CC BY
92
О. О. Майкова, С.И. Беликов
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА
БАЙКАЛЬСКИХ ГУБОК
Определены нуклеотидные последовательности двух высоковариабельных межгенных районов митохондриального генома двадцати губок семейства ЬиЬошігзк^ае. В результате анализа последовательностей найдена открытая рамка считывания, кодирующая три предполагаемых белка, а также множество инвертированных повторов, образующих вторичные структуры. Сравнительный анализ этих вторичных структур выявил наличие гомологичных шпилек у байкальских губок, принадлежащих к разным родам. В результате исследования показано, что увеличение размеров межгенных последовательностей митохондриального генома байкальских губок происходит не только за счет появления прямых и инвертированных повторов, но также и открытых рамок считывания. Эти особенности организации митохондриального генома являются отличительными признаками байкальских эндемичных губок от космополитных.
Ключевые слова: губки; ЬиЬошігБк^ае; митохондриальный геном; открытая рамка считывания.
Губки (Porifera) являются древнейшими многоклеточными животными, дивергировавшими от своего общего предка около 580 млн лет назад [1]. Губки стоят у основания древа многоклеточных и представляют собой интересный объект для исследования процессов эволюции животных. До сих пор не изучены механизмы, направления и скорость эволюции губок. Остается незавершенной и систематика пресноводных губок, в частности байкальских.
В оз. Байкал спонгиофауна представлена семействами Lubomirskiidae (Rezvoj) и Spongillidae (Gray). Семейство Lubomirskiidae является эндемичным и включает в себя 4 рода, представленные 14 видами [2]. Точный возраст байкальской эндемичной спонгиофауны до сих пор не установлен. По палеонтологическим данным семейство Lubomirskiidae существовало в оз. Байкал уже около 3 млн лет назад [3]. Губки этого семейства являются близкородственными и представляют собой интересный объект для исследования современных процессов видообразования.
Ранее было показано, что сравнительный анализ традиционно используемых ядерных генов 18S рРНК, ITS1 и ITS2 районов рРНК, равно как и митохондриального гена COX1, не позволяет достоверно определить филогенетические отношения внутри байкальского эндемичного семейства [4, 5]. В связи с этим назрела необходимость сравнения полных митохондриальных геномов.
В последнее время изучению митохондриальных геномов губок уделяется большое внимание. Определены нуклеотидные последовательности 23 полных митохондриальных геномов губок класса Demospongiae (Solías) [6-10], в том числе байкальской губки Lubomirskia bai-calensis (Pallas) [11] и Ephydatia muelleri (Lieberkuhn), вероятного предка Lubomirskiidae [6]. Было показано, что митохондриальные геномы этих двух видов губок имеют не только идентичный набор генов, но и их расположение. Однако размеры геномов значительно отличаются (более чем на 4000 пн) за счет увеличения меж-генных районов у Lubomirskia baicalensis [11].
Особый интерес вызывают именно межгенные районы митохондриальных геномов губок, учитывая то, что до сих пор нет данных о механизмах регуляции репликации и транскрипции мтДНК у этого типа животных. Как известно, у разных групп животных в некодирующих регионах расположены регуляторные последовательности, отвечающие за начало репликации митохондриального генома: в так называемой D-петле
у позвоночных и в А+Т-богатой области у беспозвоночных. Последовательности вокруг сайта начала репликации, которые могут формировать петли, являются довольно консервативными и непосредственно участвуют в инициации репликации [12, 13]. Даже для мтДНК человека и быка эти вторичные структуры являются высококонсервативными и имеют характерное строение: А+Т-богатые петли и в+С-богатые стебли [13].
Из беспозвоночных в настоящее время наиболее изученными являются митохондриальные геномы насекомых. Например, у дрозофилы, как и у многих других беспозвоночных, сайт начала репликации для минорной цепи находится в средней части большого некодирующего региона в А+Т-богатой области [14], причем образующиеся в этой области вторичные структуры значительно отличаются между высокими таксонами (семействами, порядками) [15]. У близкородственных видов животных, напротив, может наблюдаться высокое сходство последовательностей контрольного региона [16].
У более низкоорганизованных многоклеточных животных, таких как книдарии, предполагаемые контрольные регионы показаны в разных межгенных областях митохондриального генома. Эти районы содержат консервативные блоки последовательностей, а также множественные прямые и инвертированные повторы, способные к образованию стабильных шпилек [17, 18]. Для губок недавно были представлены данные
о предположительном контрольном регионе, расположенном в самом протяженном межгенном промежутке, обладающем признаками контрольного района высших многоклеточных [19].
Как известно, скорость эволюции митохондриальной ДНК животных в 10 раз выше скорости эволюции ядерного генома [20]. В результате исследований митохондриальных геномов губок показано, что в отличие от других животных, большинство видов БетОБ-pongiae имеют низкую скорость эволюции нуклеотидной последовательности генов мтДНК, в том числе и отряд Haplosclerida (ТорБеШ), к которому относятся семейства Lubomirskiidae и 8ро^ПШае [21]. Однако имеются высоковариабельные некодирующие последовательности, сосредоточенные между генами, протяженность которых, по данным Д.В. Лаврова, составляет от 2 до 24% от общего размера генома [6]. Интересно, что у книдарий, так же как и у губок, скорость эволюции митохондриальных генов ниже, чем у других групп животных [22, 23]. При филогенетическом ис-
следовании книдарий было показано, что использование индивидуальных белок-кодирующих митохондриальных генов позволяет достоверно разделить лишь семейства, а комплексное использование всех генов NAD позволяет определить филогенетические взаимоотношения только до уровня родов. Использование некодирующих регионов для этих целей также является проблематичным из-за их короткой длины и небольшого количества филогенетически-информативных сайтов, несмотря на высокую изменчивость данных районов. Однако некодирующие регионы были успешно использованы в качестве диагностических маркеров при определении границ видов [24] и популяционном анализе книдарий [17].
Целью настоящей работы является выявление структурных особенностей митохондриального генома, отличающих байкальских эндемичных губок от космо-политных, и поиск предполагаемых регуляторных элементов в межгенных областях губок семейства Lubomirskiidae.
Образцы губок были собраны в южной и центральной котловинах оз. Байкал во время экспедиционных работ в 2007 и 2008 гг. с глубин 5-25 м с помощью водолазов.
Выделение суммарной ДНК образцов байкальских губок проводили путем лизиса ткани в SDS-буфере в присутствии протеиназы К по методу [25].
Для амплификации межгенных фрагментов митохондриального генома были использованы праймеры на консервативные участки последовательностей генов транспортных РНК: тРНК-Met и тРНК-Tyr: (trnY-trnM_L) 5 ’ -GATGGCAGAGCGGTAATGC-3 ’, (trnM-trnY_R) 5 ’ -GTAGGTTCGAGTCCTGCCT-3 ’. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе фирмы DNA Engin DYADTM (MJ Research) с параметрами: первичная денатурация 95°С - 2 мин, затем 3035 циклов в режиме - 96°С - 2 с, 60°С - 30 с, 72°С -
1 мин 30 с с последующей выдержкой при 72°С в течение 10 мин.
Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали методом горизонтального электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле. Выделение продукта из геля проводили методом замораживания-оттаивания. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на секвенаторе CEQTM 8800 (Beckman Coulter).
Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей межгенных районов осуществляли с использованием программ MAFFT v. 6.240 [26] и BioEdit. Построение вторичных структур межгенных районов осуществляли с помощью сервера Mfold (version 3.2) при температуре +4°С [27]. Поиск открытых рамок считывания проводили с использованием программы Unipro UGENE, предсказание локализации трансмембранного домена в предполагаемом белке осуществляли с помощью сервера SignalP 3.0.
В результате исследования были определены нуклеотидные последовательности фрагмента митохондриального генома, включающего два высоковариабельных участка между генами тРНК-Tyr и тРНК-Met, разделенные геном тРНК-Ile. Все 20 проанализированных образцов губок относятся к байкальскому семейству Lubomirskiidae, к представителям 3 родов (номера в GenBank GU980930-GU980944, GU057852-
GU057856). Длина амплифицированных последовательностей варьировала от 475 до 908 пн, что связано с присутствием множественных делеций / вставок.
В районе между генами тРНК-Tyr и тРНК-Ile у всех исследуемых байкальских губок мы обнаружили открытую рамку считывания, которая начинается с кодона AUG в позиции 28 в консервативном блоке у всех байкальских губок. У космополитной губки E. muelleri эта открытая рамка считывания не обнаружена, что позволяет считать ее одним из отличительных признаков губок семейства Lubomirskiidae. В результате сравнительного анализа аминокислотных последовательностей предполагаемого белка было выявлено, что найденная открытая рамка считывания может кодировать 3 типа белков (рис. 1).
Блок С
Рис. 1. Расположение открытой рамки считывания на схеме митохондриального генома L. baicalensis (Lavrov, 2009):
1, 2, 3 - типы предполагаемых белков; блок С - консервативный район в 21 аминокислоту, блок D - трансмембранный домен
Все транслируемые последовательности на ^Т-конце имеют высококонсервативную область в 21 аминокислоту (блок С), которая входит в состав района, определенного как трансмембранный домен (блок Б) с сайтом расщепления между аминокислотами 37 и 38. Исходя из трех типов предполагаемого белка, мы условно поделили все исследуемые губки на 3 группы, не связанные с родовой принадлежностью. В первую группу входят 6 экземпляров губок, у которых длина предполагаемого белка дости-
гает 72-74 аминокислоты за исключением одной последовательности в 60 аминокислот, при этом все нуклеотидные делеции в пределах этого района кратны трем. Вторую группу составляют 8 экземпляров губок, у которых транслируемая последовательность оканчивается в позиции 38, именно в месте предсказанного сайта расщепления. В третью группу входят оставшиеся 6 губок, у которых после консервативного блока кодируется другой белок, общая длина которого варьирует от 44 до 50 ами-
нокислот, при этом стоп-кодоном служит либо иле, либо, редко, ИЛЛ.
Наличие консервативного региона, входящего в состав предполагаемого трансмембранного домена, а также тот факт, что все нуклеотидные делеции в пределах предполагаемой транслируемой последовательности кратны трем, дает нам возможность предположить, что этот белок действительно может существовать.
Кроме открытых рамок считывания в межгенных районах митохондриальных геномов байкальских губок также присутствуют множество прямых и инвертированных повторов.
При моделировании вторичных структур в исследуемых межгенных районах у всех байкальских губок показаны множественные инвертированные повторы, которые могут образовывать шпильки. Так, в пределах найденной открытой рамки считывания у большинства байкальских губок находятся три гомологичные шпильки (рис. 2-4), причем последняя шпилька находится либо непосредственно перед стоп-кодоном, либо включает его в себя (рис. 4). Эта шпилька была недавно описана в митохондриальном геноме Ь. Ьаісаієтіі' как Ніє [11]. Первая шпилька является строго консервативной (рис. 2).
Рис. 2. Первая шпилька, консервативная среди
L. baicalensis, B. intermedia profundalis и S. papyracea
Рис. 3. Вторая шпилька: а - у B. intermedia profundalis и S. papyracea, б - у L. baicalensis
5' -G
> 1 *-3
T-A С
с G C-G
T-A C-G A-T
G A-T C-G
C-G C-G C-G
A-T C-G G-C
C-G G-C A-T
C-G G-C T-A
G-C-3' S' - A-T -3' 5' ■C-G ■3
a 6 в
Четвертая шпилька располагается вне открытой рамки считывания около гена тРНК-11е (рис. 5), описанная ранее как Н3 [11]. У Ь. Ьаісаієтіі' и & ра-ругасеа (Dybowski) имеется пятая гомологичная А+Т-богатая шпилька, которая находится либо перед шпилькой № 4 (Н3), либо после нее (рис. 6). При сравнении этих вторичных элементов заметна тенденция удлинения самих шпилек у Ь. Ьаісаіетіі' в результате вставок комплементарных пар нуклеотидов (такие вставки на рисунках выделены рамкой). Следует отметить, что среди гомологичных шпилек у разных губок петли могут сильно варьировать.
Рис. 4. Третья шпилька: а - у S. papyracea; б - у B. intermedia profundalis; в — у L. baicalensis
У всех байкальских губок в районе между генами тРНК-Tyr и тРНК-Ile присутствует 5 консервативных блоков последовательностей, сходство по которым между всеми исследуемыми образцами губок варьирует от 68,4 до 100%, за исключением последовательности S. papyracea, сходство с которой в этих блоках изменяется от 47 до 100%.
Для более подробного анализа распределения шпилек был выбран район между генами тРНК-Tyr и тРНК-Ile представителей 3 родов губок: L. baicalensis, Baikalospongia intermedia profundalis (Rezvoj) и S. papyracea.
В результате моделирования вторичных структур у profundalis - 9 шпилек, и меньшее количество шпилек
L. baicalensis обнаружено 12 шпилек, у B. intermedia присутствует у S. papyracea - 8.
Рис. 5. Четвертая шпилька: а - у S. papyracea; 6-у В. intermedia profundalis; в — у L. baicalensis
G
А
Т
А
T-G А-T 1
G G G-С
G-С Т_А
Ä-T А-Т
T-А Т-А
С-G C-G
С-G C-G
T-А Т-А
А-T А-Т
T-А Т-А
5'-А-T-3' 5'-А-Т-3
а б
Рис. б. Пятая шпилька: а - у S. papyracea; б - у L. baicalensis
В результате сравнительного анализа вторичных структур выбранных последовательностей были обнаружены 4 гомологичные шпильки у всех трех видов губок и одна шпилька, которая имеется только у L. bai-calensis и X papyracea, о которых говорилось ранее.
В результате проведенных нами исследований показано, что увеличение размеров межгенных последовательностей митохондриального генома байкальских губок происходит не только за счет появления прямых
и инвертированных повторов, но также и открытых рамок считывания. Подробное изучение некодирующих регионов митохондриальных геномов губок позволит углубиться в понимание процессов регуляции репликации и транскрипции. В дальнейшем мы планируем установить пригодность выбранных межгенных районов в качестве молекулярно-генетических маркеров для идентификации близкородственных видов губок семейства ЬиЪошшкШае.
ЛИТЕРАТУРА
1. Li C.W., Chen J.Y., Hua T.E. Precambrian sponges with cellular structures // Science. 1998. Vol. 279. P. 879-882.
2. Ефремова С.М. Губки (Porifera) // Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна. Т. 1: Озеро Байкал. Кн. 1. Но-
восибирск: Наука, 2001. С. 179-192.
3. WeinbergE. The sponge fauna of Lake Baikal in the Late Pliocene // Russian Geology and Geophysics. 2001. Vol. 1(2). P. 130-137.
4. Itskovich V., Belikov S., Efremova S., Masuda Y. et. al. Monophyletic origin of freshwater sponges in ancient lakes based on partial structures of COXI
gene // Hydrobiologia. Springer Netherlands. 2006. Vol. 568(1). P. 155-159.
5. Itskovich V., Gontcharov A., Masuda Y., Nohno T. et al. Molecular phylogeny of freshwater sponges (Porifera) based on ITS1 and ITS2 sequences of
ribosomal DNA // Mol. Evol. 2008. Vol. 67(6). P. 608-620.
6. WangX., LavrovD.V. Seventeen new complete mtDNA sequences reveal extensive mitochondrial genome evolution within the Demospongiae // PLoS
ONE. 2008. Vol. 3(7). P. 1-11.
7. Lavrov D.V., Forget L., Kelly M., Lang B.F. Mitochondrial Genomes of Two Demosponges Provide Insights into An Early Stage of Animal Evolution
// Mol. Biol. Evol. 2005. Vol. 22(5). P. 1231-1239.
8. Lavrov D.V., Lang B.F. Transfer RNA gene recruitment in mitochondrial DNA // Trends Genet. 2005. Vol. 21. P. 129-133.
9. Erpenbeck D., Voigt O., Adamski M. et al. Mitochondrial diversity of early-branching Metazoa is revealed by the complete mt genome of a haplo-
sclerid demosponge // Mol. Biol. Evol. 2007. Vol. 24. P. 19-22.
10. Wang X., Lavrov D.V. Mitochondrial genome of the homoscleromorph Oscarella armela (Porifera, Demospongiae) reveals unexpected complexity in the common ancestor of sponges and other animals // Mol. Biol. Evol. 2007. Vol. 24. P. 363-373.
11. Lavrov D.V. Rapid proliferation of repetitive palindromic elements in mtDNA of the endemic Baikalian sponge Lubomirskia baicalensis // Mol. Boil.
Evol. 2010. Vol. 27(4). P. 757-760.
12. Hixson J.E., Wong T.W., Clayton D.A. Both the conserved stem-loop and divergent 59-flanking sequences are required for initiation at the human mitochondrial origin of light-strand DNA replication // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 2384-2390.
13. ClaytonD.A. Nuclear Gene Products that Function in Mitochondrial DNA Replication // Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1987. Vol. 317. P. 473-82.
14. Goddard J.M., Wolstenholme D.R. Origin and direction of replication in mitochondrial DNA molecules from Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75. P. 3886-3890.
15. Zhang De-Xing, Szymura JacekM., Hewitt Godfrey M. Evolution and Structural Conservation of the Control Region of Insect Mitochondrial DNA // Mol. Evol. 1995. Vol. 40. P. 382-391.
16. Boore J.L. Animal mitochondrial genomes // Nucleic Acids Research. 1999. Vol. 27, № 8. P. 1767-1780.
17. Chen C., Dai C.-F., Plathong S. et al. The complete mitochondrial genomes of needle corals, Seriatopora spp. (Scleractinia: Pocilloporidae): An idiosyncratic atp8, duplicated trnW gene, and hypervariable regions used to determine species phylogenies and recently diverged populations // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2008. Vol. 46. P. 19-33.
18. Miller D.J. The mitochondrial genome of Acropora tenuis (Cnidaria: Scleractinia) contains a large group I intron and a candidate control region // J. Mol. Evol. 2002. Vol. 55(1). P. 1-13.
19. Erpenbeck D., Voigt O., Adamski M. et al. Mitochondrial diversity of early branching Metazoa is revealed by the complete mt genome of a haplo-sclerid demosponge // Mol. Biol. Evol. 2007. Vol. 24(1). P. 19-22.
20. Brown W.M., George M.J., Wilson A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. Vol. 76. P. 1967-1971.
21. Lavrov D.V., Wanga X., Kelly M. Reconstructing ordinal relationships in the Demospongiae using mitochondrial genomic data // Mol. Phylogenet. Evol. 2008. Vol. 49. P. 111-124.
22. Romano S.L., Palumbi S.R. Evolution of scleractinian corals inferred from molecular systematics // Science. 1996. Vol. 271. P. 640-642.
23. van Oppen M.J.H., Willis B.L., Miller D.J. Atypically low rate of cytochrome b evolution in the scleractinian coral genus Acropora // Proc. R. Soc. Lond. B. 1999. Vol. 266. P. 179-183.
24. McFadden C.S., Tullis I.D., Hutchinson M.B. et al. Variation in Coding (NADH Dehydrogenase Subunits 2, 3, and 6) and Noncoding Intergenic
Spacer Regions of the Mitochondrial Genome in Octocorallia (Cnidaria: Anthozoa) // Mar. Biotechnol. 2004. Vol. 6. P. 516-526.
25. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.
26. KatohK., MisawaK., KumaK., Miyata T. MAFFT: A novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform // Nucleic
Acids Res. 2002. Vol. 30. P. 3059-3066.
27. ZukerM. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31(13). P. 3406-3415.
Статья представлена научной редакцией «Биология» 15 июня 2010 г.
