CC BY
34
УДК / UDC 634.723.1:631.526.32:631.52:061.62 (470.319) ВНИИСПК:57.085.2
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO СОРТОВ СМОРОДИНЫ ЧЁРНОЙ СЕЛЕКЦИИ ВНИИСПК
SOME ASPECTS OF INTRODUCTION INTO IN VITRO CULTURE OF BLACK CURRANT VARIETIES (RIBES NIGRUM L.) OF THE RUSSIAN RESEARCH INSTITUTE OF FRUIT CROP BREEDING
Хромова T.M.*, младший научный сотрудник Khromova T.M., Junior Researcher Ташматова Л.В., кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Tashmatova L.V., Candidate of Agricultural Sciences, Senior Researcher Мацнева O.B., научный сотрудник Mazneva O.V., Scientific Researcher Шахов B.B., младший научный сотрудник Shakhov V.V., Junior Researcher ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, Орловская область, Россия Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Orel Region, Russia
*E-mail: hromova@vniispk.ru
В настоящее время метод кпонального размножения растений in vitro широко используется в системе ускоренного производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур. Для получения безвирусного материала часто применяется одна из моделей кпонального микроразмножения - индукция развития меристем из почек. Успех этапа инициации культуры in vitro во многом определяется полнотой освобождения растительного материала от источников заражения меристем и питательной среды. В данной статье представлены результаты исследований по введению смородины чёрной в культуру in vitro, а также рассмотрена эффективность использования различных стерилизующих веществ (0,1% раствор сулемы, 0,1% раствор мертиолата). Объектами исследования являются сорта смородины чёрной селекции ВНИИСПК: Ажурная, Орловская серенада, Очарование, Чудное мгновение. Введение в культуру in vitro осуществлялось в весенний (март), летний (июнь) и осенний (начало сентября) сроки введения. Исходным материалом в весенний и осенний период служили изолированные почки с однолетних одревесневших побегов. В летний период введения источниками эксплантов служили почки растущих зелёных побегов. Культивирование проводилось на модифицированной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л. Отмечено, что на приживаемость эксплантов оказывают влияние сортовые особенности, период введения в культуру, происхождение экспланта и тип стерилизующего агента. Выход жизнеспособных эксплантов оказался выше при использовании 0,1% раствора сулемы, однако этот показатель отличался в зависимости от периода введения и генотипических особенностей сортов. В варианте с использованием 0,1% раствора мертиолата отмечается различие между приживаемостью эксплантов из верхушечных и боковых почек: приживаемость первых выше (56-66%), чем вторых (28-52%). При стерилизации 0,1% раствором сулемы различия показателей приживаемости между эксплантами различного происхождения менее выражены.
Ключевые слова: чёрная смородина, стерилизующий агент, приживаемость, контаминация, тип экспланта.
Currently, the method of clonal plant propagation in vitro is widely used in the system of accelerated production of healthy planting material of fruit and berry crops. To obtain virus-free material, one of the models of clonal microproduction - induction of meristem development from the buds is often used. The success of the stage of culture in vitro initiation is largely determined by the completeness of the release of plant material from the sources of infection
of meristems and nutrient medium. This article presents the results of studies on the introduction of black currant in the culture in vitro, as well as the effectiveness of the use of various sterilizing agents (0.1% solution of sulema, 0.1% solution of mertiolate). Varieties of black current of the Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding: Azhurnaya, Orlovskaya serenada, Ocharovanie, Chudnoe mgnovenie are promising objects of the research. Introduction to culture in vitro was carried out in spring (March), summer (June) and autumn (early September) dates of introduction. The source material in the spring and autumn period was presented with the isolated buds from annual lignified shoots. During summer period, the main sources of explants were growing green shoots buds. The cultivation was carried out on a modified environment Murashige-Skuga with the addition of 6-BAP at a concentration of 0.5 mg / l. It was noted that the survival rate of explants is influenced by varietal characteristics, the period of introduction into culture, the origin of the explant and the type of sterilizing agent. The yield of viable explants was higher when using 0.1% sulema solution, but this figure differed depending on the period of administration and genotypic characteristics of varieties. In the variant using 0.1% mertiolate solution, there is a difference between the survival rate of explants from the apical and lateral buds: the survival rate of the first is higher (56-66%) than the second (28-52%). When sterilized with 0.1% sulema solution, the differences in survival rates between explants of different origin are less pronounced.
Key words: black currant, initiation efficiency, survival, sterilizing agent, type of explants.
Введение. В настоящее время метод клонального размножения растений in vitro широко используется в системе ускоренного производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур. Для получения безвирусного материала часто применяется одна из моделей клонального микроразмножения - индукция развития меристем из почек [1]. Она включает в себя несколько этапов: выбор растения-донора, изолирование эксплантов (введение в культуру in vitro), получение хорошо растущей стерильной культуры; собственно микроразмножение и получение максимального количества мериклонов; укоренение размноженных побегов in vitro и адаптация пробирочных растений к почвенным условиям [2].
Многолетние исследования показали, что реализация регенерационного потенциала растительных организмов на всех этапах культивирования зависит от влияния генетических, физиологических, химических и физических факторов культивирования [2-8].
Целью исследований являлось изучение развития эксплантов сортов чёрной смородины селекции ФГБНУ ВНИИСПК на начальном этапе клонального микроразмножения в зависимости от типа стерилизующего вещества, происхождения эксплантов, генотипических особенностей сортов и срока введения в культуру.
Условия, материалы и методы. Объекты исследований/ перспективные сорта смородины чёрной среднего срока созревания селекции ВНИИСПК: Ажурная, Орловская серенада, Очарование, Чудное мгновение.
Исследования проводились согласно общепринятым методикам [9, 10].
Введение в культуру in vitro осуществлялось в весенний (март), летний (июнь) и осенний (начало сентября) сроки введения.
Исходным материалом в весенний и осенний период служили изолированные почки с однолетних одревесневших побегов. В весенний период побеги помещали в сосуд с водой и выдерживали при комнатной температуре до состояния зелёного конуса. В осенний период исходным материалом являлись закрытые верхушечные почки. В летний период введения источниками эксплантов служили верхушечные почки с растущих зелёных побегов.
Стерилизацию растительного материала проводили по схеме: промывка побегов ^ подготовка почек ^промывание под проточной водой (40-60 мин) ^ обработка 70%-ным раствором этанола (10 с) ^ промывание стерильным дистиллятом (10 мин) ^ обработка основным стерилизующим агентом (5 или 10 мин) ^ 3-кратное промывание стерильным дистиллятом (по 10 мин).
Используемые стерилизаторы:
- мертиолат (C9H9HgNaO2S) в концентрации 0,1%, экспозиция 10 мин;
- ртуть двухлористая (сулема) HgCl2 в концентрации 0,1%, экспозиция 10 мин.
После стерилизации экспланты помещались в раствор аскорбиновой
кислоты (3 г/л) с целью снижения эффекта «фенольного облака».
После вычленения экспланты высаживались на среду Мурасиге-Скуга с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л, аскорбиновой кислоты 10 мг/л, тройного количества хелата железа. pH среды 6,0.
Культивирование эксплантов проводилось при освещённости 2000-2500 лк, температуре 23°С, фотопериоде 16/8 ч.
Результаты и обсуждение. В проводимых экспериментах отмечено, что на эффективность инициации культуры in vitro оказывают влияние сортовые особенности, сроки введения в культуру, происхождение эксплантов и стерилизующие вещества.
При использовании 0,1% раствора сулемы в весенний период наибольший выход неинфицированных эксплантов показали сорта Ажурная, Орловская серенада и Очарование.
При стерилизации 0,1% раствором мертиолата в весенний период количество жизнеспособных эксплантов составило по исследуемым сортам 20-58%, доля инфицированных растений была относительно высокой - 10-17%.
В обоих вариантах стерилизации в весенний период некроз отмечался у 18-69% эксплантов, что связано, видимо, с особенностями физиологии и морфологии почек в данный период вегетации.
В летний период стерилизация 0,1% раствором сулемы оказалась эффективна для всех сортов, приживаемость составила 66-83%. Наиболее эффективным летний период оказался для сортов Ажурная (83,4%), Очарование (81,8%), наименее - для сорта Чудное мгновение (66,0%). Контаминация была выше, чем в весенний период и составила от 2% у сорта Очарование до 5% у сортов Орловская серенада и Чудное мгновение.
В летний период эффективность от использования 0,1% раствора мертиолата оказалась несколько ниже: наибольшее количество жизнеспособных эксплантов отмечено у сорта Чудное мгновение (86%), минимальное - у сорта Орловская серенада (45%). Инфицированность растений была ниже, чем в весенний период у сортов Ажурная и Очарование. У сорта Орловская серенада доля заражённых эксплантов оказалась самой высокой (32%).
Большое число погибших эксплантов в обоих вариантах (4-29%) объясняется открытостью меристем и жёстким воздействием стерилизующих агентов на растительные ткани.
В осенний период стерилизация 0,1% раствором сулемы оказалась наиболее эффективной для сорта Орловская серенада (88%), наименее - для сорта Чудное мгновение (40%). Наименьшая контаминация отмечалась у сорта Ажурная (3,5%), в то время как у остальных сортов колебалась в пределах 4-8%. Доля погибших эксплантов оказалась высокой у сортов Ажурная, Очарование и Чудное мгновение (23-52%).
Эффективность стерилизации 0,1% раствором мертиолата в осенний период достигла 96%, наименьшее количество жизнеспособных эксплантов отмечалось у сорта Очарование (71%). Доля зараженных эксплантов составила 2-9%, погибших эксплантов - 2-24% (табл. 1).
Таблица 1 - Результативность введения в культуру эксплантов при применении различных стерилизующих веществ в зависимости от периода введения и сортовых особенностей, 2018-2019 гг._
Сорт Показатели жизнеспособности 0,1% сулема 0,1% мертиолат
весна лето осень весна лето осень
Ажурная Некроз, % 18,0 12,7 23,1 36,0 17,0 10,9
Контаминация, % 4,0 3,9 3,5 17,0 3,1 5,6
Доля жизнеспособных эксплантов, % 78,0 83,4 73,4 47,0 79,9 83,5
Орловская серенада Некроз, % 21,0 16,1 7,7 26,0 22,6 2,5
Контаминация, % 3,0 5,1 4,3 16,0 32,0 2,0
Доля жизнеспособных эксплантов, % 77,0 78,8 88,0 58,0 45,4 95,5
Очарование Некроз, % 28,0 16,2 34,4 50,0 14,5 24,3
Контаминация, % 1,0 2,0 4,9 10,0 6,3 4,7
Доля жизнеспособных эксплантов, % 71,0 81,8 60,7 40,0 79,2 71,0
Чудное мгновение Некроз, % 53,0 29,0 52,1 69,0 4,0 8,6
Контаминация, % 2,0 5,0 7,6 11,0 10,5 2,9
Доля жизнеспособных эксплантов, % 45,0 66,0 40,3 20,0 85,5 88,5
Исследования особенностей развития эксплантов различного происхождения проводились в весенний период. Отмечалось, что пазушные и верхушечные почки сходны между собой морфологически. Почки имели мелкие меристемы, располагающиеся по периферии. Большую часть почки занимали зачаточные цветки. Для предотвращения травмирования меристем бутоны не удалялись. По мнению Д.Н. Сковородникова и Ф.Ф. Сазонова (2011), сохранение цветоносов не влияло на развитие регенеранта. Однако, в наших исследованиях, сохранение фрагментов зачаточных соцветий вызывало их разрастание, деформацию и некроз. Развитие таких эксплантов происходило неравномерно: часть меристем погибала, часть сохраняла регенерационные способности.
Наличие в почках более одной меристемы обусловило формирование у части эксплантов нескольких регенерантов одновременно.
Показатели жизнеспособности эксплантов при применении различных стерилизующих веществ в зависимости от происхождения экспланта представлены в таблице 2. Приживаемость эксплантов, полученных как из боковых, так и из верхушечных почек, высокая у сортов Ажурная, Орловская серенада и Очарование. При этом при стерилизации раствором 0,1% сулемы количество жизнеспособных эксплантов выше, чем при стерилизации 0,1% раствором мертиолата. В варианте с использованием раствора мертиолата отмечается различие между приживаемостью эксплантов из верхушечных и боковых почек: приживаемость первых выше (56-66%), чем вторых (28-52%). При стерилизации 0,1% раствором сулемы различия показателей приживаемости между типами эксплантов менее выражены. Исключение составляет сорт Чудное мгновение, для которого приживаемость при стерилизации 0,1% раствором мертиолата в обоих вариантах составляет 20%, а при обработке 0,1% раствором сулемы количество жизнеспособных эксплантов из пазушных почек больше в 2,1 раза.
Таблица 2 - Результативность введения в культуру эксплантов при применении различных стерилизующих веществ в зависимости от происхождения экспланта и сортовых особенностей в весенний период, 2019 г._
0,1% сулема 0,1% мертиолат
Сорт Показатели жизнеспособности .0 -о 5 Р И S ! .0 ф m н о о .0 -о 5 Р И S ! .0 ф m н о о
о. Ш ф ^ m ф О LO Ф 5 о. ф ф ^ m ф О LO Ф 5
Некроз, % 26,7 12,0 40,0 34,0
Ажурная Контаминация, % 0,0 6,0 4,0 24,0
Доля жизнеспособных эксплантов, % 73,3 82,0 56,0 42,0
Некроз, % 19,0 22,0 27,0 26,0
Орловская Контаминация, % 0,0 4,0 7,0 22,0
серенада Доля жизнеспособных эксплантов, % 81,0 74,0 66,0 52,0
Некроз, % 32,0 26,0 37,0 58,0
Очарование Контаминация, % 4,0 0,0 3,0 14,0
Доля жизнеспособных эксплантов, % 64,0 74,0 60,0 28,0
Некроз, % 71,0 43,0 73,0 66,0
Чудное Контаминация, % 3,0 2,0 7,0 14,0
мгновение Доля жизнеспособных эксплантов, % 26,0 55,0 20,0 20,0
Во всех вариантах опыта высокая доля погибших эксплантов отмечается у сорта Чудное мгновение: 43-71% и 66-73%.
Доля инфицированных эксплантов в вариантах с использованием 0,1% раствора сулемы и 0,1% раствора мертиолата при введении меристем из верхушечных почек не превысила 7%. Наибольшая контаминация отмечалась на боковых меристемах в варианте с применением 0,1% раствора мертиолата (14-24%).
Выводы. Из исследуемых факторов культивирования при введении в культуру смородины чёрной наиболее существенное влияние оказывают генотипические особенности и сроки изоляции.
Применение стерилизующих агентов не имело решающего влияния на эффективность введения в культуру.
В зависимости от срока изоляции в качестве источника эксплантов рекомендуется использовать в летний период верхушечные почки с растущих зелёных побегов, в весенний и осенний периоды - меристемы из почек с удалёнными бутонами.
В весенний период источником меристем могут быть боковые почки с однолетних одревесневших побегов.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в современном садоводстве // Плодоводство и ягодоводство России. 2011. Т. 26. С. 3-10.
2. Кпональное размножение растений чёрной смородины (Ribes nigrum L.) in vitro / Г.К. Оразбаева [и др.] // Вестник науки КазАТУ им. С. Сейфуллина. 2012. № 1(72). С. 115-124.
3. Ишмуратова М.М. Размножение сортов смородины чёрной (Ribes nigrum L.) башкирской селекции в культуре in vitro // Вестник Удмуртского университета. Серия «Биология. Науки о Земле». 2017. Т.27. Вып. 4. С. 455-461.
4. Колбанова Е.В. Клональное микроразмножение смородины черной сорта Санюта // Плодоводство и ягодоводство России. 2011. Т. 26. С. 222-229.
5. Влияние минерального состава питательной среды на морфогенез садовых растений in vitro / O.B. Матушкина [и др.] // Достижения науки и техники АПК. 2014. № 1. С. 41-42.
6. Мацнева О.В. Эффективность применения стерилизующих агентов для эксплантов земляники // Селекция и сорторазведение садовых культур. 2018. Т. 5. № 1. С. 71-73.
7. Семенас С.Э. Методика кпонального микроразмножения сортов земляники // Плодоводство: сборник научных трудов Белорусского НИИП. 2000. Т. XXII. С. 138-145.
8. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха [и др.]. М.: Высшая школа. 1998. 416 с.
9. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / E.H. Джигадло, М.И. Джигадло, Л.В. Голышкина; [под ред. E.H. Джигадло]. Орел: Изд-во ВНИИСПК 2005. 49 с.
10. Размножение плодовых и ягодных растений в культуре in vitro / H.B. Кухарчик, М.С. Кастрицкая, С.Э. Семенас [и др.]; [под общ. ред. Н.В. Кухарчик]. Минск: Беларуская навука. 2016. 208 с.
11. Сковородников ДН. Особенности кпонального микроразмножения смородины черной // Плодоводство и ягодоводство России. 2011. Т. 26. С. 396-400.
12. Шахов В.В. Сравнительная характеристика сроков введения эксплантов чёрной смородины (Ribes nigrum L.) в культуру in vitro // Современное садоводство -Contemporary horticulture. 2017. № 4. С. 102-105.
REFERENCES
1. Vysotskiy V.A. Biotekhnologicheskie metody v sovremennom sadovodstve // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2011. T. 26. S. 3-10.
2. Klonalnoe razmnozhenie rasteniy chernoy smorodiny (Ribes nigrum L.) in vitro / G.K. Orazbaeva [i dr.] // Vestnik nauki KazATU im. S. Seyfullina. 2012. № 1(72). S. 115-124.
3. Ishmuratova M.M. Razmnozhenie sortov smorodiny chernoy (Ribes nigrum L.) bashkirskoy selektsii v kulture in vitro // Vestnik Udmurtskogo universiteta. Seriya «Biologiya. Nauki o Zemle». 2017. T.27. Vyp. 4. S. 455-461.
4. Kolbanova Ye.V. Klonalnoe mikrorazmnozhenie smorodiny chernoy sorta Sanyuta // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2011. T. 26. S. 222-229.
5. Vliyanie mineralnogo sostava pitatelnoy sredy na morfogenez sadovykh rasteniy in vitro / O.V. Matushkina [i dr.] // Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2014. № 1. S. 41-42.
6. Matsneva O.V. Effektivnost primeneniya sterilizuyushchikh agentov dlya eksplantov zemlyaniki // Selektsiya i sortorazvedenie sadovykh kultur. 2018. T. 5. № 1. S. 71-73.
7. Semenas S.E. Metodika klonalnogo mikrorazmnozheniya sortov zemlyaniki // Plodovodstvo: sbornik nauchnykh trudov Belorusskogo NIIP. 2000. T. XXII. S. 138-145.
8. Selskokhozyaystvennaya biotekhnologiya / V.S. Shevelukha [i dr.]. M.: Vysshaya shkola. 1998. 416 s.
9. Metodicheskie rekomendatsii po ispolzovaniyu biotekhnologicheskikh metodov v rabote s plodovymi, yagodnymi i dekorativnymi kulturami / Ye.N. Dzhigadlo, M.I. Dzhigadlo, L.V. Golyshkina; [pod red. Ye.N. Dzhigadlo]. Orel: Izd-vo VNIISPK. 2005. 49 s.
10. Razmnozhenie plodovykh i yagodnykh rasteniy v kulture in vitro / N.V. Kukharchik, M.S. Kastritskaya, S.E. Semenas [i dr.]; [pod obshch. red. N.V. Kukharchik]. Minsk: Belaruskaya navuka. 2016. 208 s.
11. Skovorodnikov D.N. Osobennosti klonalnogo mikrorazmnozheniya smorodiny chernoy // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2011. T. 26. S. 396-400.
12. Shakhov V.V. Sravnitelnaya kharakteristika srokov vvedeniya eksplantov chernoy smorodiny (Ribes nigrum L.) v kulturu in vitro // Sovremennoe sadovodstvo -Contemporary horticulture. 2017. № 4. S. 102-105.
