CC BY
178
НТП: животноводство и кормопроизводство
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ ЖИВОТНЫХ
Л.К ЭРНСТ, академик РАСХН, вице-президент РАСХН В А БАГИРОВ, доктор биологических наук, ученый секретарь Отделения зоотехнии Россельхозакадемия Е.К. ТОМГОРОВА, аспирант Г.Н. СИНГИНА, кандидат биологических наук, зав. лаборатории
НА ВОЛКОВА кандидат биологических наук, зав. лаборатории
НА ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН, зам. директора ВНИИ животноводства И.Н. ЧАУІ11ЕВ, доктор медицинский наук Карачаево- Черкесский филиал Российского научного центра хирургии имени акад. Б.В. Петровского РАМН АН ЧАУШЕВА, кандидат медицинских наук Медико-генетический центр РАМН E-mail: [email protected]
УДК 573.6:636
Резюме. Рассмотрены некоторые аспекты использования клеточной инженерии в животноводстве. Представлены результаты собственных исследований по разработке технологии получения трансгенной ггтицы, оптимизации техники переноса соматических клеток в рамках разработки технологии клонирования, а также о влиянии различных факторов на эмбриональное развитие животных. Ключевые слова: клеточная инженерия, трансгенез, ретровирусные векторы, трансгенные животные, примордиальные зародышевые клетки, эмбрионы.
синтезировать только клетки позвоночных [3, 5, 6]. По оценкам специалистов, при экспрессии рекомбинантного белка на уровне 2 мг/мл, стоимость 1 г сырого белка составляет около 350 руб., что в 10-100 раз ниже, чем при его производстве другими известными способами [2].
Однако сознание трансгенных птиц затруднено особенностями их репродуктивной биологии, что требует поиска новых альтернативных решений. В этой связи мы изучили возможность использования ретровирусных векторов и примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) для генетической модификации эмбрионов кур. В первом случае в качестве векторов для доставки ДНК в эмбриональные клетки были использованы генные конструкции на основе модифицированных ретровирусов, содержащие репортерные гены (lacZn GFP) и структурные гены человека (ген гормона роста и инсулина).
Компетентность эмбриональных клеток кур к ретровирусным генным конструкциям была показана в экспериментах как in vitro, так и in vivo. В последнем случае общая эффективность трансгенеза (отношение полученных трансгенных кур к общему числу проиньецирован-ных эмбрионов, выраженное в процентах) достигала 6,0...8,7 % в зависимости от генной конструкции (табл. 1). На величину этого показателя существенно влияли такиефакгоры, как стадия введения и тип подготовки генных конструкций; концентрация, объем и состав раствора генных конструкций. Более высокая эффективность трансгенеза установлена при введении ретровирусных векторов в эмбрионы кур (в дорсальную, аорту) на третий день эмбриогенеза. При этом более результативным оказалось использование в качестве источника генных кон-
Таблица 1. Введение ретровирусных векторов в эмбрионы кур ш vivo.
В последние годы достигнут значительный прогресс в развитии клеточной инженерии в животноводстве. Это связано как с разработкой эффективных методов генетической трансформации клеток животных, так и способов их реконструирования.
Разработка технологии получения трансгенной птицы. Генетическая модификация животных рассматривается сегодня как наиболее перспективный метод синтеза биологически активных белков, способный стать альтернативой традиционным методам получения рекомбинантных белков человека. Трансгенные птицы открывают новые юз- Примечание: * — отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрио-можности для их производ- нов к числу развившихся эмбрионов %; ** — отношение числа полученных транс-ства, включая белки со слож- генных цыплят и эмбрионов, к числу инъецированных яиц; ***— отношение числа ной структурой, которые могут вылупившихся трансгенных цыплят к числу инъецированных яиц.
Генная конструки ия
Показатель pBMN- pLN- рХ- рХ- Контроль
lacZ GFP Ins RSVhgh
Ген р-галак- тозидаза зеленый белок инсулин гормон роста
Проинъецировано эмбрио-
нов, п 100 80 100 100 50
Введено клеток:
объем, мкл 1 1 1 1
(концентрация, кл./мкл) (1000) (1000) (1000) (1000) -
Развилось эмбрионов, п 62 56 70 68 45
<%) (62,0) (70,0) (70,0) (68,0) (90,0)
в том числе трансгенных, п 43 38 47 42 -
Вылупилось цыплят,п 12 15 16 17 38
(%) (12,0) (18,8) (16,0) (17,0) (76,0)
в том числе трансгенных, п 8 7 6 8 -
Частота интеграции", % 69,4 67,9 67,1 61,8 -
Общая эффективность
трансгенеза ", % 43,0 47,5 47,0 42,0 -
Эффективность получения
трансгенных кур% 8,0 8,7 6,0 8,0 -
струкций суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 500... 1000 клеток/эмбрион.
С помощью ретровирусных векторов были получены трансгенные куры с интеграцией и экспрессией трансгенов в различных органах и тканях, в частности, в клетках сердца, печени, мышц, кишечника, желудка и репродуктивных органах.
Для изучения механизмов доставки рекомбинантной ДНК в эмбрионы кур посредством использования примордиальных зародышевых клеток мы оптимизировали методы выделения, поддержания в культуре, криоконсервации и генетической трансформации этих клеток и отработали способ их введения в эмбрионы кур.
Наибольший выход жизнеспособных клеток (до 95 %) наблюдается при использовании в качестве протеолитического фермента трипсина в концентрации 0,05 %. При этом оптимальное время для выделения ПЗК 7...8 дни эмбриогенеза. В этом случае удается получить в 3-4 раза больше клеток, чем из эмбрионов на более ранних стадиях развития. Для длительного сохранения жизнеспособности ПЗК в культуре важны такие параметры, как наличие фидерных слоев и ростовая среда (применяемая при культивировании ЭСК) с высоким содержанием сыворотки плода коровы (15 %) и глюкозы (4,5 г/л), а также с добавлением «-глутамина (2 мМ) и 2-меркаптоэтанола (Ю-6 мМ). При этом наиболее предпочтительно использование в качестве криопротектора ДМСО.
Самый эффективный метод генетической трансформации ПЗК — электропорация. В случае ее применения наибольшая эффективность переноса рекомбинантной ДНК (до 34 %) достигается при использовании гипоосмолярного буфера и кратковременного воздействия на клетки электрического тока с параметрами 360 В и 80 мкФ. При этом эффективность трансформации эмбрионов кур зависит от количества вводимых ПЗК. Оптимальная концентрация с точки зрения трансгенеза — 300...400 клеток на эмбрион.
Оптимизация техники переноса ядер соматических клеток в рамках разработки технологии клонирования. Техника переноса ядер соматических клеток с использованием в качестве цигопласта ооцитов крупного рогатого скота с самого начала базировалась на методических приемах оплодотворения in vitro. Однако в связи с тем, что отдельные принципиальные положения клонирования не прошли испытания временем, ученые занятые этой проблемой, вновь вынуждены возвращаться к изучению каждого этапа клонирования.
Технология переноса ядер включает нескольких этапов, каждый из которых определяет общую эффективность. В частности, получение ооцитов, при-
годных для энуклеации, их синхронизация и собственно клонирование.
Для получения ооцитов, пригодных для энуклеации необходима оптимизация времени их культивирования. Мы установили, что показатель нормы созревания (выделения первого полярного тельца) ооцитов коров возрастает с увеличением продолжительности их культивирования и достигает максимального значения на 24 час культивирования, после чего отмечается тенденция к его снижению. Такая ситуация связана, прежде всего, с постепенным разрушением первого полярного тельца вследствие старения яйцеклетки (табл. 2). Поэтому оптимальный пе-
риод д ля энуклеации ооцитов крупного рогатого скота — 20..,24 ч после постановки их на созревание. Причем для получения максимальной доли ооцитов с оптимально расположенными метафазными хромосомами относительно первого полярного тельца необходимо добавление в среду для культивирования эст-радиола и эпидермального фактора роста (EGF) в концентрациях 1 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно.
Наряду с получением ооцитов, пригодных для энуклеации, существенный аспект технологии клонирования — сохранение пловдии реконструированного эмбриона и создание условий, необходимых д ля нормальной регуляции экспрессии генов во времени и пространстве. Основополагающий фактор при этом — стадия клеточного цикладонора и реципиента, а также взаимодействие между ними. Нормальное развитие реконструированного ооцита возможно при проведении манипуляций с клетками на стадии G0. Существует несколько способов синхронного выведения соматических клеток в культуре на стадию G0/G1. Наиболее распространен метод снижения концентрации сыворотки в культуральной среде или ее полное исключение. При этом д ля каждой конкретной культуры животной клетки необходимо определенное содержание сыворотки (0...5 %) и продолжительность культивирования. Мы оптимизировали метод сывороточного голодания для культуры фибробластов кожи человека Для этого была проведена оценка двухфакторного режима «голодания» клеток, включающая различные концентрации сыворотки и время синхронизации. Установлено, что для получения высокой доли синхронизи-
Таблица 2. Норма созревания ооцитов крупного рогатого скота, дозревших in vitro, и общая результативность получения ооцитов, пригодных для энуклеации в зависимости от времени, прошедшего с момента постановки на созревание в среде ТС199.
Время Число Норма созрева- Норма созревания Общая результатив-
созрева- ооци- ния ооцитов с ооцитов с ПНТ+МІІ, ность получения
ния тов, п ПНТ", % (п) %**(п) ооцитов ПНТ + МП, %***
18 120 34,16+4,33 (41) 80,48±6,19 (33) 27,50±4,08
20 117 55,5+4,60 (75) 90,66±3,36 (68) 58,12+4,56
22 120 60,0±4,47 (72) 93,05+3,00 (67) 55,83±4,54
24 120 65,8+4,33 (79) 62,02±5,46 (49) 40,85±4,49
26 118 65,2±4,39 (77) 45,45+ 5,68 (34) 28,81 ±4,17
28 114 56,14+4,65 (64) 28,12±5,62 (17) 14,91+3,34
* ПНТ — первое направительное тельце, МІІ — метафаза II, ** — доля ооцитов с ПНТ + МІІот числа ооцитов с ПНТ, *** — доля ооцитов с ПНТ + МІІот числа ооцитов, поставленных на созревание.
рованных клеток необходимо их культивирование в без-сывороточной среде в течение 2 дней.
Изучение возможности слияния синхронизированных фибробластов кожи человека (используемых в качестве кариопласта) с ксеногенным цитопластом (ооцитами коров) показало, что эффективность получения цитогибрида зависит от метода энуклеации/ пересадки и параметров электрослияния. Наилучшие результаты зафиксированы при использовании для энуклеации/пересадки одновременно двух пипеток: с помощью одной проводили энуклеацию, а другую использовали для переноса соматической клетки (двухступенчатый метод). При этом наибольшая эффективность объединения цитопласта ооци-та крупного рогатого скота после его энуклеации и кариопласта соматической клетки человека (фиб-робласт кожи) методом электрослияния наблюдалась при использовании импульса в 2,0 kV/cm.
Изучение влияния факторов, продуцируемых пре-димплантационными эмбрионами, на эмбриональное развитие животных. Поддержание воспроизводительных функций сельскохозяйственных животных — одна из актуальнейших задач сельскохозяйственной биологии и биотехнологии. Известно, что у крупною рогатого скота эмбриональная смертность в среднем достигает 30 %. Повысить эмбриональную выживаемость пытаются различными способами. Один из них — воздействие на био-логическиеактивныеточки материнского организма кондиционными эмбриональными средами, получаемыми в процессе технологии экстракорпорального оплодотворения ооцитов сельскохозяйственных животных путем сбора среды культивирования эмбрионов.
Мы установили эмбриотропный эффект такой кондиционной эмбриональной среды на эмбриогенез у крупного рогатого скота. При ее введении в малых дозах в биологически активные точки коров в период стельности удалось снизить эмбриональную смертность на 24,6 %. Это в определенной степени, согласуется с результатами исследователей, устано-
вивших повышение компетентности ооцитов к оплодотворению, последующему дроблению и выживанию при использовании кондиционных клеточных и эмбриональных сред в программах по экстракорпоральному оплодотворению [1,4].
Сохранение генетических ресурсов. Возможность использования эпидидимального семени разных видовживотных с целью получения потомства была доказана Ивановым И.И, Эрнстом Л.К, Шайдуллиным И.Н. и другими исследователями [цит. по 7].
Мы разработали технологию получения и криоконсервации эпидидимального семени разных видов животных, которая позволяет получать максимальное количество эпидидимальных сперматозоидов. С ее помощью создан не имеющий мировых аналогов криобанк генетического материала, который дает возможность использовать уникальную коллекцию генофонда самцов-производителей неограниченное время. Сейчас в криобанке семени животных Центра биотехнологии и молекулярной диагностики имеется семя зубра Алтайской популяции, архара Памирской популяции, овцебыка Таймырской популяции, яка Алтайской, Кабардино-Балкарской и Памирской популяций, сибирского козерога Алтайской популяции, снежного барана Якутской популяции, сайгака Калмыцкой популяции. Кроме того, создан банк семени 25 пород крупного рогатого скота, 5 пород свиней, 7 пород овец и 5 пород кроликов.
С использованием замороженной эпидидималь-ной спермы яка от коров получены гибридные потомки. Цитогенетический анализ этих животных не выявил каких-либо конституциональных аномалий хромосомного набора. Биохимические показатели крови также были в пределах нормы, за исключением содержания альбуминов и фосфора, уровень которых у гибридных животных был достоверно (р<0,05) выше, чем у сверстников.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ(07-08-13652, 08-04-13701, 08-08-01061) иРос-науки (ГК№02.512.12.0025, ГК№02.512.11.2094).
Литература.
1. Hill, J.R., R.C. Burghardt, К. Jones et al. Evidence for Placental Abnormality as the Major Cause of Mortality in First-Trimester Somatic Cell Cloned Bovine Fetuses // Biology of Reproduction, 2000, 63, 1787-1794.
2. Ivarie, R. Avian transgenesis: progress towards the promise // Trends Biotechnol. —2003. — V.2I. — P.14-19.
3. Kamihira, MTransgenic birds for the production of recombinant proteins/M.Kamihira, K.Nishijima, S.Iijima // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. - 2004. - V.91. - P. 171-189.
4. O’Doherty, E. М., M.G. Wade, J.L. Hill, M.P. Boland. Effects of culturing bovine oocytes either singly or in groups on development to blastocysts
// Theriogenology, 1997, 48(1), 161-169.
5. Rapp, J. C. Biologically active human interferon alpha-2b produced in the egg white of transgenic hens/J.C. Rapp, A.J.Harvey, G.L.Speksnijder, W. Hu, R.Ivarie// Transgenic Res. — 2003 — V.12. — P.569-575.
6. Sang, H. Prospects for transgenesis in the chick // Mech. Dev. — 2004— V.121. — P.1179-1186.
7. Багиров B.A., Эрнст Л.К., Кленовицкий П.М., Зиновьева Н.А. Сохранение генетических ресурсов редких, исчезающих и уникальных видовживотных//Цитология. — 2004. — т. 46. — с. 767-768.
SOME ASPECTS OF ANIMAL CELL ENGINEERING L.K. Ernst, V.A. Bagirov, E.K. Tomgorova, G.N. Singina, N.A. Volkova, N.A. Zinovieva, I.N. Chaushev, A.I. Chausheva
Summary. Some aspects of the use of cell engineering in animal husbandry are reviewed. The own research data of technology development of transgenic birds producing, optimization of technology of somatic cells transfer in creation of cloning technology, and the impact of various factors on embryo development of animals are proposed.
Keywords: cell engineering, transgenic technology, retroviral vectors, transgenic animals, primordial germ cells, embryos.
