CC BY
11
оригинальные исследования
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ФАРМАКОКИНЕТИКИ НОВОГО АНАЛЬГЕТИКА ИЗ КЛАССА ГЕКСААЗАИЗОВЮРЦИТАНА У КРЫС
УДК 615.033 https://doi.org/10.7816/RCF17451-56
© К.А. Лопатина 1, О.С. Брюшинина1, Р.В. Гурто1, С.Г. Крылова1, Ю.Г. Зюзькова1, Д.А. Кулагина2, Е.А. Сафонова1, Е.П. Зуева 1, С.В. Сысолятин2
1ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск;
2 ФГБУН «Институт проблем химико-энергетических технологий» Сибирского отделения РАН, Бийск
Для цитирования: Лопатина К.А., Брюшинина О.С., Гурто Р.В., и др. Некоторые аспекты фармакокинетики нового анальгетика из класса гексаазаизовюрцитана у крыс // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2019. - Т. 17. -№ 4. - С. 51-56. https://doi.org/10.7816/RCF17451-56
Поступила: 07.10.2019 Одобрена: 12.11.2019 Принята: 18.12.2019
Важным этапом доклинического исследования нового лекарственного средства является изучение его фармакокинетики: всасывания, распределения, метаболизма и выведения лекарственного соединения. Целью настоящего исследования стало изучение фармакокинетики у здоровых животных нового анальгетика на основе гексаазаизовюрцитана (тиовюрцина). Материалы и методы. Разработана и валидирована методика определения концентрации тиовюрцина в плазме крови и экскретах крыс. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии была определена ди-
намика концентраций тиовюрцина в плазме крови и экскретах крыс после однократного внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг. Результаты. Пик концентрации тиовюрцина в плазме крови крыс приходится на 2 ч, что согласуется с данными фармако динамики нового анальгетика, среднее время удерживания вещества в организме достигало 17,15 ч после введения. Возможно наличие фармакологически активных метаболитов.
♦ Ключевые слова: фармакокинетика; масс-спек-трометрия; тиовюрцин; доклинические исследования.
SOME PHARMACOKINETICS ASPECTS OF NEW ANALGETICS FROM HEXAAZAISIOWURITSITANE CLASS IN RATS
© K.A. Lopatina 1, O.S. Bryushinina 1, R.V. Gurto 1, S.G. Krylova 1, Yu.G. Zuzkova 1, D.A. Kulagina 2, E.A. Safonova 1, E.P. Zueva 1, S.V. Sysolyatin 2
1 Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia;
2 Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies of the Siberian Branch of the RAS, Biysk, Russia
For citation: Lopatina KA, Bryushinina OS, Gurto RV, et al. Some pharmacokinetics aspects of new analgetics from hexaazaisiowuritsitane class in rats. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2019;17(4):51-56. https://doi.org/10.17816/RCF17451-56
Received: 07.10.2019 Revised: 12.11.2019 Accepted: 18.12.2019
An important stage in the preclinical study of a new drug is the study of its pharmacokinetics: absorption, distribution, metabolism, and excretion of the drug compound. The purpose of this study was to study the pharmacokinetics in healthy animals of a new analgesic based on hexaazaiso-wurtzitane (thiowurtzine). Materials and methods. A technique for determining the concentration of thiowurtzine in the blood plasma and rat excreta has been developed and validated. Using high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry, concentrations of thiowurt-
zine in plasma and rat excreta were determined after a single intragastric dose of 100 mg/kg. Results. The peak concentration of thiowurtzine in the blood plasma of rats accounts for 2 hours, which is consistent with the pharmacodynamic data of the analgesic, the average retention time of the substance in the body reached 17.15 h after administration. Thiowurtzine is believed to be actively metabolized.
♦ Keywords: pharmacokinetics; mass spectrometry; thio-wurtzine; preclinical studies.
ВВЕДЕНИЕ
Важным этапом доклинического исследования нового лекарственного средства является из-
учение его фармакокинетики [1, 2]. Всасывание, распределение, метаболизм и выведение лекарственного соединения — взаимосвязанные процессы. Все они подвержены влиянию множества
OriginaL studies
факторов: скорость всасывания зависит от физико-химических свойств, лекарственной формы препарата, концентрации действующего вещества, рН среды, в которой происходит растворение вещества, перистальтики кишечника и состояния площади поверхности всасывания [3]. На показатели распределения и биотрансформации лекарственного препарата влияют пол, возраст, соматическое состояние организма, а также состояние ферментативных систем организма, что часто обусловлено индивидуальными различиями. Высокоэффективная жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия являются приоритетными инструментами при постановке методик, позволяющих проводить количественную оценку целевых молекул в сложных биологических матрицах [4-6].
Целью настоящего исследования было изучение у крыс фармакокинетики нового анальгетика, синтезированного в Институте проблем химико-энергетических технологий СО РАН (г. Бийск) на основе гексаазаизовюрцитана. К настоящему времени закончен этап испытаний на животных. Новый препарат на основе гексаазаизовюрцитана будет рекомендован для лечения болевого синдрома различной этиологии, благодаря своему мощному анальгетическому потенциалу и низкому профилю токсичности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сведения об исследуемом веществе. Инновационная молекула представляет собой полиазотистое полициклическое соединение каркасного строения — 4-[(3,4-дибромтиофен)-2-карбонил]-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло [5.5.0.0311.059]додекан) (далее — тиовюрцин, ТУО) (рис. 1). Получено впервые ацилированием про-мышленно доступного 2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5.5.0.0311.05,9] додекана хлорангидридом 3,4-дибромтиофенкар-боновой кислоты. Процесс проводили в среде аце-тонитрила при температуре кипения реакционной массы.
Дизайн исследования. Эксперименты выполнены на половозрелых аутбредных крысах-самцах (возраст 3 мес., масса тела 270-330 г), стока Бй разводки отдела экспериментальных биологиче-
ских моделей Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга (НИИФиРМ) Томского НИМЦ РАН.
В рамках выполненного исследования были изучены процессы: всасывания — оценена динамика концентраций тиовюрцина в плазме крови крыс после однократного внутрижелудочного введения; экскреции — исследована динамика выведения тиовюрцина с мочой и калом у крыс.
Тиовюрцин вводили крысам однократно внутри-желудочно в дозе 100 мг/кг на 1 % крахмальном геле. В качестве основного биоматериала была использована кровь. Для оценки экскреции препарата животным натощак, однократно внутрижелудочно вводили тиовюрцин в дозе 100 мг/кг, после чего животных помещали в индивидуальные метаболические клетки с доступом к воде и пище, и в течение 1 сут. был проведен забор экскретов (фекалии и моча) для оценки динамики выведения тиовюрцина и определения приоритетного пути выведения препарата.
Пробы крови у крыс отбирали до введения лекарственного средства и через 20, 40 мин и 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 16 и 24 ч после введения.
Животных, находящихся под наркозом в камере с СО2, декапитировали и проводили забор органов и крови. Образцы крови собирали в гепаринизирован-ные пробирки и центрифугировали при 1600 g в течение 10 мин. Отобранная плазма помещалась в пластиковые пробирки и хранилась при температуре -24 °C до проведения аналитического этапа работы.
Методика количественного определения тиовюрцина. Методика количественного определения тиовюрцина в плазме крови и экскретах была впервые разработана и валидирована перед исследованием в лаборатории молекулярной и клинической физиологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томский НИМЦ). Количественное определение тиовюрци-на в биологических образцах животных проводили чувствительным, избирательным и точным хромато-масс-спектрометрическим методом. Исследование было проведено с использованием жидкостного хроматографа Prominence (Shimadzu) и гибридного масс-спектрометрического детектора AB Sciex 3200 Qtrap (AB Sciex, США), оснащенного линейной ловушкой. Источник ионизации — электроспрей Turbo V (ESI). Обработку хроматографических данных проводили с помощью программного обеспечения Analyst.
Рис. 1. Синтез 4-[(3,4-дибромтиофен)-2-карбонил]-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5.5.0.03,11.05'9]-додекана (тиовюрцина)
52
i reviews on clinical PharmacoLOGy and DruG ThErapy
2019/17/4
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Условия хроматографического анализа и масс-спектрометрического детектирования были оптимизированы для обеспечения максимальной чувствительности детектора в режиме мониторинга множественных реакций (Multiple Reaction Monitoring, MRM) с использованием источника ионизации распылением в электрическом поле (ESI+). Давление газа-распылителя азота составило (GS1) — 35 psi, турбогаза для пробоввода TurboIonSpray (GS2) — 45 psi; температура турбогаза — 525 °C; напряжение на иглораспылителе — 4,75 кВ; газовая завеса — 10 psi. Для детектирования использовали MRM-переходы: TVC — 604,8/268,8 (DP = 60, EP = 5,80, CE = 60, CEP = 27,57, CXP = 2,30, CAD = high).
Масс-спектр аналита тиовюрцина представлен на рис. 2.
Хроматографическое разделение аналита проводили на колонке ProntoSIL 120-3-С18 (ЗАО «Эко-Нова», Россия) 85 % элюентом B. Скорость потока была установлена 0,25 мл/мин, температура колонки 40 °C, в качестве элюента А использовали 5 mM формиат аммония (pH = 2,8), элюента В — ацетонитрил. Перед хроматографическим анализом подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане и фильтровали. Хроматографический анализ проводили в градиентном режиме, объем инжекции аналита — 5 мкл. Среднее время удерживания тиовюрцина составляло 1,60 ± 0,02 мин. Экспериментальные значения концентрации лекарственного средства в плазме крови рассчитывали после однократного введения тиовюрцина в динамике.
дается 2 фазы снижения концентрации вещества. В первой фазе (а-фазе) происходит резкое снижение, по-видимому, за счет быстрого распределения его в ткани органов (фаза распределения), полупериод распределения составляет 51 мин. Вторая фаза характеризуется более медленным снижением концентрации тиовюрцина и описывает кинетику выведения вещества из организма (фаза элиминации), полупериод элиминации — 16,3 ч. Значение среднего времени удерживания (17,15 ч) свидетельствует о медленном выведении тиовюрцина из организма.
Усредненный фармакокинетический профиль лекарственного средства в плазме крови крыс после однократного внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг представлен на рис. 3.
Оценка концентрации тиовюрцина в моче и кале крыс. Для оценки процесса элиминации лекарственного соединения из организма крыс использовали методику изучения кинетики выведения с мочой и калом. Концентрации тиовюрцина в моче и кале крыс на протяжении 1 сут после однократного введения препарата в дозе 100 мг/кг, суточный объем полученного экскрета на протяжении изучаемого периода и процент дозы представлены в табл. 1 и 2.
Результаты исследования экскреции тиовюрцина у крыс после внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг показали, что основная часть вещества выводится в течение первых суток: с калом — в среднем 3,37 % от введенной дозы, а с мочой — в среднем 0,01 % от введенной дозы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Динамика концентраций тиовюрцина в плазме крови крыс. Результаты исследования показали, что вещество достигает максимальной концентрации в течение 1,8 ч после введения. Затем наблю-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенные фармакокинети-ческие исследования показали, что максимальные значения концентрации тиовюрцина в плазме крови крыс достигаются через 2 ч после введения
1,7е5 1,665 1,5е5 1,4е5 1,3е5 1,2е5 1,1е5 1,0е5 9,0е4 8,0е4 7,0е4 6,0е4 5,0е4 4,0е4 3,0е4 2,0е4 1,0е4 0,0
269,0
135,2
96,0
69,2
84,0 6^,8
59,0 53,8
86,8 91,
108,0
126,2
100
0121,
160,0
162,0
38,2 150,0
Lu
177,2
236,2
218,2
194,4 182,0 203,0 235,
ji_J,
254,6
278,2
351,8
85,4 295,2
I '*. ..
334,0
341,
364,0
403,0
423,0 444,8 462,0
fu ■ i. ■<'
504,2 520,6
-J—!_
562,8
605,0
100
150
200
250
300 350 Масса, Да
400
450
500
550
600
Рис. 2. Масс-спектр тиовюрцина
50
препарата в терапевтической дозе 100 мг/кг, что согласуется с данными фармакодинамики нового анальгетика: максимум анальгетической активности наблюдался в экспериментах «Горячая пластина», начиная с 1 ч после применения тиовюрцина, и длился до 4 ч наблюдения. В тесте механической соматической боли при раздражении основания хвоста крыс по Гаффнеру анальгетический эффект длился до 16-17 ч, что соответствует фар-макокинетическим данным, полученным в настоящем исследовании: среднее время удерживания вещества в организме достигало 17,15 ч после введения.
Низкое количество тиовюрцина, выделенного в неизменном виде, свидетельствует об активном процессе биотрансформации, возможно наличие фармакологически активных метаболитов.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации
■ Таблица 1. Результаты оценки количества тиовюрцина в моче крыс после однократного внутрижелудочно-го введения в дозе 100 мг/кг
№ пробы Концентрация, нг/мл Суточный объем мочи крыс, мл Количество, мг Процент дозы
1 390,7 8,5 0,0033 0,011
2 452,9 3,6 0,0016 0,005
3 195,6 11,2 0,0022 0,007
4 429,1 6,4 0,0027 0,009
5 224,2 6,0 0,0013 0,004
6 677,5 8,7 0,0059 0,020
M 395,0 7,4 0,0029 0,010
± m 195,7 2,9 0,0018 0,006
CV, % 49,6 39,0 63,8911 63,891
■ Таблица 2. Результаты оценки количества тиовюрцина в кале крыс после однократного внутрижелудочно-го введения в дозе 100 мг/кг
№ пробы Концентрация, нг/г Суточный объем кала крыс, г Количество, мг Процент дозы
1 151257,0 4,0 0,61 2,02
2 202125,9 3,6 0,74 2,45
3 164212,9 3,0 0,49 1,64
4 379210,8 5,7 2,17 7,22
5 286761,6 5,4 1,54 5,13
6 215931,5 2,4 0,53 1,75
M 233250,0 4,0 1,01 3,37
± m 84938,6 1,4 0,73 2,45
CV, % 36,4 35,9 72,67 72,67
Type = 100
Время, ч
Рис. 3. Усредненный фармакокинетический профиль тиовюрцина в плазме крови крыс после однократного внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», госконтракт от 15 августа 2017 г. № 14.N08.11.0179 «Доклинические исследования лекарственного средства на основе производных гексаазаизовюр-цитана для терапии болевого синдрома различной этиологии».
ЛИТЕРАТУРА
1. Мирошниченко И.И. Основы фармакокинетики. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. - 192 с. [Miroshnichenko II. Osnovy farmakokinetiki. Moscow: GEOTAR-MED; 2002. 192 p. (In Russ.)]
2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А.Н. Миронова. Ч. 1. - М.: Гриф и К, 2013. - 944 с. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv. Ed. by A.N. Mironov. Part 1. Moscow: Grief and K; 2013. 944 p. (In Russ.)]
♦ Информация об авторах
Ксения Александровна Лопатина — канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории онкофармакологии. ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск. E-mail: k.lopatina@pharmso.ru.
Ольга Сергеевна Брюшинина — канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной и клинической физиологии. ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск. E-mail: k.lopatina@pharmso.ru.
Роман Владимирович Гурто — канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной и клинической физиологии. ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск. E-mail: roman.gurto@pharmso.ru.
Светлана Геннадьевна Крылова — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории онкофармакологии. ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск. E-mail: krylova5935@gmail.com.
Юлия Геннадьевна Зюзькова — младший научный сотрудник лаборатории молекулярной и клинической физиологии. ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск. E-mail: roman.gurto@pharmso.ru.
Дарья Александровна Кулагина — кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории медицинской химии. ФГБУН «Институт проблем химико-энергетических технологий» Сибирского отделения РАН, Бийск. E-mail: imbiri@rambler.ru.
Елена Андреевна Сафонова — канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории онкофармакологии. ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск. E-mail: safonova_7@mail.ru.
3. Сергиенко В.И., Джеллифф Р., Бондарева И.Б. Прикладная фармакокинетика: основные положения и клиническое применение. - М.: Издательство РАМН, 2003. -208 с. [Sergienko VI, Jellyff R, Bondareva IB. Prikladnaya farmakokinetika: osnovnye polozheniya i klinicheskoe prim-enenie. Moscow: Izdatel'stvo RAMN; 2003. 208 p. (In Russ.)]
4. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Карки-щенко В.Н. Фармакокинетика. - Ростов-на-Дону: Феникс, 2001. - 384 с. [Karkishchenko NN, Khoron'ko VV, Sergeeva SA, Karkishchenko VN. Farmakokinetika. Ros-tov-na-Donu: Phoenix; 2001. 384 p. (In Russ.)]
5. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. - 493 с. [Lebedev AT. Mass-spektrometriya v organicheskoy khi-mii. Moscow: BINOM. Laboratoriya znaniy; 2003. 493 p. (In Russ.)]
6. Niessen W.M.A. MS-MS and MSn. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. 3rd ed. Ed. by J.C. Lin-don, G.E. Tranter, D. Koppenaal. Academic Press; 2016. P. 936-941.
♦ Information about the authors
Ksenya A. Lopatina — PhD, Senior Researcher of Oncopharma-cology Laboratory. Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia. E-mail: k.lopatina@ pharmso.ru.
Olga S. Bryushinina — PhD, Researcher of Molecular and Clinical Physiology Laboratory. Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia. E-mail: k.lopatina@ pharmso.ru.
Roman V. Gurto — PhD, Leading Researcher of Molecular and Clinical Physiology Laboratory. Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia. E-mail: roman. gurto@pharmso.ru.
Svetlana G. Krylova — PhD, MD, Leading Researcher of Onco-pharmacology Laboratory. Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia. E-mail: kry-lova5935@gmail.com.
Yulia G. Zuzkova — Junior Researcher of Molecular and Clinical Physiology Laboratory. Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia. E-mail: roman.gurto@pharmso.ru.
Darya A. Kulagina — PhD, Researcher of Medical Chemistry Laboratory. Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies of the Siberian Branch of the RAS, Biysk, Russia. E-mail: imbiri@rambler.ru.
Elena A. Safonova — PhD, Researcher of Oncopharmacology Laboratory. Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia. E-mail: safonova_7@mail.ru.
♦ Информация об авторах
Елена Петровна Зуева — д-р биол. наук, заведующая лабораторией онкофармакологии. ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томск. Е-таН: zep0929@mail.ru.
Сергей Викторович Сысолятин — д-р хим. наук, директор. ФГБУН «Институт проблем химико-энергетических технологий» Сибирского отделения РАН, Бийск. Е-таН: imbiri@rambler.ru.
♦ Information about the authors
Elena P. Zueva — PhD, MD, Head of Oncopharmacology Laboratory. Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk, Russia. E-mail: zep0929@mail.ru.
Sergey V. Sysolyatin — PhD, MD, Head. Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies of the Siberian Branch of the RAS, Biysk, Russia. E-mail: imbiri@rambler.ru.
