CC BY
32
УДК 636.39:611.013 НЕКОТОРЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНУ ЛАКТОФЕРРИНА КОЗ Т.В. Мамонтова, к. с.-х. н. М.И. Захарина, аспирант Е.В. Холмова, аспирант ФГБНУ «Всероссийский НИИ овцеводства и козоводства»
В статье приводятся сравнительные данные по влиянию генотипа на показатели спермопродукции трансгенных и нетрансгенных козлов, результаты искусственного осеменения, характер распределения
трансгена в последующих поколениях. Делается вывод о необходимости продолжения научных исследований в данном направлении.
Ключевые слова: трансгенный, ген лактоферрина, козы, генотип
UDC 636.39:611.013 SOME RESULTS IN THE STUDY OF GOATS TRANSGENIC ON THE GENE OF LACTOFERRIN
Mamontova T.V., Cand. Agri. Sci. Zakharina V.I., postgraduate student Kholmova E.V., postgraduate student All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding
Comparative data on genotype influence on sperm production indices of transgenic and non-transgenic bucks, results of artificial insemination, character of transgene distribution in subsequent generations are given in the article. It is concluded that is necessary to continue scientific researches in this direction.
Key words: transgenic, gene of lactoferrin, goats, genotype
Обоснование. Современным и наиболее эффективным способом получения белков человека в промышленных масштабах является технология, основанная на трансгенных животных-продуцентах. На сегодняшний день для получения трансгенных животных предложен ряд методов, среди которых особо выделяется микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус зигот [1-4]. Это связано с тем, что она технологически проще и требует меньше вложений в научно-техническое сопровождение работ, обеспечивая приемлемую эффективность выхода трансгенных животных. В то же время эта работа является очень сложной и многокомпонентной. Она включает такие важнейшие ключевые этапы, как разработка схем гормональной индукции полиовуляции яичников у коз; схем синхронизации охоты в системе донор-реципиент; схем получения датированных женских гамет для микрохирургической инъекции генной конструкции; получение экспериментальных данных по биологической полноценности и способности к имплантации получаемых эмбрионов [5-10]. В результате многолетних экспериментов методом проядерного переноса генной конструкции в 2008 г. были получены козлики ЛАК-1 и ЛАК - 2, несущие в своем геноме ген человеческого лактоферрина [11-13,16,18]. В последующем получено потомство от осеменения коз первичными
трансгенными козлами. Представляет существенный научный и практический интерес выяснение характера распределения трансгена в последующих поколениях, а также изучение роста и развития трансгенных козлят.
Материал и методика исследований. Экспериментальные исследования проведены в отделе овцеводства, на опытной станции ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства», а также в Институте биологии гена РАН, ООО «Нефедовское» Псковской области, РУП «Научно-производственный центр» по животноводству НАН Республики Беларусь. Объектом исследований был молодняк, полученный от осеменения коз в типе зааненской породы первичными трансгенными по гену лактоферрина козлами. В сравнительном аспекте изучались рост и развитие молодняка от рождения до 12-мес. возраста, для чего проводилось взвешивание трансгенных и нетрансгенных козлят в разные возрастные периоды и снятие промеров.
Физиологические, биохимические и гематоиммунные показатели молодняка изучались в соответствии со стандартными методиками.
Уровень и качество спермопродукции козликов, трансгенных по гену лактоферрина, исследовались в соответствии с «Инструкцией по технологии работы организаций по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных».
Результаты исследований. Для изучения потомства, полученного от козлов разного генотипа, на опытной станции ФГБНУ ВНИИОК были сформированы 2 группы козлов и 3 группы коз. Первая опытная группа коз (п=20) состояла из трансгенных по гену лактоферрина коз и была осеменена трансгенными козлами (п=3). Вторая опытная группа коз (п=30) состояла из нетрансгенных коз в типе зааненской породы и была осеменена этими же трансгенными козлами (п=3). Третья группа коз (п=30, контроль) состояла из нетрансгенных коз в типе зааненской породы и была осеменена нетрансгенными козлами (п=3). Все подопытные козы находились в одинаковых условиях содержания и ухода. Кормление соответствовало нормам и рационам, принятым для коз молочного направления продуктивности.
Изучались следующие показатели и получены результаты по качеству и уровню спермопродукции трансгенных козлов; оплодотворяемости коз; длительности пренатального онтогенеза (гестационного периода); плодовитости маток; живой массе потомства при рождении.
В первой части исследований были изучены уровень и качество спермопродукции от 3 трансгенных и 3 нетрансгенных козлов, для чего было исследовано 97 эякулятов по объему, подвижности и концентрации спермиев (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние генотипа на показатели спермопродукции козлов_
Индивидуальный Исследовано Показатели спермопродукции
номер козла эякулятов Объем, мл Подвижность, балл Концентрация, млрд/мл
трансгенные козлы
3012 16 1,1 ±0,05 8,0±0,10 3,2±0,13
3412 15 1,2±0,09 8,2±0,12 3,1 ±0,18
3812 17 1,2±0,04 8,0±0,12 3,0±0,14
В среднем 48 1,17±0,04 8,1±0,08 3,1±0,08
нет рансгенные козлы
90 14 1,3±0,06 8,5±0,15 3,2±0,17
045 20 1,2±0,06 8,3±0,12 3,2±0,16
050 15 1,3±0,08 8,4±0,13 3,1 ±0,12
В среднем 49 1,26±0,04 8,4±0,09 3,2±0,04
Как видно из материалов таблицы, разница показателей спермопродукции в пользу нетрансгенных козлов была статистически недостоверной.
Для определения биологической полноценности спермы козлов было проведено искусственное осеменение. Изучены оплодотворяемость, продолжительность гестации, плодовитость коз. Проведен учет козления. Данные представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты искусственного осеменения коз
Кол-во козлов Показатели воспроизводства коз
осеменено коз, гол. из них окозли-лось получено козлят срок плодоношения, дней живая масса козлят, кг
одинцы двойни
гол. % гол. %
Группа 1 (ТхТ)
3 20 18 90,0 22 122,2 146,8 3,2 2,4
Группа 2 (ТхНТ)
3 30 26 86,7 35 134,6 147,3 3,3 2,8
Группа 3 (НТхНТ)
3 30 28 93,3 37 132,1 148,3 3,6 2,9
Как показали результаты опыта, основные параметры воспроизводительной функции коз между группами не различались и находились в лимите нормы для молочных коз.
Весь полученный молодняк был прочипирован. Динамика живой массы козлят различных генотипов до 6-мес. возраста представлена в таблице 3.
Как видно из материалов таблицы 3, козлята, полученные от осеменения трансгенных коз трансгенными козлами, уступали по живой массе молодняку из других групп во все исследуемые периоды. Мы не готовы дать исчерпывающее объяснение этому факту, т. к. считаем, что полученных данных недостаточно для объективной оценки.
Таблица 3 - Динамика живой массы козлят различных генотипов_
Козлики
Кол-во
Живая масса, кг
при рождении 2 мес. 4 мес. 6 мес.
Группа 1 11 3,1±0,34 14,3±0,38 18,8±0,48 23,38±3,78
Группа 2 18 3,2±0,65 13,9±0,48 19,3±0,65 25,64±1,42
Группа 3 17 3,4±0,56 16,2±0,41 22,0±0,65 30,0±2,65
Для более полного анализа необходимы дальнейшие исследования. У козлят, полученных в 1 и 2 группах коз, были отобраны образцы крови и ушной ткани на определение трансгенности и экспрессии гена лактоферрина. Исследования роста и развития молодняка будут продолжены до достижения козлятами 12-мес. возраста.
В опыте по изучению влияния гомозиготности по аллелю рекомбинантного лактоферрина человека на уровень продукции лактоферрина с молоком и физиологические показатели животного продуцента на модели тренсгенных коз получены следующие результаты.
По методике опыта первая группа коз (n=20) состояла из трансгенных по гену лактоферрина коз и была осеменена трансгенными козлами (n=3). Вторая группа коз (n=30) состояла из нетрансгенных коз в типе заненской породы и была осеменена этими же трансгенными козлами (n=3). Следовательно, потомство, полученное в первой группе коз, можно условно признать гомозиготным по лактоферрину, а потомство, полученное во второй группе коз, - гетерозиготным. В связи с этим исключительный интерес представляет выяснение возможности и степени передачи трансгена потомству, а также эксперессии гена лактоферрина у условно гомозиготных и гетерозиготных животных.
Выяснено, что в 1 группе от осемененных трансгенными козлами трансгенных коз было получено 22 козленка (11 козочек и 11 козликов). Из них трансгенными оказались 17 (77,2%), в т.ч. 8 козочек и 9 козликов.
Во 2-й группе было получено 35 козлят (18 козочек и 17 козликов). Из них трансгенными оказались 18 (51,4%), в т.ч. 8 козочек и 10 козликов.
Не обнаружено отличия в количестве трансгенных потомков в зависимости от полового диморфизма - разница в количестве самцов и самок соответствовала общебиологическому закону расщепления, что указывает на независимое от пола наследование рекомбинантного гена.
Резюмируя полученные данные, в качестве обсуждения хотелось высказать следующее. Подобные исследования в России проводились только на мышах. Наши исследования, проведенные на продуктивных сельскохозяйственных животных (молочных козах), являются уникальными. В частности, показатель наследования трансгена является крайне важным, поскольку дает возможность выяснения характера распределения трансгена в последующих поколениях, определяет возможность получения потомков на основе исследованных генных конструкций с помощью использованного метода первичных
трансгенных сельскохозяйственных животных и стад, без опасения значительного снижения уровня передачи трансгена в поколениях [14,15]. В то же время следует помнить, что при получении трансгенных животных методом проядерного переноса генов, как в нашем случае, интеграция трансгена происходит неконтролируемо, в произвольные сайты встраивания [17,18]. Следовательно, в первом поколении количество трансгенов в потомстве может значительно варьировать, и конкретные показатели передачи трансгена потомству могут указывать на мозаичность (встраивание в один или несколько сайтов в геноме, встраивание в половые хромосомы). В случае первичных трансгенных самок можно анализировать непосредственно результаты определения копийности встроившегося трансгена (хотя и без учёта возможной мозаичности) и уровень продукции рекомбинантного белка.
Таким образом, основным выводом будет вывод о необходимости продолжения научных изысканий в данном направлении и понимание многократно возрастающей необходимости последующих комплексных исследований с привлечением ученых и специалистов по генно-инженерным работам и ДНК-технологиям.
Список литературы:
1. Айбазов, М.М. Применение лапароскопии при внутриматочном осеменении и трансплантации эмбрионов у овец / М.М. Айбазов // Вестник ветеринарии. - 1998. - N 5. - С. 51.
2. Айбазов, А.-М.М. Ягнята-трансплантаты: рост, развитие и репродуктивная функция / А.-М.М. Айбазов // Вестник ветеринарии. - 2000. - N 15. - С. 41.
3. Айбазов, М.М. Современные биотехнологические методы и приемы интенсификации воспроизводства овец и коз / М.М. Айбазов // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2007. - N 4. - С. 54-56.
4. Айбазов, М.М. Иммунологический профиль у молочных коз в разные периоды воспроизводительной функции / М.М. Айбазов, П.В. Трубникова // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2007. - N 4. - С. 59-61.
5. Айбазов, М.М. Влияние генетических параметров крови овец - доноров и реципиентов на эффективность трансплантации эмбрионов / М.М. Айбазов, М.И. Селионова // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2007. - N 3. - С. 7-11.
6. Айбазов, А.М.М. К вопросу о сохранении генофонда и биологической полноценности криоконсервированной спермы / А.М.М. Айбазов, П.В. Аксенова, К.К. Ашурбегов, Д.В. Коваленко // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. - 2011. - Т. 1. - N 4-1. - С. 24-29.
7. Айбазов, М.М. Возможность и перспективы получения первичных трансгенных животных -продуцентов белков человека / М.М. Айбазов, П.В. Аксенова // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2012. - N 3. - С. 33.
8. Айбазов, М.М. Криорезистентность эмбрионов коз в зависимости от стадии развития / М.М. Айбазов, Т.В. Мамонтова // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства.- 2013. - Т. 3. - N 6. - С. 14-17.
9. Айбазов, М.М. Перспективная биотехнология воспроизводства овец и коз / М.М. Айбазов, Т.В. Мамонтова, М.С. Сеитов // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. - 2014. - Т. 1. - N 7 (1). - С. 3-7.
10. Айбазов, А.М.М. Некоторые биологические и морфометрические показатели западно-кавказского тура / А.М.М. Айбазов, Т.В. Мамонтова // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2014. - N 1. - С. 21-23.
11. Айбазов, М.М. Воспроизводительные показатели трансгенных по гену лактоферрина коз / М.М. Айбазов, Т.В. Мамонтова, Е.В. Холмова // Сборник научных трудов
Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. - 2016. -Т. 1. - N9. - С. 472-476.
12. Аксенова, П.В. Результаты синхронизации полового цикла у молочных коз / П.В. Аксенова, А.М.М. Айбазов, Д.В. Коваленко // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства.- 2012. - Т. 3. - N 1-1. - С. 52-54.
13. Аксенова, П.В. Влияние иммунного статуса коз на сохранность и естественную резистентность потомства / П.В. Аксенова, А.М.М. Айбазов, Д.В. Коваленко // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. - 2012. - Т. 3. - N 1-1. - С. 49-52.
14. Мамонтова, Т.В. Современные тенденции развития мирового и российского рынка биотехнологий в животноводстве / Т.В. Мамонтова, М.М. Айбазов, О. Русакова // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. - 2014. - Т. 2. - N_7. - С. 292-300.
15. Мамонтова, Т.В. К вопросу использования элементов малозатратной технологии в овцеводстве / Т.В. Мамонтова, М.М. Айбазов, М.И. Сингурова // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. -2016. - Т. 1. - N9. - С. 476-480.
16. Мамонтова, Т.В. Биологические и продуктивные показатели козликов, трансгенных по гену лактоферрина / Т.В. Мамонтова, М.М. Айбазов // В сборнике: Инновационные подходы в ветеринарной и зоотехнической науке и практике. Материалы международной научно-практической Интернет-конференции. - 2016. - С. 243-251.
17. Budzevich A., Aybazov M., Goldman I., Sadchikova E. et al. Human lactoferrin transgenic goat breeding. 9th International Conference on Lactoferrin. Structure, Function and Applications.-Pekin.-2009.- p. 58.
