CC BY
16
DOI: 10.23868/202110009
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕПРОДУКТИВНОГО ЗДОРОВЬЯ У МУЖЧИН-ПАЦИЕНТОВ САМАРЫ
Т.В. Старикова Поступила:01.10.2021
Принята к печати: 30.10.2021
Самарский государственный медицинский университет, оПубликОваН£1 on-line: 02.11.2021
Самара, Россия
SOME FEATURES OF REPRODUCTIVE HEALTH IN MALE PATIENTS IN SAMARA
T.V. Starikova
Samara State Medical University, Samara, Russia
e-mail: stv1591@gmail.com
В последние несколько десятилетий во всем мире отмечается снижение фертильности мужчин. Цель работы: анализ биохимического состава спермальной плазмы, спермограм-мы и морфологии сперматозоидов у субфертильных мужчин репродуктивного возраста. В исследование были включены 85 пациентов в возрасте от 25 до 45 лет, находившихся под наблюдением в клинике профессора М.А. Флоровой (Самара): 60 пациентов, обратившихся за помощью с целью оптимизации репродуктивного здоровья и планирования продолжения рода (группа субфертильных мужчин, показатели спермограм-мы имеют отклонения) и 25 клинически здоровых мужчин (контрольная группа, показатели спермограммы в пределах нормы ВОЗ). У субфертильных мужчин установлены изменения строения сперматозоидов и биохимического состава спермальной плазмы (повышение концентрации ферментов трансаминиро-вания). При электронно-микроскопическом анализе была обнаружена фрагментация ДНК сперматозоидов: наибольшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК была выявлена у субфертильных мужчин (более 22%).
Ключевые слова: сперматогенез, репродуктивная функция, фертильность, мужское бесплодие, морфологические характеристики сперматозоидов.
In the past few decades, there has been a decline in male fertility worldwide. The article is devoted to the study of the reproductive health of subfertile men. Purpose of the work: analysis of the biochemical composition of sperm plasma, spermogram and sperm morphology in subfertile men of reproductive age. The study included 85 patients aged 25 to 45 years, who were under observation in the clinic of Professor M.A. Florova (Samara): 60 patients seeking help to optimize reproductive health and procreation planning (a group of subfertile men, spermogram indices have deviations) and 25 clinically healthy men — a comparison group (control, spermogram indices are within the WHO norm). In subfertile men, morphological abnormalities of spermatozoa and changes in the biochemical composition of sperm plasma (increased concentration of transamination enzymes) were established. Spermatozoa with immature chromatin were identified. Electron microscopic analysis revealed fragmentation of sperm DNA: the highest percentage of spermatozoa with fragmented DNA was found in subfertile men (more than 22%).
Keywords: spermatogenesis, reproductive function, fertility, male infertility, morphological characteristics of spermatozoa.
Введение
В последние несколько десятилетий во всем мире отмечается снижение фертильности мужчин [1]. Бесплодие — это глобальная проблема здравоохранения, затрагивающая 15% всех пар репродуктивного возраста. Мужские факторы, включая снижение качества спермы, являются причиной бесплодия в 25-60% этих случаев [2].
Спермограмма — распространенное лабораторное исследованием [1-4], однако существует большой межлабораторный разброс в получаемых результатах [4, 5], что снижает диагностическую ценность анализа [1].
Исследование аномалий структуры сперматозоидов дает возможность не только выявить причину бесплодия, но и определить тактику клинициста: выбрать терапию, рекомендовать вспомогательные репродуктивные технологии, либо (в случае вероятности наследования аномалии) предложить использование донорских сперматозоидов [1, 5]. Несмотря на успехи молекулярной биологии, морфологические методы исследования продолжают играть большую роль в установлении диагноза при нарушении фертильности мужчин [1, 6]. Биохимический состав спермальной плазмы влияет на оплодотворяющую способность сперматозоидов [7], однако, спектр веществ, изучаемых в спермальной плазме, ограничен. Только с помощью комплексного обследования репродуктивной функции можно оценить оплодотворяющую способность сперматозоидов.
Цель исследования: анализ биохимического состава спермальной плазмы, спермограммы и морфологии сперматозоидов у субфертильных мужчин репродуктивного возраста.
Материал и методы
В исследование были включены 85 пациентов в возрасте от 25 до 45 лет, находившихся под наблюдением в клинике профессора М.А. Флоровой (Самара): 60 пациентов, обратившихся за помощью с целью оптимизации репродуктивного здоровья и планирования продолжения рода (группа субфертильных мужчин, показатели спер-мограммы имеют отклонения) и 25 клинически здоровых мужчин (контрольная группа, показатели спермограммы в пределах нормы ВОЗ). Пациенты из группы субфер-тильных мужчин и мужчины из контрольной группы перед исследованием подписывали информированное согласие.
Объектом исследования были спермальная плазма и клетки эякулята. Взятие материала и анализ спермы проводили согласно стандартизованным методикам, предложенным экспертами ВОЗ [8]. Биохимические показатели спермальной плазмы (белок общий, альбумин, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, гамма-глутамилтрансфераза) после стандартной подготовки проб определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Cobas Integra 400+ (Roche, Швейцария) с использованием реактивов и контрольных материалов фирмы-изготовителя.
Препараты эякулята, полученного путем мастурбации, окрашивали гематоксилином по Майеру [8] и анализировали морфологию сперматозоидов на фазово-контраст-ном микроскопе Nikon Eclipse E 200 (Nikon Instruments, Япония). Подсчет количества сперматозоидов с нормальной морфологией и патологичных проводили вручную.
Для определения фрагментации ДНК в сперматозоидах эякулят разводили в 10 раз изотоническим раствором
Таблица 1. Содержание белков в спермоплазме субфертильных мужчин
Показатели Субфертильные мужчины (n=60) Контроль(n=25) р1-2*
Белок общий, г/л 14,25 (11,23-16,68) 28,35 (15,13-39,00) 0,003
Альбумин, г/л 4,45 (3,48-5,53) 4,80 (4,13-5,40) 0,006
Аланинаминотрансфераза, Ед/л 71,55 (54,33-116,00) 57,20 (39,48-110,50) 0,585
Аспартатаминотрансфераза, Ед/л 305,85 (197,63-440,93) 286,05 (213,33-412,33) 0,726
Щелочная фосфатаза, Ед/л 199,50 (125,28-360,78) 217,75 (143,30-347,20) 0,907
Гамма-глутамилтрансферазаза, Ед/л 10857,15 (8742,45-12000,00) 7845,50 (5305,30-11908,13) 0,090
Примечание: * — уровень статистической значимости при сравнении показателей спермоплазмы мужчин субфертильной группы (1) и контрольной группы (2)
NaCl, центрифугировали в течение 15 мин. при 100 g, осадок ресуспендировали в 0,2 мл NaCl, делали мазок на адгезивные стекла HistoBond (Marienfeld, Германия), высушивали и хранили при -20 °С. Перед исследованием мазки фиксировали в течение 15 мин. 4% раствором формальдегида на PBS, пермеабилизировали клетки 0,2% раствором Triton X-100 на PBS в течение 5 мин., инкубировали с раствором протеиназы К (20 мкг/мл, Zymo Research, Германия) на PBS в течение 10 мин., промывали PBS и дополнительно фиксировали формальдегидом. Все процедуры выполняли при комнатной температуре. Разрывы ДНК выявляли с помощью набора реактивов Dead End Fluorimetric (Promega, США) для окраски ДНК.
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных результатов выполняли с использованием компьютерных программ MS Office 2016, SPSS 21 (IBM SPSS Statistics, США, 2017 лицензия № 20130626-3). Описательные статистики для количественных показателей представлены в виде M±m, где M — среднее арифметическое, m — стандартная ошибка средней. Уровень статистической значимости различий (р) был принят за 0,05.
Результаты и обсуждение
Патологические процессы в мужской репродуктивной системе сопровождаются изменением не только сперматогенеза, но и белкового состава спермоплазмы, поэтому уровень этих метаболитов в спермоплазме может косвенно свидетельствовать об андрогенной насыщенности организма и функциональном состоянии желез мужской половой системы. Спермальная плазма, являясь микроокружением сперматозоидов, должна создавать оптимальные условия для их существования.
Известно, что физиологическая роль белков (а именно ферментов трансаминирования) эякулята связана с поддержанием подвижности сперматозоидов [7]. При анализе спермоплазмы субфертильных мужчин (табл. 1) было выявлено повышение концентрации ферментов трансаминирования: аланинаминотрансферазы, аспарта-тамино-трансферазы и особенно гамма-глутамилтранс-феразы по сравнению с группой контроля (разница недостоверна). Было отмечено снижение количества общего белка и уровня щелочной фосфатазы в группе бесплодных мужчин, что является косвенным подтверждением функциональной несостоятельности сперматозоидов.
Ведущими показателями, отражающими оплодотворяющую способность спермы, считаются концентрация
Таблица 2. Характеристика эякулята и функциональные особенности сперматозоидов у субфертильных мужчин
Показатели Субфертильные мужчины (n=60) Контроль(n=25) р1-2*
Объем эякулята, мл 1,61 (0,20- 2,55) 2,93 (0,29- 3,56) 0,005
Вязкость, см 1,28 (0,29- -1,48) 0,89 (0,37- -1,20) 0,080
Количество сперматозоидов, млн/мл 29,11 (3,82- -29,61) 82,49 (8,80- 82,43) 0,001
общее количество сперматозоидов, млн 82,66 (13,98 -83,99) 280,43 (37,14 -284,96) 0,006
Патологичные сперматозоиды,% 60,99 (1,96- 62,92) 48,21 (2,59- 50,87) 0,110
Патология головки,% 20,21 (0,80- -21,58) 14,11 (1,15- -15,52) 0,002
Патология шейки,% 19,18 (0,88- -19,46) 13,22 (1,13- -14,43) 0,101
Патология хвоста, % 12,98 (0,53- -12,73) 7,65 (0,70- 8,57) 0,108
сочетанная патология,% 11,98 (0,94- -12,15) 7,44 (0,96- 8,35) 0,002
Прогрессивно подвижные (РП), % 32,02 (2,10- -32,08) 55,70 (2,58- 55,35) 0,004
Непрогрессивно подвижные (ЫР),% 18,88 (1,44- -18,98) 16,76 (1,77- -17,73) 0,007
Неподвижные (1М),% 49,81 (2,07- 49,94) 25,29 (2,35- 26,83) 0,888
Лейкоциты 1,56 (0,24- -1,27) 0,98 (0,28- -1,38) 0,009
Клетки сперматогенеза 3,01 (0,29- 3,08) 2,82 (0,32- 3,16) 0,119
Примечание: * — уровень статистической значимости при сравнении показателей эякулята мужчин субфертильной группы (1) и контрольной группы (2)
Рис. Препараты спермы пациента из группы субфертильных мужчин (А — тератозооспермия) и клинически здорового донора из группы контроля (Б — нормозооспермия). Окраска: гематоксилин по Майеру. Ув. х100
сперматозоидов (их общее количество), подвижность и количество сперматозоидов нормальной (типичной) морфологии. Однако, как известно из литературы, эти показатели могут значительно перекрываться, что позволяет предполагать наличие неких важных, но не учитываемых в традиционной диагностике факторов, влияющих на фертильность [1].
При изучении морфофункциональных характеристик сперматозоидов было обнаружено, что они значительно хуже в группе мужчин с репродуктивными дисфункциями по сравнению с контрольной группой (табл. 2). Важно отметить, что количество неподвижных сперматозоидов у мужчин с репродуктивными дисфункциями было намного больше, чем в контрольной группе (табл. 2).
Морфологические особенности сперматозоидов играют важную роль в процессе оплодотворения яйцеклеток. К патологическим принято относить сперматозоиды с различными дефектами шейки, хвоста и головки, вследствие чего они оказываются либо не способны к оплодотворению, либо могут приводить к патологии беременности. Тератозооспермия — нарушение выработки спермы, при котором в эякуляте более
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Рогозин Д.С. Мужская фертильность: обзор литературы июля-сентября 2020 года. Вестник урологии 2020; 8(4): 122-8 [Rogozin D.S. Male fertility: review of the publications of July-September 2020. Urology Bulletin 2020; 8(4): 122-8].
2. Farnaz S., Mohammad J., Mamak S. et al. Frequency and epidemiologic aspects of male infertility. Acta Med. Iran. 2015; 53(4): 231-5.
3. Salas-Huetos A., Bulb M. Dietary patterns, foods and nutrients in male fertility parameters and fecundability: a systematic review of observational studies. Hum. Reprod. Update 2017; 23: 371-5.
4. Lestari S.W., Miati D.N., Seoharso P. et al. Sperm Na+, K+-ATPase a4 and plasma membrane Ca2+-ATPase (PMCA) 4 regulation in astheno-zoospermia. Syst. Biol. Reprod. Med. 2017; 8: 134-8.
5. Zhang Z., Zhang Y., Liu C. et al. Serum Metabolomic Profiling Identifies Characterization of Non-Obstructive Azoospermic Men. Int. J. Mol. Sci. 2017; 18: 238-42.
6. Рутинский А.И. Особенности диагностики идиопатического мужского бесплодия. Медикосоциальные проблемы семьи 2013; 18(1):
96% сперматозоидов имеют аномальную форму. У субфертильных мужчин наблюдали патологичную форму сперматозоидов — тератозооспермию (рис.), у условно здоровых мужчин из группы контроля сперматозоиды имели нормальный фенотип (см. рис.).
При электронно-микроскопическом исследовании сперматозоидов мужчин обеих групп была обнаружена фрагментация ДНК сперматозоидов. Наибольший процент сперматозоидов с фрагментированной ДНК был выявлен у субфертильных мужчин (более 22%). Фрагментация ДНК до 15% является нормой по стандартам ВОЗ [1, 8].
В проведенной нами работе были использованы различные методы диагностики мужского бесплодия (биохимический анализ спермоплазмы, изучение морфо-функциональных характеристик эякулята и электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов), с помощью которых удалось установить, что сперма пациентов в группе субфертильных мужчин хуже по всем изученным параметрам, чем в группе клинически здоровых доноров, следовательно, способность к оплодотворению у пациентов с нарушением фертильности будет ниже, чем у доноров из группы контроля.
116-21 [Rutinskii A.I. Features of the diagnosis of idiopathic male infertility. Medical and social problems of the family. Medical and social problems of the family 2013; 18(1): 116-21].
7. Кравцова Н.С., Роживанов Р.В., Курбатов Д.Г. Стимуляция сперматогенеза у мужчин комбинированной терапией фолликулостимулирующим гормоном и хорионическим гонадотропином при патозооспермии и бесплодии в случаях неэффективности монотерапии хорионическим гонадотропином или антиэстрогеном. Андрология и генитальная хирургия 2016; 17(2): 29-33 [Kravtsova N.S., Rozhivanov R.V., Kurbatov D.G. Stimulation of spermatogenesis by combined therapy with follicle-stimulating hormone and chorionic gonadotropin for azoospermia and infertility in cases of previous ineffective monotherapy with chorionic gonadotropin and antiestrogen. Androl. Genital Surg. 2016; 17(2): 29-33].
8. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5th ed. World Health Organization 2010; https://apps.who.int/iris/handle/10665/44261
