раствором при рН, соот-
ветствующем начальной точке градиента (рН 7.5), а затем пропускали элюент при рН, соответствующем конечной точке градиента (рН 2.3-3.5). Ионную силу создавали добавлением №С1 в подвижные фазы.
Обсуждение результатов
Конструкция ячейки. Для более точного измерения рН в потоке объем ячейки должен быть минимальным, вместе с тем измерительная часть электродов должна покрываться измеряемым раствором. Электроды, прилагаемые к рН-метру «рН 340», непригодны для этой цели из-за достаточно большого размера. Поэтому мы использовали электроды от полевых иономеров (индикаторный стеклянный электрод ЭСЛ-15-11 и хлоридсеребряный электрод сравнения ЭВЛ-1М4), имеющие меньшие геометрические размеры, что позволило сократить рабочий объем ячейки до 3-4 мл. Электроды подключали к рН-метру через картридж. Для лучшего омывания электродов раствором подавали восходящий поток эффлюента в ячейку, откачивая избыток эффлюента с помощью перистальтического насоса (рис. 1). Электроды имеют малое время отклика, что особенно важно при измерении в потоке. Следующим этапом была проверка соответствия измерений рН эфф-люента, проведенных в потоке и в собранных фракциях.
Соответствие градиентов рН. С этой целью сравнивали градиенты рН, полученные в одинаковых условиях (таблица) при пропускании полиамфолитного буферного элюента через колонку, заполненную анионообменником Б1еп-8Ю2. Градиент рН, полученный на ленте самописца (рис. 2, кривая 1), практически идентичен ранее построенному по точкам при измерении рН в собранных фракциях эффлюента [7]. «Аномальное» начальное увеличение рН (выше рН стартового раствора) при высокой ионной силе элюента объясняется дополнительным протонирова-
Сорбенты и подвижные фазы, использованные для формирования градиента рН внутри колонки
Система Колонка Сорбент Стартовый раствор Элюент
I Стеклянная, 300x9 мм Dien-SiO^ 100-160 мкм 0.0125 М Трис-HCl, рН 7.5; ц = 0 1:16 Polybuffer-74, pH 3.5; ц = 0.2
II Стальная (ВЭЖХ), 250x4.6 мм Tetren- SiO2, 7.5 мкм 0.0125М Трис-HCl, рН 7.5; ц = 0 1:16 Polybuffer-74, pH 3.5; ц = 0.2
III Стеклянная, 300x9 мм Dien- SiO2, 100-160 мкм 0.025М Трис-HCl, рН 7,5; ц = 0,002 0.0125 М CH3COOH, pH 3.35; ц = 0.005
IV Стальная (ВЭЖХ), 250x4.6 мм Tetren-SiO^ 7.5 мкм 0.025М Трис-HCl, рН 7.5; ц = 0.002 0.0125 М CH3COOH, pH 3.35; ц = 0.005
V Стальная (ВЭЖХ), 250x4.6 мм Tetren- SiO2, 7.5 мкм 0.025М Трис-HCl, рН 7.5; ц = 0.002 0.005 М H2C2O4, pH 2.35; ц = 0.005
VI Стальная (ВЭЖХ), 250x4.6 мм Tetren-SiO^ 7.5 мкм 0.025М Трис-HCl, рН 7,5; ц = 0.002 0.002 М H2C2O4, pH 2.70; ц = 0.1
VII Стальная (ВЭЖХ), 250x4.6 мм Tetren-SiO^ 7.5 мкм 0.025М Трис-HCl, рН 7.5; ц = 0.002 0.002М H2C2O4, pH 2.70; ц = 0
Рис. 1. Схема проточной ячейки для измерения рН. ИЭ - измерительный электрод, ЭСр - электрод сравнения, К - картридж, земл. - заземление.
нием сорбента за счет сорбции протонов подвижных фаз, поскольку при этом изменяются константы протонирова-ния аминогрупп сорбента, и согласуется с теоретическими расчетами в рамках модели [11-13]. Автоматизация контроля рН позволила сократить время эксперимента на 45-60 мин, затрачиваемое на измерение рН в собранных фракциях эффлюента. Аналогичный вид градиента рН получили в системе ВЭЖХ (рис. 2, кривая 2) при пропускании полибуферного элюента через колонку с сорбентом Те1геп-8Ю2, который по кислотно-основным и ионообменным свойствам близок к Б1еп-8Ю2. Таким образом, рН, измеренное в потоке эффлюента, совпадает с рН в собранных фракциях. При измерении рН во фракциях эф-флюента некоторые точки могут выпасть из массива значений, что приводит к потере достаточно тонких эффектов при формировании внутреннего градиента рН в системе ВЭЖХ, таких, как образование ступеней на профиле градиента.
С этой целью получили градиенты рН при использовании растворов уксусной кислоты в качестве элюента (таб-
Рис. 2. Градиенты рН при пропускании полиамфолит-ного буферного элюента «Pofybuffer-74»: 1 - система I, 2 - система II (таблица)
Рис. 3. Градиенты рН при пропускании раствора уксусной кислоты: 1 - система III, 2 - система IV (таблица)
лица). В хроматографической системе низкого давления на профиле градиента рН наблюдали две ступени (рис. 3, кривая 1). Первая слабо выраженная ступень при незначительном начальном увеличении рН связана с различием в ионной силе стартового буферного раствора и элю-ента и дополнительным протонированием сорбента за счет протонов подвижной фазы, вторая - с сорбцией анионов элюента при увеличении степени протонирова-ния аминогрупп сорбента. Эти эффекты наблюдали также при измерении рН в собранных фракциях. Однако при переходе к варианту ВЭЖХ объем подвижной фазы, необходимый для формирования градиента, значительно сокращается, и при контроле рН в собранных фракциях (по 2 мл) начальное увеличение рН не было получено, вероятно, из-за потери точек. Измерения в потоке эффлюента позволили получить эффект «аномального» увеличения рН на начальной стадии градиента, связанный с различием в ионной силе подвижных фаз (рис. 3, кривая 2).
При использовании двухосновных кислот в качестве элюентов для формирования градиента рН профиль градиента должен быть более сглаженным, и вместе с тем на нем должна наблюдаться ступень, связанная с дополнительным протонированием сорбента при разнице ионной силы стартового раствора и элюента, и две ступени, обусловленные сорбцией анионов А2- и НА- двухоснов-
ной кислоты [12, 13]. Чем больше различие между рКа1 и рКа2 и ниже концентрация кислоты, тем более явно на профиле градиента рН проявляются две ступени, связанные с сорбцией анионов. Использование более концентрированных растворов кислот (0.005-0.02 М) не позволяет в большинстве случаев обнаружить эти ступени. Присутствие сильного электролита в элюенте приводит к растягиванию начального участка на профиле градиента в области рН 7.5-6.5 и к более резкому последующему падению рН [11-13]. Для проверки предсказанных на основе модели [11-13] эффектов изучили влияние концентрации щавелевой кислоты и ионной силы элюента на профиль градиента рН. Градиенты рН формировали в системе ВЭЖХ внутри колонки, заполеннной анионообменником Те1геп-8Ю2. При этом наблюдали все перечисленные эффекты (рис. 4). Так, при использовании в качестве элюента 0.005 М щавелевой кислоты (ц = 0.005) на начальном участке градиента наблюдали слабо выраженный подъем рН до 7.6-7.7, связанный с незначительным различием в ионной силе стартового раствора (0.025 М Трис-НС1, ц = 0.002) и элюента, и последующее резкое снижение рН от 7.4 до 2.7 в течение 12-15 мин (рис. 4, кривая 1). На профиле градиента рН, полученного при пропускании 0.002 М раствора щавелевой кислоты (ц = 0.1), получили существенное увеличение рН до 8.1-8.2 на начальном участке градиента, что связано с 50-кратным увеличением ионной силы элюента по отношению к стартовому раствору (рис. 4, кривая 2). В этом случае при смене стартового раствора на элюент меняется не только рН подвижной фазы, но и значения рК_ групп сорбента за счет увеличения ионной силы. Следовательно, начинается дополнительное протонирование аминогрупп сорбента протонами щавелевой кислоты, и рН подвижной фазы увеличивается за счет снижения концентрации протонов. Затем рН плавно снижается от 7.5 до 6.6, после чего на профиле градиента наблюдается достаточно резкий скачок до рН 4.6-4.5, близкий к рКа2 щавелевой кислоты. Вблизи рКа2 кислоты получили ступень на профиле градиента, а
Рис. 4. Градиенты рН при пропускании раствора щавелевой кислоты для систем: 1 - V, 2 - VI, 3 - VII (таблица)
затем снижение рН до 3.2. Очевидно, что ионная сила элюента влияет и на ступени, связанные с сорбцией анионов кислоты протонированными аминогруппами сорбента, поскольку в этом случае идет ионный обмен С1- и НА- и дополнительная сорбция С1- при увеличении степени протонирования анионообменника [11]. Так, при пропускании щавелевой кислоты той же концентрации, но в отсутствие посторонних электролитов, получили градиент рН с двумя явно выраженными ступенями, а на-
чального «аномального» увеличения рН не наблюдали (рис. 4, кривая 3). В областях рН 7.4-5.6 и 5.3-3.2 величина рН на колонке снижается линейно в течение 40 и 30 мин соответственно, а в области рН 5.6-5.3 практически выходит на плато. Такой градиент рН наиболее пригоден для группового разделения, например комплексов переходных металлов [4, 5] или цвиттер-ионных молекул типа белков [8, 9] с сильно различающимися константами устойчивости или изоэлектрическими точками соответственно.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Схунмакерс П. Оптимизация селективности в хроматографии.
М., 1989. 400 с.
2. Хроматофокусирование полибуфером на ПБИ (russian translation). Stockholm-Uppsala, 1981.
3. Jandera P., Churacek J. Gradient elution in column liquid
chromatography: theory and practice. Amsterdam-Oxford-New York-Tokyo, 1985.
4. Jones P., Nesterenko P.N. // J. Chromatogr. A. 1997. 789. P. 413.
5. Нестеренко П.Н., Иванов А.В. // Вестн. Моск. ун-та. Сер.2.
Химия. 1992. 33. С. 574.
6. Hutchens T.W., Li C.M., Besch P.K. // J.Chromatogr. 1986. 359.
P. 169.
7. Иванов А.В., Курочкина Е.В., Нестеренко П.Н. // ЖФХ. 1998.
72. №6. С. 1129.
8. Perkins R.V., Nau V.J., MаcParthland A. // Chromatogr. Review.
1987. 14. P. 13.
9. Murel A., Vilde S., Pank M. et al. // J.Chromatogr. 1986. 362.
P. 101.
10. Slais K. // J. Chromatogr. 1991. 540. P. 41.
11. Гармаш А.В., Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н. // ЖФХ. 1997. 71. №10. С. 1872.
12. Гармаш А.В., Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н. // ЖФХ. 1997. 71. №11. С. 2054.
13. Тессман А.Б., Иванов А.В., Курочкина Е.В. и др. // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж, 1998. 23.
С. 347.
Поступила в редакцию 28.05.98
