CC BY
31
DOI: 10.23868/202003005
немиелоаблативная трансплантация клеток костного мозга восстанавливает синтез дистрофина в мышцах мышей mdx
A.В. Соколова1, Н.А. Тимонина2, В.В. Кравцова2, И.И. Кривой2, Н.С. Скрипкина3, Е.В. Каминская1,
B.М. Михайлов1
1 Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
3 Городская клиническая больница № 31, Санкт-Петербург, Россия
NoNMYELoABLATWE bone marrow cells transplantation restores dystrophin synthesis in the muscles of mdx mice
A.V. Sokolova1, N.A. Timonina2, V.V. Kravtsova2, I.I. Krivoi2, N.S. Skripkina3, E.V. Kaminskaia1, V.M. Mikhailov1
11nstitute of Cytology Russian Academy of Science, St. Petersburg, Russia
2 Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia
3 City clinical hospital № 31, Staint Petersburg, Russia
e-mail: avsokolova@inbox.ru
Мышечная дистрофия Дюшенна — Х-сцепленная рецессивная мышечная дистрофия, связанная с мутациями в гене белка дистрофина. Наиболее распространенной лабораторной моделью мышечной дистрофии Дюшенна являются мыши mdx. Для поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx характерно отсутствие дистрофина, наличие центрально расположенных ядер в волокнах, а также высокий уровень обновления поперечнополосатых мышечных волокон. Кроме того, у мышей mdx наблюдается нарушение структуры нейромышечных соединений, выражающееся в распаде больших кластеров ацетилхолиновых рецепторов, имеющих форму ветвей, на мелкие кластеры, имеющие форму островков. Цель работы — оценить влияние неми-елоаблативной трансплантации клеток костного мозга мышей «дикого» типа C57BL/6 на синтез дистрофина и структуру ней-ромышечных соединений у мышей mdx.
Через 1 сутки после рентгеновского облучения в немие-лоблативной дозе 3 Гр мышам mdx внутривенно трансплантировали клетки костного мозга мышей C57BL/6. Через 2, 4, 6, 9 и 12 мес. после трансплантации на гистологических препаратах четырехглавой мышцы бедра и диафрагмы методом имммуногистохимии по окраске антителами к дистрофину определяли количество дистрофин-положительных мышечных волокон, погибших волокон и волокон, не имеющих центрально расположенных ядер. Нейромышечные соединения окрашивали тетраметилродамин-а-бунгаротоксином.
Было показано увеличение количества дистрофин-поло-жительных мышечных волокон в четырехглавой мышце бедра до 27,6±6,7% через 6 мес. после трансплантации и их снижение до 5,1±1,1% через 12 мес., а также увеличение количества поперечнополосатых мышечных волокон, не имеющих центрально расположенных ядер, и уменьшение количества погибших мышечных волокон. Аналогичные изменения были обнаружены в поперечнополосатых мышечных волокнах диафрагмы мышей mdx. Кроме того, после трансплантации клеток костного мозга увеличивалось количество нейромышечных соединений с нормальной структурой. Таким образом, неми-елоаблативная трансплантация клеток костного мозга мышей «дикого» типа может рассматриваться как один из способов лечения моногенного заболевания — мышечной дистрофии у мышей mdx.
ключевые слова: клеточная терапия, клетки костного мозга, поперечнополосатые мышечные волокна, дистрофин, мыши mdx, нейромышечные соединения.
Duchenne muscular dystrophy is an X-linked recessive muscular dystrophy associated with a mutations in the dystrophin protein gene. The most common laboratory model of Duchenne muscular dystrophy is mdx mice. The striated muscle fibers of mdx mice are characterized by the absence of dystrophin, the presence of centrally located nuclei, and the high level of renewal of the striated muscle fibers. In addition, mdx mice show a morphological aberrations at neuromuscular junctions, expressed in the breakdown of large clusters of acetylcholine receptors in the form of branches into small clusters in the form of islets. One approach to treating muscular dystrophy in mdx mice may be the nonmyeloablative transplantation of wild-type bone marrow cells after X-ray irradiation of mdx mice at a dose of 3 Gy. The aim of this work is to evaluate the effect of nonmyeloablative transplantation of wild-type bone marrow cells on dystrophin synthesis and the structure of neuromuscular junctions of mdx mice. Mdx mice were irradiated with X-rays at a dose of 3 Gy, after 24 hours was performed intravenous transplantation of bone marrow cells of C57BL/6 mice. The m. quariceps femoris and diaphragm were examined 2, 4, 6, 9, 12 months after transplantation. Muscle studies were performed using immunohisto-chemical methods of study (immunohistochemical staining with antibodies to dystrophin). The neuromuscular junctions were stained with tetramethylrodamine-a-bungarotoxin. After intravenous bone marrow cells transplantation, the part of dystrophin-positive muscle fibers in the muscle quadriceps femoris was shown to increase to a 27,6±6,7% 6 months after transplantation. After 12 months, the part of dystrophin-positive muscle fibers decreased to 5,1±1,1%. There was also an increase in the proportion of striated muscle fibers without centrally located nuclei and a decrease in the part of dead striated muscle fibers. Similar changes were found in the striated muscle fibers of the diaphragm of mdx mice. In addition, transplantation of bone marrow cells after irradiation at a dose of 3 Gy increases the part of neuromuscular junctions with normal structure. Thus, nonmyeloablative transplantation of wild-type bone marrow cells can be considered as one way to treat monogenic disease of striated muscle fibers muscular dystrophy of mdx mice.
Keywords: cell therapy, bone marrow cells, striated muscle fibers, dystrophin, mdx mice, neuromuscular junctions.
введение
Моногенные заболевания — это наследственные заболевания, вызываемые мутацией одного гена. В настоящее время описано более 5 тысяч моногенных заболеваний, из них более 800 характеризуются дегенерацией и дисфункцией скелетных мышц [1]. В частности, к моногенным заболеваниям относится мышечная дистрофия Дюшенна (МДД, ОМЮ, 0М1М#310200).
Х-сцепленная рецессивная МДД является одной из тяжелых по клиническим признакам и самой распространенной формой мышечной дистрофии, поражая одного из 3500-5000 новорожденных мальчиков. Клиническая манифестация обычно приходится на возраст 3-4 лет. У девочек клиническая картина зависит от особенностей инактивации одной из Х-хромосом в мышечных волокнах того или иного региона мышечной
ткани. При современных методах медикаментозной терапии средняя продолжительность жизни больных МДД не превышает 25 лет [2-5]. Пациенты умирают от дыхательной недостаточности и кардиомиопатии (дилатационной). Возникновение МДД связано с мутациями в гене, кодирующем белок дистрофин [6]. Показано, что ДНК 69% пациентов с МДД имеют крупные делеции, 11% — крупные дупликации, 10% — нонсенс-мутации, 7% — миссенс-мутации или инделы, а 3% — интронные или другие мутации [7]. Наиболее широко используемой лабораторной моделью МДД являются мыши тс1х с точечной мутацией в Х-хромосоме, в результате которой блокируется синтез дистрофина [8, 9]. Для мышц мышей тСх характерен высокий уровень гибели поперечнополосатых мышечных волокон (ППМВ), и, соответственно, регенерации. В скелетных мышцах мышей тсх преобладают ППМВ с центрально расположенными ядрами. Кроме того, структура нейромышечных соединений у мышей тСх также нарушена по сравнению со структурой нейромышечных соединений у мышей «дикого» типа, что выражается в распаде больших кластеров ацетил-холиновых рецепторов на более мелкие и приобретении ими формы отдельных островков [10-13].
Для лечения МДД было предложено несколько стратегий, к которым относятся фармакологические средства, генная терапия, клеточная терапия и сочетание методов генной и клеточной терапии. Однако на сегодняшний день, ни один из предложенных подходов не приводит к полной коррекции МДД. В экспериментах на животных и в клинических исследованиях не удается добиться синтеза дистрофина в течение длительного времени, а для поддержания терапевтического эффекта необходимо, чтобы дистрофин в мышцах синтезировался пожизненно.
Клеточная терапия с применением различных типов клеток, в том числе стволовых клеток (СК), является одним из многообещающих методов, которые смогут увеличить продолжительность жизни больных МДД и другими моногенными заболеваниями [14, 15]. В 2019 г. исполнилось 30 лет первой экспериментальной трансплантации миобластов мышам тСх [16]. Однако после трансплантации миобласты не мигрировали в мышцах и быстро погибали [16]. В связи с этим была предпринята попытка трансплантации клеток-химер здоровых миобластов человека и миобластов больных МДД. Через 90 сут. после пересадки мышам тСх/эаС клеток-химер, уровень синтеза дистрофина достигал 23%, что, по мнению авторов, свидетельствует о допустимости использования химерных клеточных конструкций для пересадки больным с МДД [17].
Кроме того, исследуются возможности применения для трансплантации СК или клеток-предшественниц различного происхождения, которые способны дифференцироваться в миогенном направлении [18-25], введенных внутримышечно (местная трансплантация), внутривенно или внутриартериально. В связи с тем, что при МДД поражаются все мышцы, более перспективными, вероятно, будут внутривенные или внутриартериальные трансплантации СК.
Для клеточной терапии рассматриваются также клетки костного мозга (ККМ) — источник клеток-предшественниц для различных тканей [26-34], в том числе и мышц [35].
Во многих работах было показано, что при замене костного мозга мышей тСх на костный мозг мышей «дикого» типа после общего рентгеновского облучения в летальных дозах 5, 7, 9 или 11 Гр синтез дистрофина в мышцах не восстанавливался, несмотря на присутствие в мышечных волокнах ядер клеток донора [18,
35, 36-38]. Торможение синтеза дистрофина в ППМВ мышей mdx после рентгеновского облучения в дозе 5 Гр и более с последующей трансплантацией ККМ можно объяснить остановкой экспрессии гена дистрофина в ядрах клеток костного мозга мышей-доноров «дикого» типа, проникших в поврежденную рентгеновским облучением саркоплазму мышей mdx [39, 40]. Это обстоятельство заставило нас обратиться к немие-лоаблативной трансплантации ККМ, используемой при клеточной терапии других моногенных заболеваний, таких как серповидно-клеточная анемия и талассемия [41, 42]. Немиелоаблативная трансплантация производится после облучения в дозах, не вызывающих полной миелосупрессии.
Цель работы состояла в изучении влияния на синтез дистрофина и структуру нейромышечных соединений внутривенной трансплантации клеток костного мозга мышей C57BL/6 мышам mdx после их облучения в немиелоблативной дозе 3 Гр.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Исследование по изучению влияния на синтез дистрофина трансплантации ККМ самцов мышей «дикого» типа линии C57BL/6 (государственный питомник Рапполово, Санкт-Петербург], было выполнено на мутантных самцах мышей mdx (n=29), любезно подаренных проф. Партриджем (T.A. Partridge, Hammersmith Hospital, Великобритания]. Мышей содержали в виварии Института цитологии РАН на обычном питании и при стандартном световом режиме. Все необходимые манипуляции с животными проводили в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/ ЕС по экспериментам на животных и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Института цитологии РАН (гарантийный идентификационный номер F18-00380).
Мышей линии C57BL/6 выводили из эксперимента с помощью эфирного наркоза, выделяли бедренные и большие берцовые кости, вымывали костный мозг из костей раствором Дальбекко без ионов Са2+ и Mg2+ (DPBS Са-, Mg-) (Биолот, Россия] и доводили его до состояния однородной клеточной суспензии, пропуская через иглу шприца.
Для получения радиационных химер мышей mdx в возрасте 2 мес. облучали на рентгеновском аппарате РУМ-17 (производство СССР] (U=200 кВ, 1=13 мА; фильтр 0,5 мм Cu + 1 мм Al, мощность 45 Р/мин.) в дозе 3 Гр.
Мышам mdx через 1 сут. после облучения в яремную вену вводили ККМ в объеме 0,2 мл (15-20х106 клеток) под эфирным наркозом. В течение 1 мес. после трансплантации в воду для питья добавляли по 125 мг стрептомицина и бензпенициллина (Красфарма, Россия) на 250 мл воды. Через 2 (n=4), 4 (n=3), 6 (n=3), 9 (n=6) и 12 (n=8) мес. после трансплантации животных выводили из эксперимента с помощью эфирного наркоза, готовили гистологические препараты из четырехглавой мышцы бедра и диафрагмы для определения количества дистрофин-положительных ППМВ (Д+-ППМВ), погибших ППМВ и ППМВ, не имеющих центрально расположенных ядер. В качестве контроля использовали мышей mdx, которым ККМ не трансплантировали (n=3). Для исследования структуры нейромышечных соединений через 2 (n=3), 4 (n=3), 6 (n=3), 9 (n=6) и 12 (n=5) мес. после трансплантации ККМ животных выводили из эксперимента с помощью эфирного наркоза и извлекали диафрагму
Таблица 1. Влияние рентгеновского облучения в дозе 3 Гр и трансплантации клеток костного мозга мышей С57В1_/6 на поперечнополосатые мышечные волокна четырехглавой мышцы бедра мышей тСх
Время после трансплантации ККМ, мес. Количество Д+-ППМВ, % Количество погибших ППМВ, % Количество ЦЯ-ППМВ, %
0, контроль 1,1±0,4 (3) 2,2±0,6 (3) 10,5±1,0 (3)
2 4,1±0,9 (3) 1,4±0,3 (4) 16,1±1,7 (4)*
4 12,4±3,9 (3)* 0,9±0,2 (3) 20,6±1,3 (3)*
6 27,6±6,7 (5)* 0,7±0,1 (5)* 22,6±1,9 (5)*
9 7,4±1,5 (6)* 1,9±0,4 (6) 17,5±1,4 (6)*
12 5,1±1,1 (5)* 0,5±0,1 (5)* 10,7±1,2 (5)
Примечания: Д+-ППМВ — дистрофин-положительные поперечнополосатые мышечные волокна; ЦЯ--ППМВ — поперечнополосатые мышечные волокна без центрально расположенных ядер; в скобках указано количество животных в группе; *р<0,05 — по сравнению с животными контрольной группы
для определения доли нейромышечных соединений с определенной структурой. В качестве контроля использовали мышей mdx, которым ККМ не трансплантировали, в возрасте 4 (n=3), 6 (n=3), 8 (n=3) и старше 12 (n=3) мес.
Иммуногистохимическое исследование
Поперечные срезы четырехглавых мышц бедра толщиной 1 0 мкм получали на криостате Bright Co Ltd (Великобритания) после предварительного охлаждения мышц в жидком азоте. Подсушенные срезы фиксировали в течение 1 мин в смеси этанола и метанола (1:1) при температуре -20°С. Готовые срезы хранили при -20°С. Для выявления дистрофина срезы заливали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА, Sigma, США), инкубировали 30 мин., отмывали в течение 5 мин. в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ, Биолот, Россия), добавляли поликлональные кроличьи антитела к дистрофину в разведении 1:100 (Abcam, США) и инкубировали при 4°С в течение 1 ночи. После 3-кратной отмывки по 5 мин. в ФСБ срезы заливали раствором 0,03% Н2О2, инкубировали 30 мин., промывали в ФСБ 3 раза по 5 мин. и добавляли реагенты Avidin/Biotin Bloking Kit (Zymed Laboratories Inc., Invitrogen, США) для уменьшения неспецифического связывания стрепто-авидина с эндогенным биотином согласно инструкции производителя. Затем срезы отмывали 3 раза по 5 мин. в ФСБ и добавляли вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные биотином в разведении 1:100 (Sigma, США), инкубировали 1 ч, промывали в ФСБ 3 раза по 5 мин., добавляли стрептоавидин, конъюгированный с пероксидазой, в разведении 1:200 (Sigma, С1ША), инкубировали 30 мин., промывали в ФСБ 3 раза по 5 мин., добавляли диаминобензидин (10 мг диаминобензидина растворяли в 10 мл ФСБ и смешивали с 0,5 мл 0,1% раствора Н2О2 в ФСБ) на 5 мин. и промывали в проточной воде. При слабой реакции срезы дополнительно инкубировали с диаминобензидином с ацетатом кобальта в течение 5 мин. и отмывали в проточной воде [43]. Ядра клеток докрашивали красителем Гимза. Затем срезы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, проводили через 3 порции ксилола (в последней порции оставляли не менее чем на 3 ч.) и заключали в канадский бальзам. Контролем неспецифического связывания вторичных антител служили срезы, в которые вместо антител заливали ФСБ.
На срезах, окрашенных антителами к дистрофину, в прямой мышце бедра (одна из головок четырехглавой
мышцы бедра) на световом микроскопе Carl Zeiss (Германия) подсчитывали количество Д+-ППМВ, общее количество ППМВ и рассчитывали процентное содержание Д+-ППМВ в мышечном волокне. Дифференцировку ППМВ — переход мышечной трубочки в мышечный симпласт, оценивали по процентному содержанию ППМВ, не имеющих центрально расположенных ядер. Процентное содержание ППМВ без центральных ядер и процентное содержание погибших ППМВ определяли по общепринятой методике на гистологических срезах.
Исследование структуры
нейромышечных соединений
У экспериментальных животных выделяли диафрагму, помещали её целиком в 5% формалин на 1 ч при +4°С, переносили в 0,5% формалин, инкубировали в течение 1 ночи при +4°С, отмывали в течение 30 мин. в ФСБ и добавляли тетраметилродамин-а-бунгаротоксин (TMR-a-BTX) (Biotium, США) в концентрации 1 мкг/мл, который специфически связывается с ацетилхолиновыми рецепторами, на 1 ч, промывали в ФСБ 3 раза по 5 мин. и заключали в среду Флуоромаунт Г (Fluoromount-G, SouthernBiotech, США). Приготовленные препараты анализировали на конфокальном микроскопе Leica TCS SL (Leica Microsystems, Германия). На полученных снимках отдельных нейромышечных соединений оценивали их структуру: определяли какую форму имеют кластеры ацетилхолиновых рецепторов, составляющие данное нейромышечное соединение, протяженные ветви или отдельные островки.
Статистический анализ
Статистическую обработку материала выполняли в программе Microsoft Office Excel 20l6. Данные представлены в виде значений среднего ± стандартная ошибка среднего. Статистическую значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты
В работе было показано, что у облученных мышей mdx через 6 мес. после внутривенной трансплантации ККМ увеличилось количество Д+-ППМВ в срезах мышц четырехглавой мышцы бедра до 27,6±6,7% (p<0,05) (табл. 1), уменьшилось количество погибших ППМВ и увеличилось количество ППМВ без центрально расположенных ядер
• /
> ; * Л - V" - \
• '
■ V'
•г : ■ ' ■ *
■ Ч'
* *
-щ. * "
.-1.
V _
у;
I-
•V
'{ \ ' 1 ' /ч/1 'г ' ' УГЛ~ /Г' ' V" ',
ж ¡вЖш
* I \ < Я УЛ-А Л^ ) • М ЛГ г
рис. 1. Четырехглавая мышца бедра мыши (поперечные срезы): А — мыши «дикого» типа С57В1_/6; Б — мыши тСх (контроль); В — мыши тСх через 6 мес. после облучения в дозе 3 Гр и трансплантации клеток костного мозга; иммуногистохимическая реакция с антителами к дистрофину, вторичные антитела мечены пероксидазой (субмесбранный паттерн окрашивания темно-коричневым цветом). Докраска красителем Гимза. Ув. х200
*
у' х/ "ч V ■ • V ^Ьш^^уу у '-"Л 'Аш-зМ^
■V-
В
таблица 2. Влияние рентгеновского облучения в дозе 3 Гр и трансплантации клеток костного мозга мышей С57В_/6 на поперечнополосатые мышечные волокна диафрагмы мышей тс(х
Время после трансплантации ККМ, мес. Количество Д+-ППМВ, % Количество погибших ППМВ, % Количество ЦЯ-ППМВ, %
0, контроль (3) 0,28±0,28 6,4±2,5 8,4±0,6
4-5 (4) 12,0±3,2* 6,3±1,2 30,4±1,5*
9 (3) 2,6±0,4* 11,5±3,8 16,7±3,6
12 (8) 1,5±0,5 6,8±1,6 15,96±1,9
Примечания: Д+-ППМВ — дистрофин-положительные поперечнополосатые мышечные волокна; ЦЯ--ППМВ — поперечнополосатые мышечные волокна без центрально расположенных ядер; в скобках указано количество животных в группе; *р<0,05 - по сравнению с животными контрольной группы
по сравнению с мышами тСх контрольной группы (табл. 1, рис. 1). Через 9 мес. после трансплантации количество Д+-ППМВ в срезах мышц четырехглавой мышцы бедра уменьшилось до 7,4±1,5%, а через 12 мес. — до 5,1±1,1% (табл. 1). Эти показатели превышают количество Д+-ППМВ у животных контрольной группы (р<0,05), но меньше количества Д+-ППМВ, выявленных через 6 мес. после трансплантации. Количество погибших ППМВ возрастало с 0,7±0,1% (через 6 мес. после трансплантации) до 2,4±0,4% (через 9 мес. после трансплантации) (табл. 1). Аналогичную картину наблюдали на препаратах диафрагмы мышей-химер тСх (табл. 2).
Изучение динамики изменения количества Д+-ППМВ в диафрагме необходимо для выявления корреляции между накоплением дистрофина в ППМВ
и восстановлением структуры нейромышечных соединений у мышей тСх. Количество Д+-ППМВ в диафрагме мышей-химер тСх увеличивалось с 0,28±0,28% (контроль тСх) до 12,0±3,2% через 4 мес. после трансплантации (р<0,05), затем уменьшалось и через 12 мес. составляло 1,5±0,5%. При этом, так же как и в четырехглавой мышце бедра, в диафрагме количество погибших ППМВ увеличивалось через 9 мес. после трансплантации ККМ (табл. 2).
В литературе описано, что у мышей тСх структура нейромышечных соединений нарушена в значительной степени по сравнению с мышами «дикого» типа С57В_/6 [44]. Нами также было показано, что в зрелых нейромышечных соединениях мышей «дикого» типа ацетилхолиновые рецепторы организованы в структуру,
рис. 2. Кластеры ацетилхолиновых рецепторов в мышечной ткани диафрагмы мыши: А — мыши «дикого» типа С57В_/6 — нейромышечные соединения состоят из кластеров ацетилхолиновых рецепторов, имеющих форму ветвей; Б — мыши тСх (контроль) — нейромышечные соединения состоят из кластеров ацетилхолиновых рецепторов, имеющих форму отдельных островков; В — мыши тСх через 6 мес. после облучения в дозе 3 Гр и трансплантации клеток костного мозга — нейромышечные соединения, содержащие кластеры ацетилхолиновых рецепторов, имеющих форму ветвей (1), нейромышечные соединения, состоящие из кластеров ацетилхолиновых рецепторов, имеющих форму отдельных островков (2). Окраска тетраметилродамин-а-бунгаротоксином. Конфокальная микроскопия. Масштабный отрезок: 25 мкм
напоминающую крендель, которая содержит вытянутые равномерно флуоресцирующие ветви, формирующие непрерывные каналы, простирающиеся в нескольких направлениях вдоль мышечного волокна (рис. 2А), а у мышей тСх большие кластеры ацетилхолиновых рецепторов распадались на более мелкие и приобретали форму отдельных островков, у которых периферическая часть интенсивно окрашена, а центральная часть темная [13] (рис. 2Б), что подтверждает литературные данные [44]. В наших предыдущих работах было доказано, что структура и функции нейромышечных соединений у мышей тСх через 4 мес. после трансплантации ККМ улучшаются [45-48]. В настоящем исследовании было выявлено, что через 6 мес. после трансплантации ККМ в диафрагме увеличилось количество нейромышеч-ных соединений с нормальной структурой, в которых кластеры ацетилхолиновых рецепторов распределены в виде ветвей, и данный эффект сохранялся и через 9, и через 12 мес. после трансплантации (табл. 3).
Таким образом, замена костного мозга у мышей-мутантов тСх на костный мозг мышей «дикого» типа после облучения в дозе 3 Гр приводила к нарастанию синтеза дистрофина и достигала максимальных значений
(27,6±6,7%) через 6 мес. после трансплантации. На более поздних сроках количество Д+-ППМВ только снижалось.
Структура нейромышечных соединений ППМВ диафрагмы у радиационных мышей-химер тСх восстанавливалась: увеличивалось количество нейромышечных соединений с нормальной структурой, образованных кластерами ацетилхолиновых рецепторов, имеющих форму ветвей, до 49,1±2,1% через 6 мес. после трансплантации (р<0,05). Восстановление структуры нейро-мышечных соединений сохранялось через 6 и 9 мес. после трансплантации ККМ и через 1 2 мес. их количество превышало количество нейромышечных соединений с нормальной структурой у мышей тСх контрольной группы (р<0,05).
обсуждение
Переход на немиелоаблативную трансплантацию ККМ объясняется неэффективностью трансплантации ККМ мышам тСх после рентгеновского облучения в дозе 5, 7 и 11 Гр, так как трансплантированные ККМ, оказавшись в саркоплазме ППМВ облученных мутантных мышей, неспособны активировать транскрипцию гена
таблица 3. Характеристика структуры нейромышечных соединений у мышей тСх контрольных групп и у мышей тСх экспериментальных групп после рентгеновского облучения в дозе 3 Гр и трансплантации клеток костного мозга мышей С57В_/6
Доля нейромышечных соединений Группы животных с определенной структурой
Ветви, % Диски, % Островки, %
Мыши тСх (контроль, возраст 4 мес.) (3) 14,1±3,2 10,2±1,0 75,8±3,1
Мыши-химеры тСх (2 мес. после трансплантации, возраст 4 мес.) (3) 23,5±4,1 6,7±2,5 69,8±1,6
Мыши тСх (контроль, возраст 6 мес.) (3) 9,4±1,6 3,3±0,9 87,3±2,5
Мыши-химеры тСх (4 мес. после трансплантации, возраст 6 мес.) (3) 42,6±5,7* 3,7±1,0 53,7±6,0*
Мыши тСх (контроль, возраст 8 мес.) (3) 8,4±2,7 0,7±0,7 90,9±2,2
Мыши-химеры тСх (6 мес. после трансплантации, возраст 8 мес.) (3) 49,1±2,1* 2,6±0,5 48,2±2,3*
Мыши-химеры тСх (9 мес. после трансплантации, возраст 11 мес.) (6) 48,4±5,1* 0 51,6±5,1*
Мыши тСх (контроль, возраст >12 мес.) (3) 5,9±1,6 0 94,0±1,6
Мыши-химеры тСх (12 мес. после трансплантации, возраст 14 мес.) (5) 37,4±2,7* 1,4±0,6 61,2±2,7*
Примечания: доза облучения мышей тСх для получения мышей-химер 3 Гр; в скобках указано количество животных в группе;
*р<0,05 — по сравнению с животными контрольной группы того же возраста.
дистрофина [38, 40]. Доза рентгеновского облучения при немиелоаблативной трансплантации ККМ колеблется в пределах от 0,5 до 3 Гр. Возникший химеризм после трансплантации ККМ облученным мышам тСх подавляет иммунную реакцию клеток донора и реципиента. Наибольший эффект был достигнут после сублетального облучения в дозе 2,7 Гр, способствовавшего долговременному состоянию донорского химеризма в костном мозге у реципиента [49].
Представленные результаты показали, что синтез дистрофина в четырехглавой мышце бедра и в диафрагме достоверно увеличивался через 4 мес. после внутривенной трансплантации ККМ мышам тСх (12,4±3,9%, р<0,05), достигал максимума через 6 мес. (27,6±6,7%, р<0,05) и уменьшался к 12 мес. после трансплантации (5,1±1,1%, р<0,05), но все равно оставался выше контрольного уровня (1,1±0,4%). Мыши тСх в условиях вивария ИНЦ РАН живут не больше 2 лет. Таким образом, можно считать, что временной интервал синтеза дистрофина в наших опытах достигал 50% от жизненного цикла мышей тСх.
Для оценки эффективности синтеза дистрофина у мышей тСх после немиелоаблативной трансплантации ККМ ранее нами были изучены структурные и электрофизиологические свойства нейромышечных соединений [45-48]. Нарушение структуры нейромышечных соединений у мышей тСх ряд исследователей объясняют постоянными циклами дегенерации-регенерации [1 1 , 12, 50], а не отсутствием дистрофина. Было обнаружено, что в экстраокулярных мышцах мышей тСх (прямых и косых), в которых нет дегенерации мышечных волокон, несмотря на отсутствие дистрофина, нейромышечные соединения сохраняют нормальную структуру [1 2]. Однако, есть данные, которые доказывают, что дистро-фин непосредственно вовлечен в организацию больших агрегатов ацетилхолиновых рецепторов из маленьких кластеров при регенерации мышцы, хотя он не требуется для их первоначальной кластеризации [10], а значит можно предположить, что именно отсутствие дистрофина вызывает нарушение структуры нейромышечных соединений у мышей тСх. Эта гипотеза была проверена в экспериментах, проведенных на трансгенных мышах тСх и Ско, в мышцах которых синтезировались различные
усеченные молекулы дистрофина. Было показано, что некоторые усеченные формы дистрофина, например микродистрофинЛИ4-РЕ3, не могут устранить фрагментацию синапсов в мышцах конечностей, несмотря на то, что они предотвращают дегенерацию мышц [51, 52]. Также было выявлено, что, несмотря на большую степень дегенерации мышц у мышей dko, степень фрагментации кластеров ацетилхолиновых рецепторов не различалась у мышах mdx и dko, следовательно, нет прямой корреляции между фрагментацией кластеров ацетилхолиновых рецепторов и мышечной дегенерацией [53].
Наблюдаемое нами в предыдущих исследованиях восстановление электрофизиологических свойств и частичное восстановление структуры нейромышечных соединений в первые 6 мес. после трансплантации ККМ совпадало с увеличением количества Д+-ППМВ, что свидетельствует о связи структуры и функции нейромышечных синапсов c синтезом дистрофина в мышечной волокнах [13, 45, 46, 48]. Снижение синтеза дистрофина в интервале 6-12 мес. после трансплантации ККМ несомненно связано с усилением иммунологического конфликта между клетками мышей-доноров C57BL/6 и клетками мышей-реципиентов, мышами mdx, мутантами из колонии мышей C57BL/10. Аллогенные линии мышей С57BL/6 и C57BL/10 отличаются по цитогенетическим и иммунохимическим параметрам [54, 55].
В настоящее время исследователи пытаются оценить уровень синтеза дистрофина, необходимый для сохранения структуры и улучшения функциональной активности ППМВ при клеточной терапии. После внутри-артериальной трансплантации дистрофин-дефицитным собакам породы Золотистый ретривер (golden retriever) мезоангиобластов количество Д+-ППМВ первоначально увеличивалось до 80%, однако в течение года после трансплантации количество Д+-ППМВ уменьшалось и собаки погибали [56]. В экспериментах на мышах mdx/utr-/- было показано, что при уровне дистрофина в мышечном волокне меньше 4% увеличивалась выживаемость и улучшалась двигательная функция у этих животных, а при уровне дистрофина больше 4% уменьшалась и выраженность гистопатологических признаков, и сохранялась экспрессия антивоспалительных генов. Авторы допускают, что уровень синтеза дистрофина,
необходимый для увеличения продолжительности жизни пациентов с МДД, может быть ниже уровня синтеза дистрофина, необходимого для полной защиты ППМВ от повреждений [57]. По нашим данным за первые полгода после трансплантации количество Д+-ППМВ возрастало с 1,1±0,4% до 27,6±6,7% (p<0,05), улучшалась выживаемость ППМВ, электрофизиологические свойства ППМВ восстанавливались до нормального уровня [45, 48] и нормальная структура нейромышеч-ных соединений наблюдалась у 49,1 ±2,1% синапсов. Во второй половине эксперимента на фоне уменьшения синтеза дистрофина до 5,1 ±1 ,1 % количество нейромышечных соединений с нормальной структурой сохранялось у 37,4±2,7% синапсов (p<0,05), и количества погибших ППМВ не увеличивалось. Этот результат подтверждает вывод M. van Putten с соавт. (2013) о том, что низкий уровень синтеза дистрофина (4-5%) достаточен для выживаемости ППМВ [57]. В опытах на мышах mdx-Xist^s, имеющих врожденный низкий уровень дис-трофина, было обнаружено, что нормальная структура нейромышечных соединений сохраняется при наличии дистрофина у 19-50% ППМВ [58]. По расчетам D. Wells с соавт. (2019) эффективная терапия МДД может быть достигнута при уровне синтеза дистрофина 20% [59]. Можно ожидать, что включение в схему эксперимента иммуносупрессорной терапии повысит эффективность клеточной терапии у мышей mdx на фоне немиелоабла-тивной трансплантации ККМ.
Результаты нашего исследования показали, что восстановление структуры нейромышечных соединений у мышей-химер mdx сохраняется на сроках 9 и 12 мес. после трансплантации в период снижения количества Д+-ППМВ. По-видимому, восстановление структуры
ЛИТЕРАТУРА:
1. Min Y.L., Bassel-Duby R., Olson E.N. CRISPR Correction of Duchenne Muscular Dystrophy. Ann. Rev. Med. 2019; 70: 239-55.
2. Collins C.A., Morgan J.E. Duchenne's muscular dystrophy: animal models used to investigate pathogenesis and develop therapeutic strategies. Int. J. Exp. Pathol. 2003; 84(4): 165-72.
3. Dalkilic I., Kunkel L.M. Muscular dystrophies: genes to pathogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 2003; 13(3): 231-8.
4. Otto A., Coolins-Hooper H., Patel K. The origin, molecurlar regulation and therapeutic potencial of myogenic stem cell populations. J. of Anatomy 2009; 215: 477-97.
5. Negroni E., Gidaro T., Bigot A. et al. Stem cells and muscle diseases: advances in cell therapy strategies. J. Neuropathology and Applied Neurobiology 2015; 41: 270-87.
6. Hoffman E.P., Brown R.H. Jr., Kunkel L.M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 1987; 51(6): 919-28.
7. Зайнитдинова М.И., Смирнихина С.А., Лавров А.В. и др. Генно-терапевтические подходы к лечению миодистрофии Дюшенна. Гены & Клетки 2019; XIV(4): 6-18. [Zaynitdinova M.I., Smirnikhina S.A., Lavrov A.V. et al. Gene therapy approaches to the Duchenne muscular dystrophy theatment. Genes & Cells 2019; XIV(4): 6-18].
8. Bulfield G., Siller W.G., Wight P.A. et al. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. PNAS USA 1984; 81(4): 1189-92.
9. Sicinski P., Geng Y., Ryder-Cook A.S. et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science 1989; 244(4912): 1578-80.
10. Kong J., Anderson J.E. Dystrophin is required for organizing large acetylcholine receptor aggregates. Brain Res. 1999; 839(2): 298-304.
11. Minatel E., Neto H.S., Marques M.J. Acetylcholine receptors and neuronal nitric oxide synthase distribution at the neuromuscular junction of regenerated muscle fibers. Muscle Nerve 2001; 24: 410-6.
12. Marques M.J., Pertille A., Carvalho C.L. et al. Acetylcholine receptor organization at the dystrophic extraocular muscle neuromuscular junction. Anat. Rec. (Hoboken) 2007; 290(7): 846-54.
13. Соколова А.В., Зенин В.В., Михайлов В.М. Структура нейро-мышечных соединений и дифференцировка поперечно-полосатых мышечных волокон у мышей mdx после клеточной терапии стволовыми клетками костного мозга. Цитология 2010; 52(5): 399-406. [Sokolova A.V., Zenin V.V., Mikhailov V.M. Structure of neuromuscular junctions and differentiation of striated muscle fibers of mdx mice after bone marrow stem cells therapy. Cytology 2010; 52(5): 399-406].
нейромышечных соединений после клеточной терапии зависит не только от уровня достигнутого синтеза дис-трофина в ППМВ, а имеет более сложный механизм.
В настоящее время все чаще применяют неми-елоаблативный способ трансплантации ККМ для замены костного мозга при таких заболеваниях как серповидноклеточная анемия и талассемия у детей [41, 42], по сравнению с миелоаблативным вариантом пересадки костного мозга, что объясняется уменьшением частоты развития реакции трансплантат против хозяина. Немиелоаблативный способ трансплантации ККМ также позволяет лечить серповидно-клеточную анемию у взрослых пациентов, в отличие от миелоаблативного варианта трансплантации, и эффективность лечения достигает 92% [60]. Имеются данные об эффективности применения немиелоаблативной трансплантации костного мозга для лечения атаксии телеангиэктазии у мутантных мышей [61]. Можно предположить, что ККМ аллогенного происхождения будут составлять значительную часть материала, используемого для трансплантаций, поэтому разработка безопасного и эффективного способа трансплантации ККМ аллогенного происхождения актуальна.
Представленные результаты и литературные данные показывают, что необходимо углублять экспериментальное изучение немиелоаблативной трансплантации клеток костного мозга как сравнительно эффективного, надежного и относительно дешевого метода клеточной терапии моногенных заболеваний.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 19-14-00108.
14. Quaettrocelli M., Cassano M., Crippa S. et al. Cell therapy strategies and improvements for muscular dystrophy. Cell Death and Differentiation 2010; 17: 1222-9.
15. Wilschut K.J., Ling V.B., Bernstein H.S. Concise Review: Stem cell therapy for muscular dystrophies. Stem Cells Translational medicine 2012; 1(11): 833-42.
16. Partridge T.A., Morgan J.E., Coulton G.R. et al. Conversion of mdx myofibres from dystrophin-negative to -positive by injection of normal myoblasts. Nature 1989; 337: 176-9.
17. Siemionow M., Cwykiel J., Heydemann A. et al. Dystrophin expressing chimeric (DEC) human cells provide a potencial therapy for Duchenne muscular therapy. Stem Cell Reviews and reports 2018; 14: 370-84.
18. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D. et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature 1999; 401(6751): 390-4.
19. Bittner R.E., Schöfer C., Weipoltshammer K. et al. Recruitment of bone-marrow-derived cells by skeletal and cardiac muscle in adult dystrophic mdx mice. Anat. Embryol. (Berl.) 1999; 199(5): 391-6.
20. De Angelis L., Berghella L., Coletta M. et al. Skeletal Myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta coexpress endothelial and myogenic markers and contribute to postnatal muscle growth and regeneration. The Journal of Cell Biology 1999; 147(4): 869-77.
21. Torrente Y., Belicchi M., Sampaolesi M. et al. Human circulating AC133(+) stem cells restore dystrophin expression and ameliorate function in dystrophic skeletal muscle. J. Clin. Invest. 2004; 114: 182-95.
22. Péault B., Rudnicki M., Torrente Y. et al. Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy. Mol. Ther. 2007; 15(5): 867-77.
23. Galvez B.G., Sampaolesi M., Brunelli S. et al. Complete repair of dystrophic skeletal muscle by mesoangioblasts with enhanced migration ability. J. Cell Biol. 2006; 174(2): 231-43.
24. Dellavalle A., Sampaolesi M., Tonlorenzi R. et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 2007; 9(3): 255-67.
25. Farini A., Razini P., Erratico S. et al. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. J. Cell. Physiol. 2009; 221(3): 526-34.
26. Szade K., Gulati G.S., Chan C.K.F. et al. Where hematopoietic stem cells live: The bone marrow niche. Antioxid. Redox Signal. 2018; 29(2): 191-204.
27. Asahara T., Murohara T. Sullivan A. et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964-7.
28. Kataoka K., Medina R.J., Kageyama T. et al. Participation of adult mouse bone marrow cells in reconstitution of skin. Am. J. Pathol. 2003; 163(4): 1227-31.
29. Kale S., Karihaloo A., Clark P.R. et al. Bone marrow stem cells contribute to repair of the ischemically injured renal tubule. J. Clin. Invest. 2003; 112(1): 42-9.
30. Hess D., Li L., Martin M. et al. Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration. Nat. Biotechnol. 2003L; 21(7): 763-70.
31. Mezey E., Chandross K.J. Bone marrow: a possible alternative source of cells in the adult nervous system. Eur. J. Pharmacol. 2000; 405(1-3): 297-302.
32. Mikhailov V.M. Life cycle of decidual cells. In: Jeon K.W., editor. A survey of cell biology. San Diego: Academic Press (an Elsevier Imprint); 2003. p. 2-63.
33. Mikhailov V.M., Sokolova A.V., Serikov V.B. et al. Bone marrow stem cells repopulate thyroid regeneration in mice. Pathophysiology 2012; 19: 5-11.
34. Alawadhi F., Du H., Cakmak H. et al. Bone Marrow-Derived Stem Cell (BMDSC) transplantation improves fertility in a murine model of Asher-man's syndrome. PLoS One 2014; 9(5): e96662.
35. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 1998; 279(5356): 1528-30.
36. LaBarge M.A., Blau H.M. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. Cell 2002; 111(4): 589-601.
37. Dreyfus P.A., Chretien F., Chazaud B. et al. Adult bone marrow-derived stem cells in muscle connective tissue and satellite cell niches. Am. J. Pathol. 2004; 164(3): 773-9.
38. Михайлов В.М., Евтифеева Е.В., Сериков В.Б. и др. Участие стволовых клеток костного мозга в дифференцировке поперечнополосатых мышц мышей mdx. Цитология 2006; 48(5): 410-7. (Mikhailov V.M., Eftifeeva E.V., Serikov V.B. et al. Participation of bone-marrow stem cells in the differentiation of mdx mice striated muscle. Cytology 2006; 48(5): 410-7.)
39. Wernig G., Jansen V., Schafer R. et al. The vast majority of bone-marrow-derived cells integrated into mdx muscle fibers are silent despite long-term engraftment.PNAS USA 2005; 102(33): 11852-7.
40. Соколова А.В., Соколов Г.В., Михайлов В.М. Слабое комбинированное магнитное поле, настроенное на ион-параметрический резонанс для Ca2+, интенсифицирует синтез дистрофина в скелетных мышцах мышей mdx после клеточной терапии. Цитология 2016; 58 (2):150-5. [Sokolova A.V., Sokolov G.V., Mikhailov V.M. Weak combined magnetic fields adjusted to the parametric resonance for Ca2+ intensify dystrophin synthesis in mdx mice skeletal muscles after cell therapy. Cytology 2016; 58(2): 150-5].
41. Lucarelli G., Isgro A., Sodani P. et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012; 2(5): a011825.
42. Hsieh M.M. A standard nonmyeloablative transplantation regimen for adults with sickle cell disease: Are we there Yet? Biol. blood marrow transplantation 2016; 22: 397-9.
43. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы: Пер. с англ. Москва [СССР]: Мир; 1987. [Polak J.M., Van Noorden S. An introduction to immunocytochemistry: current techniques and problems. Moscow [USSR]: Mir; 1987].
44. Marques M.J., Taniguti A.P., Minatel E. et al. Nerve terminal contributes to acetylcholine receptor organization at the dystrophic neuromuscular junction of mdx mice. Anat. Rec. (Hoboken) 2007; 290(2): 181-7.
45. Кравцова В.В., Михайлов В.М., Соколова А.В. и др. Восстановление электрогенеза скелетной мышцы после клеточной терапии миодистрофии у мышей mdx. Доклады Академии наук 2011; 441(2): 272-4. [Kravtsova V.V., Mikhailov V.M., Sokolova A.V. et al. Recovery
of electrogenesis in skeletal muscles after cell therapy of myodystrophy in mdx mice. Reports of Academy of Sciences 2011, 441(2): 272-4].
46. Mikhailov V.M., Sokolova A.V., Kravtsova V.V. et al. Non-myeloablative bone marrow stem cell transplantation for mdx mice myodystrophy therapy. J. Cell Sci. Ther. 2012; 3: 122.
47. Соколова А.В. Усиление синтеза дистрофина и улучшение структуры нейромышечных соединений мутантных мышей mdx после трансплантации клеток костного мозга. В: Яблонский П.К., главный редактор. Фундам. наука клин. мед. Материалы XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых ученых (с международным участием); 2013 апрель 20; Санкт-Петербург, Россия. Санкт-Петербург: Издательский дом СПбГУ; 2013. стр. 379-80. [Sokolova A.V. Enhanced dystrophin synthesis and improved structure of neuromuscular junctions of mdx mutant mice after bone marrow cell transplantation. In: Yablonskiy P.K., chief editor. Fund. science. din. med. Proceedings of the XVI All-Russian Medical and Biological Conference of Young Scientists (with international participation); 2013 Apr 20; St. Petersburg, Russia. St. Petersburg: SPbSU Publ.; 2013. p. 379-80].
48. Тимонина Н.А., Кравцова В.В., Михайлова Е.В. и др. Электрогенез концевых пластинок диафрагмы мышей mdx: эффект клеточной терапии. Вестник СПбГУ Сер. 3. 201 5; 3: 66-74. [Timonina N.A., Kravtsova V.V., Mikhailova E.V. et al. Electrogenesis of end-plates of mdx mice diaphragm: effect of cell therapy. St. Petersburg State University bulletin 2015; 3: 66-74].
49. Andrade J., Ge S., Symbatyan G. et al. Effects of sublethal irradiation on patterns of engraftment after murine bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 2011; 17(5): 608-19.
50. Haddix S.G., Lee Y.I., Kornegay J.N. et al. Cycles of myofiber degeneration and regeneration lead to remodeling of the neuromuscular junction in two mammalian models of Duchenne muscular dystrophy. PLoS One 2018; 13(10): e0205926.
51. Rafael J.A., Townsend E.R., Squire S.E. et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum. Mol. Genet. 2000; 9: 1357-67.
52. Banks G.B., Chamberlain J.S., Froehner S.C. Truncated dystrophins can influence neuromuscular synapse structure. Mol. Cell. Neurosci. 2009; 40: 433-41.
53. Kong J., Yang L., Li Q. et al. The absence of dystrophin rather than muscle degeneration causes acetylcholine receptor cluster defects in dystrophic muscle. Neuroreport 2012; 23(2): 82-7.
54. McClive P.J., Huang D., Morahan G. C57BL/6 and C57BL/10 inbred mouse strains differ at multiple loci on chromosome 4. Immunogenetics 1994; 39: 286-8.
55. Kennelly K.P., Holmes T.M., Wallace D.M. et al. Early subretinal allograft rejection is characterized by innate immune activity. Cell Transplant. 2017; 26(6): 983-1000.
56. Sampaolesi M., Blot S., D'Antona G. et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature 2006; 444(7119): 574-9.
57. van Putten M., Hulsker M., Young C. et al. Low dystrophin levels increase survival and improve muscle pathology and function in dystrophin/ utrophin double-knockout mice. FASEB J. 2013; 27(6): 2484-95.
58. van der Pijl E.M., van Putten M., Niks E.H. et al. Low dystrophin levels are insufficient to normalize the neuromuscular synaptic abnormalities of mdx mice. Neuromuscul. Disord. 2018; 28(5): 427-42.
59. Wells D.J. What is the level of dystrophin expression required for effective therapy of Duchenne muscular dystrophy? J. Muscle Res. Cell Motil. 2019; 40(2): 141-50.
60. Ozdogu H., Boga C. Hematopoietic stem cell transplantation in adult sickle cell disease: problems and solution. Turk. J. Haematol. 2015; 32(3): 195-205.
61. Pietzner J., Baer P.C., Duecker R.P. et al. Bone marrow transplantation improves the outcome of Atm-deficient mice through the migration of ANM-competent cells. Human mol. Genetics 2013, 22(3): 493-507
Поступила: 15012020
