CC BY
10
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
те
НЕКОТОРЫЕ МАТЕРИАЛЫ О ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ УСКОРЕННОГО ИЗУЧЕНИЯ влияния
ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА УСЛОВНОРЕФЛЕТОРНУЮ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ БЕЛЫХ КРЫС
Я. Г. Двоскин
Из Центральной научно-исследовательской лаборатории гигиены водного транспорта Министерства здравоохранения РСФСР
Метод исследования условнорефлекторной деятельности животных в хронических экспериментах широко применяется при установлении пороговых и подпороговых концентраций токсических веществ. Подготовительная часть работы — выработка и формирование стереотипа — занимает много времени, что значительно усложняет применение и без того трудоемкой, но весьма чувствительной методики.
В последнее время возможность изыскания ускоренных методик изучения условнорефлекторной деятельности животных, не требующих длительного подготовительного периода, привлекает внимание гигиенистов и токсикологов.
А. А. Голубев (1957, 1958) указывает на большую чувствительность действия яда на условные рефлексы в процессе их выработки по сравнению с лрочно закрепленными рефлексами. Автор использовал метод регистрации скорости выработки оборонительных рефлексов у мышей на звуковой раздражитель. При изучении действия трихлорпропана на группах животных с предварительно выработанными условными рефлексами и с выработкой рефлексов на фоне отравления было установлено, что у второй группы отставание скорости выработки рефлекса у подопытных животных по сравнению с контролем имело место во всех случаях. У группы с предварительно выработанными рефлексами изменения веса наступали раньше, чем изменения условных рефлексов, в то время как у другой группы изменения условных рефлексов наступали раньше, чем изменения веса. Следовательно, как считает автор, ускоренная методика оказалась чувствительнее обычной.
Изучая действие малых концентраций ацетона, 3. Э. Григорьев (1957, 1960) применил укороченную методику изучения изменений условных рефлексов на крысах. Действие ацетона начинали испытывать, когда только что закончилась выработка одного положительного условного рефлекса без периода закрепления. Сравнивая результаты исследований с данными, полученными на крысах с заранее выработанными условными рефлексами, автор приходит к выводу, что наиболее устойчивыми оказались заранее выработанные рефлексы. Свежевыработан-ный рефлекс оказался гораздо чувствительнее к действию токсического продукта. Причем автор отмечает, что по мере закрепления условного рефлекса малые концентрации вещества уже не оказывают заметного
действия. Выработка второго условного рефлекса на фоне продолжающегося воздействия, по мнению автора, нецелесообразна.
Помимо этих работ, в литературе имеется еще ряд сообщений об изучении действия фармакологических веществ на условные рефлексы без предварительной выработки стереотипа. К ним относятся работы Н. Я. Лукомской (1957) по изучению действия никотина, ряд работ Н. В. Савагеева (1957) с фосфоколом, холинолитическими и антихо-линэстеразными веществами, работа Сюй Бин (1957) с промедолом.
Анализ литературных данных позволяет сделать некоторые выводы о том, что попытки применения для прикладных целей ускоренных методик изучения условнорефлекторной деятельности оказались небезуспешными.
В нашей работе, посвященной вопросам нормирования предельно допустимых концентраций паров бензина на танкерах, мы исследовали в хроническом эксперименте с круглосуточной экспозицией влияние нескольких концентраций паров бензина на организм животных (белых крыс). Работу выполняли под руководством проф. А. Г. Бухтиярова.
Изменения высшей нервной деятельности изучали методом условных рефлексов по двигательно-пищевой методике Л. И. Котляровского. Одним из разделов этой работы явились специальные исследования, позволившие изучить в сравнительном плане влияние бензина на условнорефлекторную деятельность животных с предварительно сформированным стереотипом и по укороченным методикам. Изучали влияние бензина марки «Галоша» грозненских нефтей в концентрации 0,02 мг/л.
Методически работа была поставлена следующим образом. У одной группы животных был выработан и сформирован стереотип, который представлял собой определенную последовательность раздражителей: положительный сильный звуковой раздражитель (звонок), два положительный слабых раздражителя (белый свет), звуковой раздражитель, дифференцировочный (тормозной) раздражитель (зуммер), затем один звуковой и один световой раздражители — всего 7 сигналов. Продолжительность условного сигнала составляла 10 секунд, время отставления — 5 секунд. Группа животных составлялась с учетом различных типологических особенностей. Характеристику типа определяли по времени появления и закрепления положительных рефлексов, появления и закрепления дифференцировки, а также на основе функциональных проб: продление дифференцировки до 3 минут, угашение и восстановление положительных рефлексов, суточное голодание, внешнее торможение. Пять животных подвергали воздействию вещества и пять служили контролем.
Животных второй группы подготавливали для исследований по одному из вариантов укороченной методики. У животных вырабатывали условный рефлекс на звук (звонок). После того как животные 10 раз подряд отвечали на условный раздражитель правильной условной реакцией, рефлекс считался прочно выработанным. Сразу же переходили к выработке второго положительного условного рефлекса на свет. Когда оба положительных условных рефлекса были прочно выработаны, животных начинали подвергать воздействию бензина. Опытные и контрольные группы со стояли из 4 животных. Такой вариант позволял изучить влияние вещества на «молодые», еще не успевшие закрепиться условные рефлексы. Реакция животных на сильный и слабый положительные раздражители позволяла судить о правильности силовых взаимоотношений в коре головного мозга. Кроме того, во время выработки рефлексов можно составить некоторое представление об индивидуальных особенно стях животных, что является немаловажным обстоятельством при отсутствии пред ставления об их типологических особенностях. Подготовка занимает 7—10 дней
Крыс третьей группы начинали подвергать воздействию вещества без всякой предварительной подготовки, за исключением отбора животных по поведению их в камере условных рефлексов в первый день. После угашения ориентировочного рефлекса при помещении животных в затравочную камеру приступили к выработке условного рефлекса на звук, а в дальнейшем обычным методом вырабатывали положительные и тормозной условные рефлексы, т. е. вырабатывали стереотип на фоне воздействия вещества. Применение данного варианта позволяет судить о появлении, закреплении и выпадении положительных рефлексов, а также о процессах внутреннего торможения по сравнению с контрольной группой. Подготовка занимает 1—2 дня, т. е. практически отсутствует.
Период воздействия вещества на животных с заранее сформированным стереотипом продолжался 4 месяца и 13 дней, а по укороченным методикам—2 месяца.
Изменения условнорефлекторной деятельности от воздействия бензина в концентрации 0,02 мг/л у животных с предварительно сформированным стереотипом можно проследить на примере отдельных животных.
Контрольная группа (рис. 1). Крыса № 2 — ни одного случая выпадения рефлекса, правильные силовые взаимоотношения с единичными фазовыми состояниями. Плохо закрепленная дифференцировка усилилась, имели место три единичных срыва. Один случай последовательного торможения. Аналогичные результаты имели место и у остальных животных этой группы. Следовательно, у контрольной группы не было существенных изменений условнорефлекторной деятельности. Отдельные отклонения всегда могут иметь место, так как добиться идеальной четкости в работе у крыс чрезвычайно трудно.
-обул ——свет -Ь срыИ дифсреренцироВки
Рис. 1. Изменения условнорефлекторной деятельности у крысы с предварительно сформированным стереотипом. Контроль.
Опытная группа (рис. 2 и 3). Крыса № 10 — сильный уравновешен ный тип высшей нервной деятельности. Видимые первые изменения появились на 24-й день отравления — выпадение рефлекса на свет. С 36-го дня выпадения рефлекса на слабый раздражитель приобретают стойкий характер. Отсутствие рефлекса на звук за все время опыта встречалось один раз. Во второй половине опыта появилось большое количество фазовых состояний, т. е. резко нарушились силовые взаимоотношения в коре. Стойкое растормаживание дифференцировки появилось к концу 3-го месяца отравления и сохранилось до конца опыта. Кроме того, имелись отдельные случаи последовательного торможения. Полное восстановление функций закончилось на 3-й неделе восстановительного периода.
Крыса № 18 — слабый тип. Первые изменения — вьтадение рефлекса на звук — появились на 3-й неделе отравления. Начиная с 4-й недели и до конца опыта весьма четко были выражены выпадения рефлекса на слабый раздражитель. К концу отравления появились частые выпадения рефлекса на звук. В течение всего периода воздействия вещества имело место большое количество нарушений правильных силовых взаимотношений в корковой деятельности. Через Р/г месяца появились нарушения дифференцировочного торможения, которые сохранялись до конца опыта. Восстановительный период продолжался 3 недели.
Из представленных материалов видно, что изменения условнорефлекторной деятельности у животных с заранее сформированным стерео-
типом возникают на 3—4-й неделе отравления за счет нарушения раздражительного процесса, главным образом наркотических фаз. Кроме того, имеют место нарушения правильных силовых взаимоотношений в коре головного мозга. Изменения внутреннего торможения возникают позднее, через Р/г—2 месяца с момента начала воздействия вещества.
Рис. 2. Изменения условнорефлекторной деятельности у крысы с предварительно сформированным стереотипом. Опыт.
Рис. 3. Изменения условнорефлекторной деятельности у крысы с предварительно сформированным стереотипом. Опыт.
Восстановление функций коры головного мозга полностью заканчивается через 2—3 недели после прекращения отравления. Характер изменений у всех животных опытной группы в основном аналогичный. При проведении опытов на животных с предварительно выработанными двумя положительными рефлексами каждый опыт исследования условных рефлексов заключался в подаче сильного и слабого положительных раздражителей в период отравления: один звонок и один свет (первый
звонок не фиксировался). Учитывали латентный период и величину рефлекса.
У контрольной группы, как это видно на примере крысы № 21, отклонений от нормальной деятельности не было (рис. 4).
Совершенно иной характер приобретает условнорефлекторная деятельность у подопытных животных (рис. 5 и 6). Первые изменения — выпадения рефлекса на свет — у крысы № 26 появились на 9-й день отравления, у крысы № 28— на 7-й день. В дальнейшем изменения раздражительного процесса усилились и появилось стойкое выпадение рефлексов. Одновременно отмечались нарушения правильных силовых взаимоотношений в коре головного мозга.
Как видно из приведенных данных, у животных этой группы имелись явно выраженные изме-
| I'
тр
г
тя/лзяадидмлтзб 8 /а и ими 11ЯН4
\юо
%Ч0
нения условнорефлекторной дея-
тельности, характер которых весь-ма сходен с изменениями раздра- |щ жительного процесса у животных | ^ с предварительно выработанным стереотипом. Однако эти изменения появились уже на 7—9-й день
- Монол----сбе/л
__Рис. 4. Изменения условнорефлекторной
с начала отравления значитель- деятельности у крысы с двумя положительно раньше, чем при исследовании ными рефлексами. Контроль, стереотипа. Все животные реагировали на введение бензина примерно одинаково. К сожалению, такой вариант не дает достаточного представления о процессах внутреннего торможения.
31вмвя-----С4е/я
23 2£ № 8 Я М ¿Л
!9 24 я Те ¡о гг //тя
-Моноя----Мел?
Рис. 5. Изменения условнорефлекторной Рис. 6. Изменения условнорефлек-деятельности у крысы с двумя положитель- торной деятельности у крысы
ными рефлексами. Опыт. с двумя положительными рефлек-
сами. Опыт.
При проведении опытов на животных, у которых стереотип вырабатывался на фоне отравления, мы учитывали такие показатели, как время появления и закрепления рефлекса (10 раз подряд нормальная условная реакция) на звук и свет, число выпадений рефлекса за весь период подготовки стереотипа, средние латентный период и величина рефлекса за 10 последних сигналов, а также появление и закрепление
Средние данные по группам Опытная Контрольная Опытная Контрольная С в Е ч X 03 я Контрольная с а Е н X ш а Контрольная Группа животных
о т, со ст> со г со сл 1 со Г со •«ь I со со ю СО № крысы
6,75 о о со о о> О сл СО СП появление рефлекса (число сочетаний) Звонок
о сл о 10,25 ю - а> из ГО 00 ¡о г закрепление рефлексг (число сочетаний)
6,50 2,66 со о 1 - о со число выпадений рефлекса
1,31 1,05 — 1 о ^ ст» О | л 00 1 1,44 1,00 0,94 05'1 средний латентный период, секунды (10 последних раздражителей)
СО •е* о» с» Л I 4Ь 00 сл сл 00 средняя величина рефлекса в условных единицах (10 последних раздражителей)
6,25 со о> со «Л 1 -а со сл ( со появление рефлекса (число сочетаний) О
<о со со со 1 о со о со закрепление рефлекса (число сочетаний)
16,75 6,66 ю сл СП 1 - с* со ю число выпадений рефлекса
2,54 2,66 2,70 2,80 2,82 1 2,10 2,70 2,64 2,50 средний латентный период, секунды (10 последних раздражителей)
39,25 39,33 со <о л. .ь о 1 со СО со со со О) средняя величина рефлекса в условных единицах (10 последних раздражителей)
о> ст> ю со СЛ | со со ю л. 1 00 | о> о * «ь А появление (ЧИсло раздражителей) ■е-$ л 1 X & X ■о о а X »
1 со о> СП 1 эо 1 1 1 1 .1 с оо ; 6 закрепление (число рездражителей)
дифференцировки. Результаты исследований по этим основным показателям представлены в таблице.
Анализ результатов позволяет установить, что в опытной группе по сравнению с контрольной имеется несколько большее число выпадений рефлекса на звук; существенных различий в скорости выработки и закрепления рефлекса на звук, а также в латентном периоде и величине рефлекса установить не удалось. Значительные изменения по сравнению с контрольной группой были выявлены при выработке рефлекса на слабый раздражитель: имелись четкие отставания в появлении и закреплении рефлекса, особенно демонстративно проявилось различие з числе выпадений рефлекса. Отмечалась также существенная разница и закреплении дифференцировки, ее не удалось закрепить ни у одного животного опытной группы.
Выводы
1. Материалы, полученные при сравнении результатов воздействия бензина в концентрации 0,02 мг/л на условнорефлекторную деятельность белых крыс с предварительно сформированным стереотипом и при исследовании по ускоренным методикам, свидетельствуют о том, что последние являются не менее чувствительными. При исследовании только закрепленных двух положительных рефлексов первые изменения появились на 7—9-й день воздействия вещества, тогда как у животных с предварительно сформированным стереотипом — на 3—4-й неделе, т. е. значительно позже. Характер же этих изменений в основном аналогичный.
2. Исследования двух только закрепленных положительных условных рефлексов не дают достаточных представлений о процессах внутреннего торможения в коре головного мозга, что является отрицательным моментом данного варианта методики.
3. Методика выработки стереотипа на фоне воздействия вещества позволяет судить о скорости выработки и прочности как положительных, так и тормозного условных рефлексов у животных опытной группы по сравнению с контрольной. В данном варианте можно получить более полное представление по сравнению с вариантом применения двух положительных рефлексов об изменениях высшей нервной деятельности животных. Однако при этом необходимо иметь достаточное количество животных и полученные цифровые данные подвергать статистической обработке для проверки достоверности результатов исследований.
4. Работа по методам ускоренного изучения влияния токсических веществ на условнорефлекторную деятельность значительно сокращает время эксперимента; для подготовки животных с двумя только закрепленными положительными рефлексами требуется 7—10 дней, а при выработке стереотипа на фоне воздействия вещества подготовительный период практически отсутствует.
5. На основании литературных данных и результатов наших исследований можно полагать, что метод ускоренного изучения условнорефлекторной деятельности может найги применение в комплексе методов токсикологического исследования с целью получения экспериментальных материалов для гигиенического нормирования промышленных химических веществ.
ЛИ ТЕРАТУРА
Голубев А. А. Труды научной сессии Ленинградск. ин-та гигиены труда и профессиональных заболеваний, посвящ. итогам работы за 1956 г. Л., 1958, стр. 231. — Григорьев 3. Э. Фармакол и ток<.икол., 1960, № 1, стр. 84.— Лукомская Н. Я. В кн.: Физиологическая роль ацетилхолина и изыскание новых лекарственных веществ. Л., 1957, стр. 65. — Саватеев Н. В. Там же, стр. 40. — С ю й Б и н. Фармакол. и токсикол., 1956, т. 19, № 3, стр. 33.
Поступила 10/1II 1961 г.
-¿Г -ЙГ -¿Г
