CC BY
15
УДК 616-008:615:032.7:611.661-006.6
НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТКАНЕЙ ОПУХОЛИ ВЕРХНЕЙ ЧЕЛЮСТИ И ЕЕ ПЕРИФОКАЛЬНОЙ
ЗОНЫ
© 2004 г. Ю.С. Сидоренко, Е.М. Франциянц, Ю.В. Ульянова,
Н.Д. Черярина, Н.В. Мусиенко
On a large clinical material was demonstrated that the utilized variant of chemotherapy promotes reduction of a tumor invasion potential and is accompanied by considerable reorganization of tumor energy metabolism.
Увеличение содержания иротеолитических ферментов в плазме (сыворотке) крови онкологических больных является следствием их вымывания из опухолевой ткани, в которой протеазы играют важную роль в пролиферативных процессах [1-3]. В связи с этим показатели активности протеаз используются в качестве маркеров инвазионного и метастатического потенциала опухоли. В качестве диагностических тестов также в клинической практике используется определение активности кислой и щелочной фосфатаз [4, 5]. Вне зависимости от характера взаимоотношений протеаз в крови и ткани опухоли, высокую активность катепсина Д в опухоли можно рассматривать как косвенный признак агрессивности злокачественного процесса. Повышение показателя соотношения «протеаза/ингибитор» является свидетельством нарушения регуляции внутриклеточных протеолитических систем, так как она находится под контролем рецепторно-медиаторных процессов [6].
В связи с тем, что повышение содержания протеаз в сыворотке крови сопряжено с выраженностью пролиферации опухолевых клеток, полагают, что определение совокупной активности протеолитических ферментов и их ингибиторов может быть оправдано не только для прогнозирования темпов опухолевого роста, но и для характеристики цитолитического или, по крайней мере, любого другого тумородеструктивного действия противоопухолевых препаратов [7].
Материалы и методы. Клинический материал для настоящего исследования представлен 11 больными местно-распространенным раком верхней челюсти, которые находились на лечении в отделении опухолей головы и шеи Ростовского научно-исследовательского онкологического института. Все пациенты получали на первом этапе комплексного лечения эндотуморальную аутогемохимиотерапию (АГХТ). Методика эндотуморальной АГХТ заключалась во взятии у пациента путем венепункции 5 мл крови в шприц с добавлением 5 ЕД/мл гепарина, инкубации ее с химиопрепаратами при 37 °С в течение 30 мин и последующим введении полученной смеси в опухоль верхней челюсти. При проведении эндотуморальной АГХТ использовались следующие до-
зы химиопрепаратов: метотрексат - 50 мг/м2; блеомицин - 60 мг/м2. Эго сочетание химиопрепаратов вводилось всем больным эндотуморально в течение 5 дней. В рамках настоящего исследования была определена антитриптическая активность (АТА), активность катепсина Д, кислотостабильных ингибиторов (КСИ), щелочной и кислой фосфатаз в образцах интактной ткани верхней челюсти (п = 10), плоскоклеточного рака верхней челюсти и его перифокальной зоны до (п = 11) и после (п = 10) проведения внутриопухолевой АГХТ.
Результаты и обсуждение. Как свидетельствуют результаты, представленные в табл. 1, активность катепсина Д в ткани опухоли верхней челюсти больных, которым не проводилась предоперационная химиотерапия, была в 1,6 раз выше, чем в интактной ткани. Активность КСИ и АТА в образцах опухолей до начала лечения была статистически неотличима от таковой в интактной ткани. Естественно, что числовые значения коэффициентов «ка-тепсин Д/АТА» и «катепсин Д/КСИ», характеризующих баланс системы «протеаза-ингибитор», в среднем в 1,6 раза превышали значения, вычисленные для интактной ткани, свидетельствуя о нарушении процессов ограниченного протеолиза.
Таблица 1
Некоторые показатели активности гидролитической системы тканей опухолей верхней челюсти и ее перифокальной зоны до проведения внутриопухолевой аутогемохимиотерапии
Иссследуемый показатель Активность в
интактной ткани опухолевой ткани тканях перифокальной зоны
Катепсин Д, нМ/г тк. 400 ± 32,3 648 ± 51,3і 440 ±35,8
АТА, мг трипс/г тк. 4,5 ± 0,4 4,6 ±0,5 7,5 ± 0,8і
КСИ, мг трипс/г тк 6,8 ±0,7 6,6 ± 0,6 9,8 ± 0,9і
Катепсин Д/АТА 88,9 ± 7,6 144,0 ± 12,2і 58,7 ± 5,31,2
Катепсин Д/КСИ 58,8 ±5,3 98,2 ± 8,6і 44,9 ± 4,11,2
Кислая фосфатаза, ед. 6,4 ±0,6 8,2 ± 0,7і 5,0 ± 0,41,2
Щелочная фосфатаза, ед 1,4 ±0,1 0,8 ± ОД1 0,9 ± ОД1
Коэффициент КФ/ЩФ 4,6 ± 0,5 10,2 ± 0,9і 5,5 ± 0,72
Примечание к табл. 1 и 2. 1 - статистически достоверные отличия в сравнении со значениями для интактной ткани (р < 0,01); 2 - статистически достоверные отличия в сравнении со значениями для ткани опухолей (р < 0,01).
Активность кислой и щелочной фосфатаз в опухолевой ткани пациентов, которым не проводили предварительного лечения, изменялась во взаимно противоположных направлениях: активность кислой фосфатазы была на
28,1 % выше, а активность щелочной фосфатазы на 42,9 % ниже, чем в ин-тактной ткани. Для оценки состояния системы энергообеспечения, построенной на обмене фосфатов, в ткани злокачественных опухолей до начала лечения определяли значение коэффициента соотношения активности кислой и щелочной фосфатаз (КФЯЦФ). Обнаружено, что в ткани опухоли этот коэффициент в 2,2 раза выше, чем в интактной ткани (см. табл. 1).
Полученные результаты подтверждают литературные сведения о том, что опухолевые клетки в избыточном количестве экспрессируют и секретируют протеазы, обеспечивающие деградацию матрикса, гистогематических барьеров и инвазию опухолевых клеток.
Избыточное фосфорилирование в клетках опухоли, осуществляющееся в результате активации фосфатаз, обеспечивает увеличение инвазионного потенциала опухолевых клеток в условиях гипоксии. Свидетельством тому служит характерное для такой ситуации резкое повышение активности кислой и снижение активности щелочной фосфатазы [2].
Таким образом, показатели активности гидролитической системы в ткани опухолей верхней челюсти до проведения внутритуморальной АГХТ свидетельствовали о высокой степени злокачественности новообразования и его значительном инвазионном потенциале.
После проведения внутритканевой АГХТ активность катепсина Д в ткани опухолей верхней челюсти снизилась на 27,2 % и превышала показатель для интактной ткани слизистой верхней челюсти только на 18 % (табл. 2). Отмечено умеренное достоверное повышение АТА на 14 %, в связи с чем значение коэффициента «катепсин Д/АТА» после лечения уже не отличалось от такового в интактной ткани. Активность КСИ возросла более существенно - на 25,8 %, что также сопровождалось нормализацией значений коэффициента «катепсин Д/КСИ» в ткани опухоли.
После завершения внутриопухолевой АГХТ обнаружено снижение до нормального уровня активности кислой фосфатазы, которое, вероятно, связано с изменением оксигенации опухоли. С другой стороны, параллельного изменения активности щелочной фосфатазы в сравнении с фоновыми величинами не зафиксировано. Показатель соотношения кислой и щелочной фосфатаз, отражающий взаимоотношения цитозольного и мембранного компонентов системы фосфорилирования, уменьшился в сравнении с показателем, определенным до начала лечения, на 35,3 %. При этом он продолжал оставаться повышенным на 43,5 % в сравнении с показателем для интактной ткани (см. табл. 2).
Таблица 2
Некоторые показатели активности гидролитической системы тканей опухоли верхней челюсти и ее перифокальной зоны после проведения внутриопухолевой аутогемохимиотерапии
Иссследуемый показатель Активность в
интактной ткани опухолевой ткани тканях перифокальной зоны
Катепсин Д, нМ/г тк. 400 ± 32,3 472 ± 28,21,2 400 ± 27,6
АТА, мг трипс/г тк. 4,5 ±0,4 5,5 ± 0,4і 5,5 ± 0,51,2
КСИ, мг трипс/г тк 6,8 ±0,7 8,3 ± 0,7і 6,8 ± 0,42
Катепсин Д/АТА 88,9 ± 7,6 85,8 ±6,4 72,7 ± 6,31Д
Катепсин Д/КСИ 58,8 ±5,3 56,9 ±4,1 58,8 ± 4,9
Кислая фосфатаза, ед. 6,4 ±0,6 6,0 ± 0,5 5,8 ±0,5
Щелочная фосфатаза, ед. 1,4 ±0,1 0,9 ± 0,07і 1,2 ±0,1
Коэффициент КФ/ЩФ 4,6 ± 0,5 6,6 ± 0,41,2 4,8 ± 0,32
Таким образом, проведенные исследования гидролитической активности ткани опухоли после внутриопухолевой АГХТ подтвердили наши предположения о том, что этот вид химиобиотерапии способствует снижению инвазионного потенциала опухоли и сопровождается значительной перестройкой энергетического обмена в ней.
При изучении процессов деградации внеклеточного матрикса было показано, что раковая инвазия часто сопровождается критическим взаимодействием между клетками злокачественной опухоли и некоторыми типами окружающих ненеопластических клеток стромы [8]. Кроме того, в процессах восстановления нормальной ткани синтез протеолитических компонентов часто распределяется между несколькими типами клеток. Также существует очевидное сходство между неопластическими и ненеопластическими процессами в одной и той же ткани.
В связи с изложенным была изучена активность гидролитических процессов в перифокальной зоне опухоли до и после проведения внутритканевой АГХТ.
Обнаружено, что до начала лечения активность катепсина Д достоверно не отличалась от таковой в интактной ткани, тогда как активность КСИ и АТА была в 1,7 и 1,5 раза, соответственно, выше, чем в интактной ткани и ткани злокачественных опухолей. Значения коэффициентов «катепсин Д/КСИ» и «катепсин Д/АТА» были снижены в сравнении со значениями для интактной ткани на 23,6 % и 34 %, соответственно, а в сравнении со значениями для ткани опухоли - в 2,2 и 2,5 раза (см. табл. 1).
Наряду с угнетением протеолитических процессов до начала лечения в перифокальной зоне опухоли отмечено снижение интенсивности фосфорили-рования. Так, активность кислой фосфатазы в ткани перифокальной зоны была снижена в сравнении с ее активностью в интактной ткани на 22 %, а в ткани опухоли - в 1,6 раза. Активность щелочной фосфатазы в ткани перифокальной зоны была на 35,7 % ниже, чем в интактной ткани, и не отличалась от активности этого фермента в ткани злокачественной опухоли верхней челюсти. Коэффициент КФ/ЩФ в ткани перифокальной зоны опухоли достоверно не отличался от величины, вычисленной для интактной ткани, и был практически в 2 раза меньше, чем в ткани опухоли (см. табл. 1).
После внутриопухолевой АГХТ все исследованные показатели в ткани перифокальной зоны опухоли достоверно не отличались от аналогичных в интактной ткани (см. табл. 2).
Синтез протеаз (в частности, катепсина Д) клетками и секреция их в пери-целлюлярную область, помимо обеспечения благоприятных условий для роста и инвазии опухоли, обусловливают нарушение структурнофункционального состояния клеточной поверхности, модификацию ее антигенного набора и адгезивных свойств, что в конечном итоге препятствует дифференцировке клеток и переходу их в состояние покоя [9]. Кроме этого, роль ингибиторов протеаз также неоднозначна при опухолевом росте. С одной стороны, подавляя активность протеаз злокачественных клеток, ингибиторы оказывают антипролиферативное действие и ограничивают рост опухоли. С другой, - ограничивая протеазозависимые стадии иммунологических реакций, ингибиторы затрудняют распознавание и элиминацию трансформированных клеток имму но компетентными клетками [10]. Таким образом, роль протеаз и их ингибиторов в опухолевой и немалигнизированной тканях (в частности, ткани перифокальной зоны) будет различна. В связи с этим для выяснения некоторых механизмов терапевтического действия использованного в работе метода лечения была исследована в сравнительном аспекте активность гидролитических процессов в тканях опухоли и ее перифокальной зоны.
При оценке состояния изучаемой системы в комплексе «опухоль - пери-фокальная зона» до лечения можно констатировать наличие протеолитиче-ской агрессии опухоли, некомпенсированной ингибиторами и сопровождаемой избыточным фосфорилированием. Обнаруженный феномен может служить причиной протеолитического расщепления белка-репрессора пролиферации и модуляции активности онкогена Н-гав [2]. Состояние гидролитических процессов в окружающей ткани характеризовалось депрессией синтетической фазы процесса активации генома клеток. Активация КСИ и повышение АТА в ткани перифокальной зоны опухоли, наблюдавшиеся в наших исследованиях, приводили к изменениям в системе протеаза-ингибитор в сто-
рону подавления внутриклеточного протеолиза, что может быть причиной нарушения нормальной дифференцировки клеток и синтеза белковых молекул из предшественников [9].
Важную роль в развитии как адаптивных, так и патологических процессов играют фосфомоноэстеразы, к которым относятся кислая и щелочная фосфатазы. При этом большое значение в анализе процессов фосфорилирования придается соотношению этих ферментов. Гиперфосфорилирование в клетках опухоли свидетельствует о повышенном энергетическом потенциале, формирующемся в условиях нарастающей в сравнении с интактной тканью гипоксии, подтверждаемой значительным повышением активности именно кислой фосфатазы. Известно, что активность фосфатаз в клетках зависит от количества свободного ортофосфата, повышенные концентрации которого обусловливают репрессию, а низкие - дерепрессию синтеза ферментов. Полученные результаты позволяют полагать, что обнаруженные в ходе проведенного исследования различия в активности кислой фосфатазы в клетках опухоли и ткани перифокальной зоны могут быть связаны с изменением концентрации внутриклеточного неорганического фосфата, доступность которого в свою очередь является одним из лимитирующих факторов гликолиза. Таким образом, одной из причин повышения активности кислой фосфатазы в ткани опухоли может быть ускорение гликолиза.
Полученные результаты подтвердили высказанное ранее положение о том, что до начала лечения на границе «опухоль - перифокальная зона» имеет место нарушение ауторегуляторных процессов, приводящее к дискоординации межклеточных взаимодействий и нарушению контроля со стороны окружающих опухоль тканей [11, 12].
Внутриопухолевая АГХТ снижает инвазионный и пролиферативный потенциал клеток злокачественных опухолей верхней челюсти, изменяя в них гидролитические процессы. Эго, преяда всего, касается нормализации баланса системы «протеаза - ингибитор», сопровождаемой снижением активности кислой фосфатазы до значений, определяемых в интактной ткани. Вторым, не менее важным, механизмом такой химиотерапии является нормализация гидролитических процессов в ткани перифокальной зоны опухоли, способствующая восстановлению межклеточных контактов и обусловливающая на какое-то время сдерживание роста и распространения опухоли в окружающие ткани. Возможно, этим и объясняется удлинение периода до начала прогрессирования процесса.
Литература
1. Гешелин С.А. и соавт. //Вопросы онкологии. 1984. Т. 30. № 10. С. 9-18.
2. РовенскихЮ.А. //Биохимия. 1998. Т. 63. № 9. С. 1204-1221.
3. Ashish G., Chauhan S.S. // Indian J. Exp. Biol. 1997. Vol. 35. № 6. P. 553-564.
4. Локшина JI.A. И Вопросы медицинской химии. 1991. Т. 37. № 6. С. 15-21.
5. ЗуеваН.Н., ДалееП.Г., НазароваД.Л. //Биохимия. 1993. Т. 58. № 7. С. 1009-1023.
6. БарабойВ.А., ЗинченкоВ.А. //Журн. АМНУкраины. 1999. Т. 5. № 3. С. 453^169.
7. Акбашева О.Е. и др. // Вопросы онкологии. 2001. Т. 47. № 45. С. 619-621.
8. Morten J. etal. //Curr. Opinion Cell Biol. 1998. Vol. 10. № 5. P. 667-671.
9. ВеремеенкоK.H. //Врачебное дело. 1994. № 1. С. 8-13.
10. Оглоблина О. Г., Арефьева Т.И. //Биохимия. 1994. Т. 59. № 3. С. 340-352.
11. Орехович В.Н. и др. // Веста. АМН СССР. 1984. С.3-10.
12. Rush B.F. /П. Surg. Oncol. 2000. Vol. 75. № 1. P. 1-4.
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт 23 апреля 2004 г.
